兜唇石斛發(fā)酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr和Asp-Tyr-Asp-Asp對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的抗炎作用

梁楚容，王琴，肖更生，馬路凱,2，吳暉，肖建波，劉袆帆*

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院輕工食品學(xué)院，廣東省嶺南特色食品科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510225）（2.西藏農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與食品研究所，西藏拉薩 850000）（3.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510640）（4.西班牙維戈大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,西班牙加利西亞自治區(qū) 36310）

炎癥是各種致炎因子入侵時(shí)機(jī)體和受損細(xì)胞的自我保護(hù)反應(yīng)，炎癥在機(jī)體內(nèi)具有雙重作用，適度的炎癥反應(yīng)有利于機(jī)體自我調(diào)控，但過(guò)度的炎癥反應(yīng)會(huì)引起機(jī)體的不良反應(yīng)并且會(huì)引發(fā)其他疾病的產(chǎn)生[1]。研究表明多肽具有抗氧化、抗炎癥及免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性[2]。多肽主要由2~20個(gè)氨基酸以不同的排列順序組成，因氨基酸的種類(lèi)、數(shù)量和排列順序等存在差異，從而使得不同多肽的生理活性存在很大的差異[3]。梁秋芳[4]發(fā)現(xiàn)玉米蛋白酶解制備生物活性肽具有抗氧化活性并對(duì)結(jié)腸炎具有良好的抗炎效果，而且在血管內(nèi)皮細(xì)胞模型具有良好的抗炎活性。武文佳[5]利用小麥胚芽蛋白中提取得到具有良好免疫調(diào)節(jié)功能的活性肽，經(jīng)凝膠層析后得到的多肽組分可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞促炎因子（NO、IL-6和TNF-α）的分泌量，具有抗炎的效果。Ssa等[6]首次報(bào)道了體外胃腸道消化釋放的發(fā)芽莧菜活性肽，發(fā)現(xiàn)其中抗氧化活性最高的分解組分對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞具有較高的抗炎作用，也可稱為抗炎肽。可見(jiàn)，從植物中提取得到的活性肽段具有一定的研究?jī)r(jià)值。目前對(duì)兜唇石斛這類(lèi)藥食同源植物的研究較少，對(duì)兜唇石斛中發(fā)酵多肽的報(bào)道就更少了。

兜唇石斛（Dendrobium aphyllum），為蘭科石斛屬附生植物，是藥用范圍較廣的中藥[7]。劉袆帆[8]選用一種乳酸桿菌對(duì)兜唇石斛進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，選取其中活性最強(qiáng)小于1 ku的多糖組分，經(jīng)DEAE純化后得到一個(gè)肽段組分，后經(jīng) LC-TOF/MS-MS分析發(fā)現(xiàn)組成的肽分子序列含有：Asp-Asp-Asp-Tyr (DDDY)、Asp-Asp-Tyr-Asp (DYDD)、Met-Ala-Lys (MAK)等。發(fā)酵多肽DDDY和DYDD等具有天然可靠、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)點(diǎn)，本課題組前期對(duì)這些多肽分子做了大量的研究，Liu等[9]通過(guò)量子化學(xué)理論計(jì)算，發(fā)現(xiàn) DYDD上的O58-H59和DDDY上的N10-H12為抗氧化活性位點(diǎn)，對(duì)AAPH誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外起到保護(hù)作用，通過(guò)對(duì)自由基進(jìn)行直接清除，而不是激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路，從另一個(gè)角度來(lái)解釋細(xì)胞抗氧化機(jī)制。劉映君等[10]對(duì)其中一條肽MAK的抗菌機(jī)理進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)MAK可以抑制銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)，起到抑菌的作用。另外 Zhuang等[11]利用代謝組和轉(zhuǎn)錄組結(jié)合分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)DDDY對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌作用與膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氨基酸代謝通路和DDDY的n端c端氨基酸殘基有關(guān)。

