溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的影響

呂李飛 ，魏孝欽 ，王夢(mèng)歌 ，張賢儒 ，馬曉貞 ，多杰卓瑪 ，賈守寧 ，祁永福

1.青海大學(xué)，青海省糖脂代謝疾病防控中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2.青海省中醫(yī)院，青海 西寧 810012

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是多種心臟疾病發(fā)展的終末階段，具有較高的發(fā)病率和病死率，目前常規(guī)西藥如沙庫(kù)巴曲纈沙坦鈉片、維利西呱，雖可穩(wěn)定病情，但多數(shù)患者預(yù)后仍未達(dá)預(yù)期[1]。中醫(yī)治療慢性心系疾病經(jīng)驗(yàn)頗豐，根據(jù)臨床主要癥狀，CHF屬中醫(yī)學(xué)“心水”“怔忡”范疇，其基本病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為心之氣血陰陽(yáng)虛衰，臟腑功能失調(diào)，標(biāo)實(shí)為痰濁、水飲、氣滯、血瘀[2]。心氣虛是病理基礎(chǔ)，血瘀是中樞環(huán)節(jié)，水濕和痰飲是主要病理產(chǎn)物?；诖?，治當(dāng)溫陽(yáng)益氣活血。溫陽(yáng)益氣活血方由青海省中醫(yī)院多位名老中醫(yī)專家據(jù)芪附湯、桃仁紅花煎等古方化裁擬定，全方有溫陽(yáng)益氣、活血化瘀之功。前期研究顯示，溫陽(yáng)益氣活血方可通過Toll樣受體/核因子κB信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路及Th17細(xì)胞分化等途徑干預(yù)CHF，關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有SMAD7、MYC、PCNA等[3]。

Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶主要位于心肌細(xì)胞膜和線粒體膜上，二者表達(dá)水平可反映心肌細(xì)胞功能的完整性。當(dāng)CHF發(fā)生時(shí)，心肌纖維過度收縮，打破心肌細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原狀態(tài)，引發(fā)物質(zhì)與能量代謝異常，最終造成機(jī)體穩(wěn)態(tài)失衡。因此，整合ATP酶表達(dá)與CHF病理變化的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，能發(fā)現(xiàn)并闡明CHF發(fā)病的能量代謝機(jī)制。本研究以CHF模型大鼠為研究對(duì)象，觀察溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶表達(dá)的影響，從能量代謝角度闡釋其治療CHF的作用機(jī)制，為中醫(yī)治療CHF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，6周齡，體質(zhì)量（200±20）g，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（陜）2018-001。飼養(yǎng)于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（青）2020-0001，溫度23～25 ℃，濕度55%～70%，12 h光暗循環(huán)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)青海省中醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（qhszyy1103201901）。

1.2 藥物

溫陽(yáng)益氣活血方（人參15 g，黃芪20 g，桂枝10 g，附子10 g，熟地黃12 g，當(dāng)歸 10g，白芍15 g，赤芍16 g，川芎10 g，桃仁10 g，紅花10 g），飲片顆粒購(gòu)于青海省中醫(yī)院，按原藥材用量計(jì)算后將顆?；靹颍尤爰儍羲芙?，配制成濃度分別為0.81、0.405、0.202 5 g/mL混懸液。鹽酸異丙腎上腺素，上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)S31064?？ㄍ衅绽?，山西津華暉星制藥有限公司，25 mg/片，批號(hào)200120。氫氯噻嗪片，天津力生制藥有限公司，25 mg/片，批號(hào)2005008。螺內(nèi)酯片，國(guó)藥集團(tuán)武漢中聯(lián)四藥藥業(yè)有限公司，20 mg/片，批號(hào)200904。

1.3 主要試劑與儀器

大鼠腦鈉肽（BNP）ELISA試劑盒（貨號(hào)E-ELR0126c）、Na+-K+-ATP酶比色法試劑盒（貨號(hào)E-BCK539-M）、Ca2+-ATP酶比色法試劑盒（貨號(hào)E-BCK212-M），武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；Servicebio?RT第一鏈cDNA合成試劑盒（貨號(hào)G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（High ROX）（貨號(hào)G3322）、Ca2+-ATP酶兔多克隆抗體（貨號(hào)GB112371）、Na+-K+-ATP酶兔多克隆抗體（貨號(hào)GB11400-1），武漢賽維爾生物科技有限公司；異氟烷（貨號(hào)R510-22），瑞沃德生命科技有限公司。