基于本課題組前期對(duì)兜唇石斛發(fā)酵多肽在抗氧化和抑菌方面開(kāi)展了深入的研究，為繼續(xù)探明發(fā)酵多肽在其他生理活性的作用，特別是抗炎癥方面的探究?？紤]到DDDY和DYDD具有相似的氨基酸組成，本研究以合成的DDDY和DYDD為研究對(duì)象，采用脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞構(gòu)建體外炎癥模型，以一氧化氮（Nitric Oxide，NO）和細(xì)胞因子白介素（Interleukin，IL）-1β、IL-6、IL-10 和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）為炎癥指標(biāo)，探究DDDY和DYDD的體外抗炎活性，明確發(fā)酵多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥是否有緩解作用，為下一步深入研究?jī)蓷l發(fā)酵多肽的抗炎機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 材料與試劑

發(fā)酵多肽 Asp-Asp-Asp-Tyr（DDDY）和Asp-Tyr-Asp-Asp（DYDD）是本課題組劉袆帆通過(guò)乳酸桿菌固態(tài)發(fā)酵兜唇石斛得到多糖組分，后經(jīng)DEAE純化后得到肽段DPP，最后經(jīng)LC-TOF/MS-MS分析發(fā)現(xiàn)的多肽分子序列。本研究使用的發(fā)酵多肽DDDY、DYDD由上?？贫嚯纳锛夹g(shù)有限公司（中國(guó)上海）按照發(fā)現(xiàn)的分子序列合成；脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）、噻唑藍(lán)（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司（St.Louis, MO, USA）；胎牛血清（FBS）、青霉素和 DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基購(gòu)自 Gibco公司（Carlsbad, CA, USA）。中性紅細(xì)胞染色液，購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司；一氧化氮（Nitric Oxide，NO）試劑盒、白介素（Interleukin，IL）-1β試劑盒、IL-6、IL-10試劑盒、腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）試劑盒，購(gòu)自Mibio酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

海爾超凈工作臺(tái)，上海海爾儀器設(shè)備有限公司；TECAN連續(xù)多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司；臺(tái)式多功能離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞系RAW264.7于DMEM高糖培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和1%雙抗）中培養(yǎng)，37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)密度至80%左右進(jìn)行傳代，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分為空白對(duì)照組、試驗(yàn)組和LPS組。

1.2.2 MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

參考胡夢(mèng)君[12]的方法，稍作修改。以每毫升5×104個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞置于96孔板中，37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液?？瞻讓?duì)照組加入100 μL完全培養(yǎng)液，試驗(yàn)組加入100 μL不同質(zhì)量濃度（12.5、25、50、100、200、400 μg/mL）的發(fā)酵多肽溶液，LPS組加入1 μg/mL的LPS 100 μL作為陽(yáng)性對(duì)照，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后棄去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入0.5%的MTT試劑200 μL，放入37 ℃、φ=5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h，棄去孔內(nèi)液體，每孔加入 DMSO 150 μL，酶標(biāo)儀中低速震蕩15 min使藍(lán)紫色晶體充分溶解，于490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔OD值。根據(jù)OD值和公式（1）計(jì)算每孔細(xì)胞的存活率，以此判斷 LPS和發(fā)酵多肽對(duì)細(xì)胞存活率（A，%）的影響。

式中：

A——細(xì)胞存活率，%；

OD0——空白孔OD值；

OD1——對(duì)照組OD值；

OD2——實(shí)驗(yàn)組OD值。

1.2.3 中性紅吞噬作用評(píng)價(jià)

參照Yu等[13]的方法，稍作修改。細(xì)胞培養(yǎng)方法和處理方法同1.2.2，結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，空白對(duì)照組僅加入150 μL紅細(xì)胞裂解液，其余各組加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.075%中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后棄去中性紅溶液，用PBS清洗2次，加入150 μL紅細(xì)胞裂解液，在540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度值（OD），根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)吞噬率。

式中：

B——相對(duì)吞噬率，%；

OD3——空白組OD值；

OD4——實(shí)驗(yàn)組OD值。

1.2.4 光學(xué)顯微鏡對(duì)RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)觀察

（1）細(xì)胞培養(yǎng)方法：同1.2.2。

（2）細(xì)胞處理分組：PBS清洗過(guò)后96孔板細(xì)胞中，空白對(duì)照組加入100 μL的完全培養(yǎng)液，試驗(yàn)組先加入1 μg/mL的LPS，后加入50 μg/mL的DDDY或50 μg/mL 的DYDD 共100 μL，LPS組加入 100 μL 1 μg/mL 的 LPS。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h。