Thermomixer C恒溫混勻儀，德國(guó)艾本德股份公司；QL901漩渦振蕩器，海門其林貝爾有限公司；ECLIPSE Ci-L正置白光拍照顯微鏡、E100顯微鏡、Nikon DS-U3成像系統(tǒng)，日本尼康公司；Pannoramic DESK全景切片掃描儀，匈牙利3DHISTECH公司；ZS3 Exp型小動(dòng)物彩色多普勒超聲儀，中國(guó)邁瑞公司；Illumina HiSeq/MiSeq PE250測(cè)序儀，美國(guó)因美納公司；Chemray 800全自動(dòng)生化分析儀，深圳雷杜生命科技有限公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀、NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，賽默飛科技有限公司；H1650-W臺(tái)式微量高速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Epoch多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；R500IE小動(dòng)物麻醉機(jī)，瑞沃德生命科技有限公司。

1.4 造模

90只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組15只、實(shí)驗(yàn)組75只，實(shí)驗(yàn)組采用4 mg/mL異丙腎上腺素皮下多點(diǎn)注射10 mg/kg誘導(dǎo)CHF模型，空白組注射等量生理鹽水，連續(xù)14 d。造模期間觀察并記錄大鼠一般情況。造模結(jié)束后次日對(duì)所有大鼠行超聲檢測(cè)，檢測(cè)前禁食水12 h，參考文獻(xiàn)[4-5]標(biāo)準(zhǔn)，左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）＜60%表明CHF模型造模成功。

1.5 分組及干預(yù)

剔除死亡及未成模大鼠5只，將70只成模大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組和溫陽(yáng)益氣活血方低、中、高劑量組（中藥低、中、高劑量組），每組14只。參照人與動(dòng)物體表面積折算的等效劑量換算大鼠給藥量，中藥高、中、低劑量組分別予溫陽(yáng)益氣活血方混懸液8.1、4.05、2.025 g/kg灌胃（相當(dāng)于臨床成人用藥劑量的2、1、1/2倍），西藥組予卡托普利片5.3 mg/kg+氫氯噻嗪片2.6 mg/kg+螺內(nèi)酯片2.6 mg/kg灌胃，空白組和模型組予等量生理鹽水，灌胃體積10 mL/kg，每日1次，連續(xù)6周。

1.6 一般狀況觀察

實(shí)驗(yàn)過程中觀察大鼠毛色、精神及飲食情況。

不一會(huì)兒周所長(zhǎng)來到，陪著秦明月在廣場(chǎng)轉(zhuǎn)了一圈，秦明月說：“到達(dá)火車站共有三種方式，一是搭乘私家車或者租車；二是打的；三是乘公交車從廣場(chǎng)東面步行過來?！?/p>

1.7 心臟超聲檢查

造模及給藥結(jié)束后，脫毛膏去除大鼠左胸部毛發(fā)，異氟烷麻醉，彩色多普勒超聲儀測(cè)量LVEF、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD），連續(xù)測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值，計(jì)算左室短軸縮短率（LVFS）。LVFS（%）=（LVEDD-LVESD）÷LVEDD×100%。實(shí)驗(yàn)由同一名影像醫(yī)師完成，操作過程中遵循盲法原則。

1.8 血清腦鈉肽檢測(cè)

末次給藥后禁食不禁水12 h，次日20%烏來糖0.8 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹主動(dòng)脈采血，常溫靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，取上層血清，按ELISA試劑盒操作步驟檢測(cè)BNP含量。

1.9 心臟質(zhì)量指數(shù)計(jì)算

末次給藥前稱量大鼠體質(zhì)量，腹主動(dòng)脈采血后分離大鼠心臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗，無菌紗布吸干水分，稱量心臟質(zhì)量，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)（HMI，心臟質(zhì)量/體質(zhì)量）。