（3）細(xì)胞觀察：光學(xué)顯微鏡下對(duì)空白對(duì)照組、試驗(yàn)組和LPS組的細(xì)胞進(jìn)行觀察，調(diào)整視野，放大 10倍比較細(xì)胞形態(tài)差異。

1.2.5 對(duì)細(xì)胞信號(hào)物質(zhì)NO分泌的影響

參照胡夢(mèng)君[12]的方法，稍作修改。以每毫升1×106個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞置于24孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液。按照1.2.4的分組方法設(shè)計(jì)空白對(duì)照組、試驗(yàn)組和LPS組，每孔0.5 mL，每組設(shè)置3個(gè)平行孔。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，將孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管，2 500 r/min離心10 min后收集細(xì)胞上清液。采用ELISA試劑盒測(cè)定細(xì)胞上清液的NO水平。

1.2.6 RAW264.7 細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-10分泌量的影響

細(xì)胞培養(yǎng)與處理方法同1.2.5中，培養(yǎng)結(jié)束后吸取培養(yǎng)液，采用ELISA試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10分泌量的水平。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理做3次重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，以 Duncan多邊檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)均值進(jìn)行差異顯著分析（p＜0.05），用Origin 2018對(duì)分析數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響

單核-巨噬細(xì)胞在機(jī)體免疫體系中扮演著非常重要的角色，RAW264.7巨噬細(xì)胞受到脂多糖刺激后構(gòu)建的體外炎癥模型，通過(guò)檢測(cè)其各個(gè)炎癥指標(biāo)的變化，從而探究闡明該藥物的抗炎效果及作用機(jī)制[14]。但是藥物的毒性會(huì)抑制細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響細(xì)胞炎性因子分泌量，會(huì)降低對(duì)藥物抗炎效果判斷的準(zhǔn)確性，MTT法是檢測(cè)細(xì)胞活性常用的方法，結(jié)果可以反映藥物對(duì)細(xì)胞的毒性大小[15]。

因此，本研究首先采用 MTT法考察不同質(zhì)量濃度發(fā)酵多肽（DDDY和DYDD）對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響。圖1反映的是不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD作用于RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞24 h后細(xì)胞的活性情況。從圖可以看出，一定質(zhì)量濃度范圍的DDDY和DYDD能顯著（p＜0.05）促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖，并且1 μg/mL的 LPS處理可以明顯地（p＜0.05）促進(jìn)細(xì)胞的活性。不同質(zhì)量濃度 DDDY溶液對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖影響如圖1a所示，當(dāng)DDDY質(zhì)量濃度在12.5~100 μg/mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的存活率也明顯增加，證明此質(zhì)量濃度范圍增強(qiáng)了細(xì)胞的增殖率。但是當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)100 μg/mL，細(xì)胞的活性下降，最低下降到87.23%。不同質(zhì)量濃度DYDD溶液對(duì)細(xì)胞的增殖作用如圖1b所示，與空白對(duì)照組（細(xì)胞存活率為100.00%）相比，DYDD質(zhì)量濃度在12.5~100 μg/mL范圍內(nèi)細(xì)胞活性維持在 100.40%~126.08%之間；質(zhì)量濃度在 200~400 μg/mL 范圍內(nèi)，細(xì)胞的存活率顯著降低（p＜0.05）。結(jié)果表明，12.5~100 μg/mL的 DDDY和 DYDD對(duì)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞無(wú)顯著毒性，故選取12.5、25、50和100 μg/mL四種質(zhì)量濃度的兩種發(fā)酵多肽分別作為后續(xù)試驗(yàn)的試驗(yàn)組。選取對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性的1 μg/mL作為構(gòu)建炎癥模型的 LPS刺激質(zhì)量濃度，這個(gè) LPS質(zhì)量濃度也是炎癥模型常用的質(zhì)量濃度[16,17]。

圖1 不同質(zhì)量濃度DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞的增殖影響Fig.1 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on proliferation of RAW264.7 cells