1.10 HE染色

取心肌組織，生理鹽水沖洗，置于4%多聚甲醛溶液中固定，修剪，脫水，浸蠟，包埋，切片，行HE染色，封片，顯微鏡下觀察心肌組織病理改變。

1.11 Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性檢測(cè)

取心肌組織，按質(zhì)量/體積比為1∶9加入預(yù)冷生理鹽水，充分勻漿，調(diào)整樣本檢測(cè)濃度，采用比色法試劑盒檢測(cè)心肌Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

1.12 RT-PCR檢測(cè)

取心肌組織0.1 g，充分剪碎后置于勻漿管，加入Trizol，研磨儀充分研磨，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液，加入250 μL三氯甲烷，顛倒混勻后，常溫靜置3 min，12 000 r/min離心10 min，吸取400 μL上清液置新EP管中，加入0.8倍體積異丙醇混勻，-20 ℃靜置15 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，用75%乙醇洗滌沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀干燥后，加入無酶水15 μL，55 ℃孵育5 min，采用NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度。根據(jù)Servicebio?RT Enzyme Mix試劑盒說明書將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃、15 s→60 ℃、30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.13 免疫組織染色

心臟組織修剪后石蠟包埋，制成3 μm切片，60 ℃烘烤2 h，經(jīng)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ脫蠟及梯度酒精水化，熱修復(fù)抗原，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉后，加Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶一抗（1∶1 000），濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。加入二抗，室溫孵育50 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染3 min，脫水封片。顯微鏡下觀察，以棕黃色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)，采用Aipathwell軟件分析細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.14 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊用校正t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane” s T2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠一般狀況的影響

模型組大鼠扎堆，活動(dòng)少，體質(zhì)量減輕，食少，毛發(fā)凌亂、黃脆易掉，胞瞼下垂，無神呆滯，舌色瘀點(diǎn)，唇黯爪青，陰囊脫出，尿少，超聲備皮前可見頸部青筋暴露，抓捕時(shí)易見甲掉出血，甚則全胸部觸之如石、滿胸積液，以上癥狀與CHF相符[6]。相應(yīng)藥物干預(yù)后，西藥組及中藥各劑量組大鼠一般情況均較模型組減輕，脫毛癥狀緩解，體質(zhì)量、飲食量和活動(dòng)量增加，中藥高劑量組毛色光澤度優(yōu)于其他給藥組。

2.2 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心臟超聲指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各劑量組大鼠LVEF、LVFS顯著升高（P＜0.01）；與西藥組比較，中藥高劑量組大鼠LVEF、LVFS顯著升高（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較（，%）

表2 各組大鼠心臟超聲指標(biāo)比較（，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，▲P＜0.05

LVFS 65.25±3.05 36.82±2.65**45.19±3.18##45.84±3.33##45.92±5.66##48.86±4.39##▲組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)11 12 10 7 8 1 1 LVEF 88.28±3.35 51.28±5.81**72.01±5.02##75.43±7.60##75.76±6.71##77.79±6.14##▲

2.3 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠血清腦鈉肽含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清BNP含量顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥高劑量組大鼠血清BNP含量顯著減少（P＜0.05）；與中藥高劑量組比較，中藥低、中劑量組BNP含量顯著增加（P＜0.01）。中藥高劑量組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠血清BNP含量比較（，pg/mL）

表3 各組大鼠血清BNP含量比較（，pg/mL）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與中藥高劑量組比較，▲▲P＜0.01

BNP 71.49± 9.86 452.61±90.22**174.76±14.24#298.84±20.68▲▲281.64±19.02▲▲167.87±12.33#組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)5 5 5 5 5 5

2.4 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組大鼠HMI顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組及中藥各劑量組大鼠HMI顯著降低（P＜0.01），中藥高劑量組大鼠HMI降低最明顯（P＜0.01）；與西藥組比較，中藥低、中劑量組大鼠HMI顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠HMI比較（，mg/g）

表4 各組大鼠HMI比較（，mg/g）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與西藥組比較，△△P＜0.01；與中藥高劑量組比較，▲▲P＜0.01

HMI 2.26±0.12 2.84±0.09**2.37±0.03##2.72±0.10##△△▲▲2.65±0.07##△△▲▲2.36±0.03##組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)11 12 10 7 8 1 1