2.2 DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響

吞噬能力是巨噬細(xì)胞的一個(gè)重要功能，吞噬能力的增強(qiáng)是巨噬細(xì)胞活化的一種表現(xiàn)[18]，吞噬能力的大小可以反映出細(xì)胞的活性的高低[19]，而中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)就是用來(lái)研究細(xì)胞的吞噬能力的。所以，接下來(lái)本研究采用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)來(lái)研究DDDY和DYDD對(duì)細(xì)胞吞噬率的影響。圖2反映的是不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響，不同質(zhì)量濃度的DDDY對(duì)細(xì)胞的相對(duì)吞噬率如圖2a所示，質(zhì)量濃度在 12.5 μg/mL~100 μg/mL范圍內(nèi)，DDDY能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬作用（p＜0.05），而且隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞的吞噬能力越強(qiáng)，其中100 μg/mL DDDY處理組的細(xì)胞吞噬能力比空白對(duì)照組的上升1.05倍；同時(shí)如圖2b所示不同質(zhì)量濃度DYDD對(duì)細(xì)胞的吞噬能力，與空白對(duì)照組相比，DYDD能顯著提高細(xì)胞的吞噬能力（p＜0.05），四個(gè)質(zhì)量濃度DYDD處理組的細(xì)胞吞噬能力在 1.75%~1.97%之間，無(wú)明顯差異。從圖中也可以看出，1 μg/mL的LPS處理也能提高RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力，此研究結(jié)果與王潔[18]不同質(zhì)量濃度的林蛙骨肉小肽促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的研究相似。結(jié)果表明，12.5、25、50和100 μg/mL四個(gè)質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD和1 μg/mL LPS處理可以激活RAW264.7細(xì)胞，顯著增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬能力。猜測(cè)可能此質(zhì)量濃度的發(fā)酵多肽和LPS可以很好的與RAW264.7細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活化，活力高的巨噬細(xì)胞吞噬能力增強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞的殺菌功能抗炎功能顯著上調(diào)。

圖2 不同質(zhì)量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞吞噬能力的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on phagocytosis of RAW264.7 cells

2.3 RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的光學(xué)顯微鏡觀察

RAW264.7作為一種在微生物學(xué)免疫學(xué)等中常用的試驗(yàn)性細(xì)胞，具有很強(qiáng)的粘附能力和抗原吞噬能力，作為類(lèi)單核細(xì)胞，它的理想形態(tài)應(yīng)該是小圓而透亮，較少偽足和類(lèi)似“觸角”樣的東西[14]。倒置顯微鏡 10倍鏡下觀察不同處理組中RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)，如圖3所示分別為空白對(duì)照組、LPS處理組、DDDY作用組、DYDD作用組?？瞻讓?duì)照組中RAW264.7細(xì)胞形態(tài)正常，呈正常圓形或者橢圓形，細(xì)胞之間緊密接觸生長(zhǎng)（圖3a）；LPS刺激后RAW264.7細(xì)胞出現(xiàn)分支情況，細(xì)胞觸角分明，細(xì)胞間距明顯增大，多數(shù)細(xì)胞沒(méi)有緊密連接在一起（圖3b）；DDDY和DYDD分別與LPS共作用于RAW264.7細(xì)胞后，分支狀細(xì)胞明顯減少，大部分細(xì)胞形態(tài)為圓形或橢圓形，細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)（圖3c和圖3d）。

圖3 不同處理下的RAW264.7細(xì)胞光學(xué)顯微鏡形態(tài)（10×）：空白對(duì)照組（a）、LPS處理組（b）、DDDY+LPS處理組（c）、DYDD+LPS處理組（d）Fig.3 Optical microscope morphology of RAW264.7 cells under different treatments (10×): Blank control group (a), LPS treatment group (b), DDDY+LPS treatment group (c),DYDD+LPS treatment group (d)

根據(jù)顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察，可知，1 μg/mL的LPS可成功誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，使巨噬細(xì)胞形態(tài)有明顯分化，形成了許多偽足，出現(xiàn)不規(guī)則的圓形，這樣與蛋白樣品接觸面積增加，這也可能是LPS增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞的吞噬能力的原因；而50 μg/mL的DDDY和50 μg/mL的DYDD發(fā)酵多肽處理后可有效抑制細(xì)胞分化，改善LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞形態(tài)，緩解細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。猜測(cè)可能是發(fā)酵多肽的加入，占據(jù)巨噬細(xì)胞表面上的某種特定識(shí)別受體，使LPS與細(xì)胞的接觸減少或者功能減弱，從而緩解了LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激，改善RAW264.7細(xì)胞的形態(tài)。這些研究結(jié)果與陳磊研究的山梨酸對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞形態(tài)的變化具有較好的保護(hù)作用[1]和王潔研究的林蛙骨肉小肽對(duì)RAW264.7細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)正常并且有增殖的結(jié)果相似[18]。

2.4 DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響

LPS可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO、IL-1s等多種炎癥因子，其中NO可經(jīng)一氧化氮誘導(dǎo)合酶iNOS催化可短時(shí)大量生成，可以通過(guò)測(cè)定其含量反映炎癥發(fā)生的程度[20]。由圖4可知，不同處理組的NO分泌量有顯著的差異（p＜0.05），LPS處理組的NO分泌量高于其他處理組，這是因?yàn)榫奘杉?xì)胞受LPS刺激，影響了機(jī)體中iNOS的表達(dá)，進(jìn)而影響了NO的生成量[21]。如圖4a所示，與LPS處理組對(duì)比，DDDY處理降低了 NO 的分泌量，而且質(zhì)量濃度在 12.5 μg/mL~100 μg/mL范圍內(nèi)呈劑量依懶性，LPS處理組NO分泌量為100 μg/mL DDDY處理質(zhì)量濃度的2.46倍；由圖4b可以看出，不同質(zhì)量濃度 DYDD處理組的NO生成量顯著高于空白組（p＜0.05），低于LPS組（p＜0.05），其中 12.5 μg/mL DYDD 處理組為空白對(duì)照組的 16.28倍，兩種發(fā)酵多肽對(duì) RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的刺激呈劑量相關(guān)性。

圖4 不同質(zhì)量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on NO secretion in RAW264.7 cells

NO分泌量是炎癥反應(yīng)中重要的促炎分子，細(xì)胞NO的分泌量可間接反映炎癥發(fā)生的程度[22]，因此，藥物對(duì)炎癥反應(yīng)的作用可通過(guò)測(cè)定NO的含量高低來(lái)進(jìn)行判斷。結(jié)果表明，LPS處理能增加細(xì)胞NO的分泌，添加四種質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD處理后，能對(duì)細(xì)胞NO的分泌產(chǎn)生抑制作用，使NO的分泌量明顯下降，起到抗炎作用。我們猜測(cè)發(fā)酵多肽的加入影響了細(xì)胞中與iNOS表達(dá)的相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，從而影響了NO的分泌，改善了LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激，降低了細(xì)胞的炎癥程度，同時(shí)證明活性發(fā)酵多肽能對(duì)細(xì)胞起到抗炎的效果，He等[23]表明小米糠生物活性肽在LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞以劑量依賴的方式顯著降低NO的產(chǎn)生。這與與本試驗(yàn)結(jié)果相似。

2.5 DDDY和DYDD對(duì)細(xì)胞因子分泌量的影響

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到外界抗原刺激時(shí)（如LPS）會(huì)釋放TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10等重要的細(xì)胞因子[24,25]。其中促炎細(xì)胞因子如 TNF-α、IL-1β、IL-6等可與抑炎細(xì)胞因子IL-10等相互影響，共同發(fā)揮對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)作用[12]。為更全面地對(duì) DDDY和DYDD的體外抗炎效果進(jìn)行研究，以 LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞作為體外抗炎模型，分別探究四個(gè)質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD對(duì)細(xì)胞分泌因子分泌量的影響。