2.5 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心肌組織病理變化的影響

空白組大鼠心肌纖維結(jié)構(gòu)正常、分界清晰、排列規(guī)則，間質(zhì)未見明顯異常，無炎癥浸潤(rùn)；模型組大鼠心肌組織大量纖維水腫，胞質(zhì)疏松淡染，少量心肌細(xì)胞空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)可見微小圓形空泡，組織邊緣可見心肌纖維溶解，被增生的結(jié)締組織取代，伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；西藥組可見少量心肌細(xì)胞空泡變性，胞質(zhì)內(nèi)有微小圓形空泡，心肌細(xì)胞腫脹，胞質(zhì)疏松淡染，間質(zhì)伴有少量結(jié)締組織增生，并可見少量血管淤血擴(kuò)張；中藥各劑量組大鼠心肌細(xì)胞空泡變性減少，胞質(zhì)內(nèi)可見微小圓形空泡，纖維水腫、胞質(zhì)疏松、炎癥浸潤(rùn)及纖維溶解程度較模型組有所改善，以中藥高劑量組改善最明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織形態(tài)（HE染色，×200）

2.6 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各劑量組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性顯著升高（P＜0.01）。見表5。

表5 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性比較（）

表5 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

組別Ca2+-ATP酶/（U/kg）只數(shù)Na+-K+-ATP酶/（μmol/mg）空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組74.32±0.84 41.47±2.68**60.68±1.93##54.00±3.16##55.95±3.01##60.96±3.83##3 3 3 3 3 3 72.09±1.28 43.70±4.60**60.40±2.55##54.28±2.51##57.90±5.03##62.91±3.37##

2.7 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥中、高劑量組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見表6。

表6 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達(dá)比較（）

表6 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶mRNA表達(dá)比較（）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

Ca2+-ATP酶1.32±0.04 0.59±0.10**1.04±0.07##0.74±0.08 0.82±0.05##1.06±0.15##組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 Na+-K+-ATP酶1.29±0.12 0.51±0.11**1.08±0.09##0.78±0.02##0.85±0.03##1.12±0.12##

2.8 溫陽(yáng)益氣活血方對(duì)模型大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽(yáng)性表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥各劑量組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽(yáng)性表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。見表7、圖2、圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色）

圖3 各組大鼠心肌組織Ca2+-ATP酶陽(yáng)性表達(dá)（免疫組化染色）

表7 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽(yáng)性表達(dá)比較（，%）

表7 各組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶陽(yáng)性表達(dá)比較（，%）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

Ca2+-ATP酶0.96±0.03 0.37±0.07**0.76±0.08##0.54±0.06##0.65±0.02##0.81±0.06##組別空白組模型組西藥組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組只數(shù)3 3 3 3 3 3 Na+-K+-ATP酶0.89±0.04 0.30±0.03**0.69±0.04##0.49±0.05##0.63±0.04##0.75±0.03##

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用皮下注射異丙腎上腺素制備CHF模型，可以模擬CHF神經(jīng)過度激活，造模方法簡(jiǎn)便價(jià)廉，但由于異丙腎上腺素注射后對(duì)心臟產(chǎn)生嚴(yán)重的毒性和強(qiáng)興奮性，且對(duì)心肌損害是一個(gè)慢性、蓄積性過程，因此可見造模大鼠精神萎靡、少倦懶動(dòng)、進(jìn)食減少、皮毛枯槁等癥狀，2周后開始出現(xiàn)死亡。與空白組比較，模型組大鼠心功能（LVEF、LVFS）顯著下降，血清BNP含量顯著增加，表明CHF模型造模成功。

BNP主要由心室細(xì)胞分泌，病理狀態(tài)下，其代償分泌增加，因此可作為評(píng)價(jià)心臟負(fù)荷的主要指標(biāo)[7]。HMI能相對(duì)準(zhǔn)確地反映左心室功能不全程度，CHF發(fā)生時(shí)，左室出現(xiàn)心肌肥厚，使心臟顯著擴(kuò)大。本研究結(jié)果顯示，各給藥組大鼠BNP、HMI較模型組減少，表明溫陽(yáng)益氣活血方能改善模型大鼠的心功能不全癥狀。