2.5.1 TNF-α分泌量

TNF-α能夠誘導(dǎo)其它免疫因子的分泌，TNF-α具有上調(diào)iNOS的表達(dá)，促進(jìn)NO的生成，所以通常被選為藥物對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)作用的指標(biāo)[24]。如圖5實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比，LPS處理組的TNF-α分泌量顯著升高（p＜0.05），當(dāng)用不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD作用后，TNF-α分泌量明顯下降。DDDY處理后如圖5a所示，與LPS處理組相比，隨著DDDY質(zhì)量濃度升高，TNF-α分泌量越低，當(dāng)經(jīng)100 μg/mL DDDY處理后，TNF-α分泌量下降到 86.73 pg/mL。12.5~100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍的DYDD處理后如圖5b所示，TNF-α的分泌量降低到LPS處理組的0.68~0.86倍，隨著DYDD質(zhì)量濃度的升高而抑制更多，表現(xiàn)出質(zhì)量濃度依賴性。Yang等[26]表明車(chē)前花乙醇提取物對(duì)LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中TNF-α分泌有較強(qiáng)的抑制作用。He等[23]發(fā)現(xiàn)谷糠發(fā)酵多肽能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α等炎癥因子的水平。我們的研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似，結(jié)果表明，DDDY和 DYDD能顯著降低 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中TNF-α的分泌量，并且發(fā)酵多肽的質(zhì)量濃度越高TNF-α分泌量越低，均具有質(zhì)量濃度依賴性。我們猜測(cè)，由于發(fā)酵多肽的介入，影響了LPS誘導(dǎo)的炎癥模型細(xì)胞中促炎癥因子 TNF-α合成蛋白或基因的表達(dá)，導(dǎo)致TNF-α分泌量下降，下調(diào)了iNOS的表達(dá)，進(jìn)而影響NO的生成。這也解釋了DDDY和DYDD處理后RAW264.7細(xì)胞中TNF-α分泌量的變化趨勢(shì)與NO分泌量相似。

圖5 不同質(zhì)量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞TNF-α分泌量的影響Fig.5 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on TNF-α secretion in RAW264.7 cells

2.5.2 IL-1β分泌量

IL-1β作為一種關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子，參與多種自身免疫性炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞活動(dòng)[27]。不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-1β分泌量的影響如圖6所示，空白對(duì)照組的IL-1β分泌量均比較低，經(jīng)過(guò)LPS刺激后，LPS處理組的 IL-1β釋放量明顯升高（p＜0.01），當(dāng)采用 12.5、25、50、100 μg/mL質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD分別處理后，IL-1β分泌量逐步降低（p＜0.05）。不同質(zhì)量濃度的 DDDY 對(duì)RAW264.7細(xì)胞 IL-1β分泌量影響如圖6a所示，100 μg/mL質(zhì)量濃度的DDDY處理后，IL-1β分泌量下降至原來(lái)的 0.51倍；不同質(zhì)量濃度的 DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-1β分泌量影響如圖6b所示，隨著DYDD處理質(zhì)量濃度越高，IL-1β分泌量越低，顯現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，DDDY和DYDD能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β的分泌量，其中兩種發(fā)酵多肽的質(zhì)量濃度在100 μg/mL時(shí)，IL-1β分泌量顯著降低。He等[23]發(fā)現(xiàn)小米糠活性肽能顯著降低LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β等炎癥因子的水平。Kim等[28]發(fā)現(xiàn)蓼乙醇提取物可下調(diào) LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中促炎介質(zhì)如NO和細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)。這些結(jié)果與我們的試驗(yàn)結(jié)果相似。

圖6 不同質(zhì)量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-1β分泌量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on IL-1 βsecretion in RAW264.7 cells

2.5.3 IL-6分泌量

IL-6是一種重要的促炎細(xì)胞因子，在炎癥的發(fā)病機(jī)制中起重要的作用[29]。不同質(zhì)量濃度的 DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-6分泌量的影響如圖7所示，LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，與空白對(duì)照組相比，LPS處理組中 IL-6分泌顯著增加（p＜0.01），當(dāng)逐漸增加DDDY和DYDD兩種發(fā)酵多肽的作用質(zhì)量濃度后，IL-6分泌量降低，并且呈依賴性。由圖7a可知，經(jīng)過(guò)100 μg/mL DDDY處理后，與 LPS處理組對(duì)比，IL-6分泌量下降 1.67倍；由圖7b可知，經(jīng)過(guò)四種質(zhì)量濃度的DYDD處理后，與LPS處理組對(duì)比，IL-6分泌量下降1.28~1.76倍。結(jié)果表明，DDDY和 DYDD能顯著降低 LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-6的分泌量，對(duì)巨噬細(xì)胞的過(guò)度刺激有作用進(jìn)而對(duì)炎癥反應(yīng)有作用。這與Hong等[30]發(fā)現(xiàn)的臍帶菌顯著抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NO、PGE2和IL-6的產(chǎn)生，顯著抑制LPS刺激的炎癥反應(yīng)結(jié)果相似。IL-6作為一種促炎細(xì)胞因子，發(fā)酵多肽處理后的 RAW264.7細(xì)胞的分泌量變化趨勢(shì)與TNF-α和IL-1β相似，我們猜測(cè)發(fā)酵多肽對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞影響與促炎因子相關(guān)基因表達(dá)受到干擾有關(guān)。