Ca2+-ATP酶又稱鈣泵，約2/3的Ca2+運(yùn)轉(zhuǎn)由心肌肌漿網(wǎng)鈣泵（SERCA）主導(dǎo)并參與[8]，SERCA功能正常對(duì)維持心肌活動(dòng)穩(wěn)定有重要作用。Na+-K+-ATP酶又稱鈉泵或Na+-K+-依賴式ATP酶，是一種廣泛分布于細(xì)胞膜上的特殊糖蛋白，對(duì)心肌細(xì)胞的生理穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。2種ATP酶能完成心肌正常的Na+-K+、Na+-Ca2+交換，避免Ca2+超載和心肌舒張遲緩的發(fā)生，在一定程度上抑制神經(jīng)-體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，減輕心臟負(fù)荷，穩(wěn)定心率及心肌收縮[9-10]。但CHF由代償期轉(zhuǎn)向失代償期時(shí)，會(huì)伴隨心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)、心肌細(xì)胞非程序性死亡、心室重構(gòu)等，這一轉(zhuǎn)折期的關(guān)鍵機(jī)制可由氧化應(yīng)激介導(dǎo)，心肌病理?yè)p傷后能釋放大量ATP，其中一部分可用于激活氧化應(yīng)激反應(yīng)，加速促炎因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物、炎性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，而另一部分能觸發(fā)NLRP3炎癥小體，介導(dǎo)心肌細(xì)胞焦亡[11-12]。當(dāng)ATP酶表達(dá)受阻時(shí)，相應(yīng)的酶活性下降，進(jìn)而響應(yīng)細(xì)胞膜內(nèi)的高Na+反應(yīng)，迫使Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致膜電位失衡，誘導(dǎo)心肌Ca2+超載損傷。線粒體能量代謝紊亂是CHF心肌肥厚的重要機(jī)制，心肌損傷后，線粒體產(chǎn)能降低及氧化反應(yīng)失衡，誘導(dǎo)Ca2+超負(fù)荷和活性氧生成增加，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能不全，引發(fā)心肌結(jié)構(gòu)和能量代謝重構(gòu)[13-16]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CHF心功能不全涉及能量代謝失衡，模型組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，mRNA和蛋白表達(dá)也降低，經(jīng)溫陽(yáng)益氣活血方干預(yù)后，各中藥組大鼠心肌組織Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性、mRNA和蛋白表達(dá)均有不同程度升高，推測(cè)可能是溫陽(yáng)益氣活血方治療CHF的機(jī)制之一。

溫陽(yáng)益氣活血方以桂枝、附子為君，附子溫走三焦，既能引火歸元，又助桂枝入血分活血通滯；人參、黃芪、熟地黃為臣，人參不僅善培補(bǔ)元?dú)?，且能扶正祛邪，配伍黃芪共治氣虛之證，且黃芪又可養(yǎng)血利水行滯，助桂枝、附子益氣化瘀，熟地黃填補(bǔ)精髓，為助陽(yáng)化氣提供物質(zhì)基礎(chǔ)；當(dāng)歸補(bǔ)血行血，白芍養(yǎng)血柔肝，使肝氣調(diào)暢，且兼酸甘化陰血之性，川芎活血行氣，氣行則血行，同白芍相配，無行傷耗血之虞，三藥共為佐藥；桃仁、紅花、赤芍為使，桃仁性平，行血卻不過極，同時(shí)佐助當(dāng)歸行潤(rùn)腸通便之功，紅花、赤芍溫涼適宜，互相制約，共奏活血之效。

綜上所述，溫陽(yáng)益氣活血方能改善CHF心功能不全，其機(jī)制與增強(qiáng)Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，上調(diào)其mRNA及蛋白表達(dá)，改善CHF能量代謝失調(diào)有關(guān)。后續(xù)課題組將從能量代謝角度進(jìn)一步探究CHF的發(fā)病機(jī)制，篩選溫陽(yáng)益氣活血方干預(yù)CHF的有效作用靶點(diǎn)，為臨床CHF療效評(píng)估及中醫(yī)診治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。