圖7 不同質(zhì)量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-6分泌量的影響Fig.7 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on IL-6 secretion of RAW264.7 cells

2.5.4 IL-10分泌量

IL-10是一種多細(xì)胞源、多功能的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化，參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，是公認(rèn)的炎癥中的抑炎與免疫抑制因子[31]。不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-10分泌量的影響如圖8所示，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞24 h后，IL-10分泌量明顯降低，與空白對(duì)照組相比有顯著性差異（p＜0.01）。12.5、25、50、100 μg/mL質(zhì)量濃度DDDY和DYDD作用于LPS誘導(dǎo)后的細(xì)胞，IL-10 質(zhì)量濃度逐漸升高，與LPS處理組相比均有顯著性（p<0.01）。由圖8a可知，經(jīng)過(guò)100 μg/mL DDDY處理后，與LPS處理組對(duì)比，IL-10含量上升到原來(lái)的 2.52倍；由圖8b可知，經(jīng)過(guò)四個(gè)質(zhì)量濃度的DYDD處理后，IL-10分泌量為L(zhǎng)PS處理組的1.52~2.73倍。結(jié)果表明，DDDY和DYDD能顯著升高LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-10的分泌量，對(duì)炎癥反應(yīng)有作用。結(jié)果與Kim等[32]對(duì)綠頭仙鶴根提取物在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的抗炎作用IL-10分泌量變化相似。

圖8 不同質(zhì)量濃度的DDDY（a）和DYDD（b）對(duì)RAW264.7細(xì)胞IL-10分泌量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of DDDY (a) and DYDD (b) on IL-10 secretion in RAW264.7 cells

LPS為革蘭氏陰性菌產(chǎn)生的病原體，具有激活巨噬細(xì)胞的作用[33]。LPS誘導(dǎo)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞是體外抗炎研究中常用的炎癥模型，活化后的RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力明顯增強(qiáng)，且能分泌大量生物活性物質(zhì)如NO和多種細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等[34]；因此，巨噬細(xì)胞NO及相關(guān)細(xì)胞因子的分泌量可作為評(píng)價(jià)DDDY和DYDD是否具有激活巨噬細(xì)胞從而起到抗炎功效的試驗(yàn)依據(jù)。

有研究報(bào)道細(xì)胞因子如TNF-α和IL-6可通過(guò)激活 NF-κB和 MAPK等信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白引發(fā)炎癥[35]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組的RAW264.7細(xì)胞相比，LPS刺激后細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量均有明顯提高，與LPS處理組比較，不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD處理能不同程度地抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌。但與空白對(duì)照組相比，LPS刺激后細(xì)胞中的抑炎因子IL-10質(zhì)量濃度顯著降低，與 LPS組相比，不同質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD作用后細(xì)胞中IL-10的質(zhì)量濃度均有顯著升高。根據(jù)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10等細(xì)胞因子含量的測(cè)定，一定質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD處理可有效抑制RAW264.7細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的分泌，同時(shí)促進(jìn)抑炎因子的分泌，由此緩解LPS誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生。這與胡夢(mèng)君[12]的研究結(jié)果相符。

3 結(jié)論

綜上所述，適度濃度的兜唇石斛發(fā)酵多肽Asp-Asp-Asp-Tyr（DDDY）和Asp-Tyr-Asp-Asp（DYDD）具有激活RAW264.7巨噬細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞的增殖和提高吞噬能力的功效；通過(guò)構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型，發(fā)現(xiàn)DDDY和DYDD可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的分化，使細(xì)胞恢復(fù)正常形態(tài)；并且能抑制 LPS誘導(dǎo)的 RAW264.7細(xì)胞NO分泌能力，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞炎癥因子的分泌量分析，一定質(zhì)量濃度的DDDY和DYDD處理能抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中促炎因子的產(chǎn)生，對(duì)抗炎因子的分泌有促進(jìn)作用，表明DDDY和DYDD對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型有一定的抗炎作用。本研究為進(jìn)一步探究發(fā)酵多肽DDDY和DYDD的抗炎機(jī)制提供了基礎(chǔ)，后續(xù)將從基因水平和細(xì)胞信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白方面予以研究。