羊肉中貉源成分Real-time PCR檢測方法的建立

張 誼，湯思凝，梅汝蕃，郝立武，張書宏，王秋悅，鄭百芹*

(1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山 063000；2.河北科技師范學院動物科技學院，河北秦皇島 066000)

我國是羊肉產(chǎn)量大國，羊肉消費呈逐年增長的趨勢，但摻假問題一直是影響羊肉消費的關鍵問題，尤其是動物源性食品摻假是最常見也是最難鑒別的嚴重問題[1-2]。我國毛皮經(jīng)濟動物貉子養(yǎng)殖量大，每年會產(chǎn)出大量的貉子廢棄肉，貉子胴體有可能成為羊肉摻假中一類。截至目前，已經(jīng)開發(fā)了許多肉類摻假檢測的檢測技術，包括Real-time PCR(qPCR)檢測技術、近紅外特征光譜技術、高光譜法、分光光度法和酶聯(lián)免疫分析法等[3-12]。這些檢測方法中，Real-time PCR特異性更強、靈敏度更高、成本更低，該方法在肉類摻假方面的應用已日趨成熟[13-18]。該研究利用Real-time PCR，建立一種對貉肉源成分的快速檢測方法，以期對羊肉及其肉制品中貉肉源的摻假進行定性及定量的檢測，為量化羊肉成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料豬肉、牛肉、雞肉、鴨肉購自秦皇島某大型超市；羊肉、貉肉、狐貍肉、貂肉由河北省預防獸醫(yī)重點實驗室提供；吸附柱法動物組織基因組DNA提取試劑盒、磁珠法動物組織基因組DNA提取試劑盒購自北京天根科技有限公司；瓊脂糖、DL2000 DNA Marker、2×ESTaqMasterMix(Dye)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備NanoDrop 2000核酸蛋白定量儀(美國Thermo Scientific公司)；DYY-6D型電泳儀(北京市六一儀器廠)；高速離心機 FC5515R(上海京工實業(yè)有限公司)；臺式高速離心機 TGL-16G(上海安亭科學儀器廠)；Mx3000P Agilent(美國安捷倫Stratagene公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1樣品的制備。分別取豬、牛、羊、雞、鴨、狐貍、貉、貂8種動物的鮮肉組織樣本各1 g，放在高壓滅菌處理過的研缽中進行液氮研磨，研成肉末后轉移至凍存管中，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2基因組DNA的提取。分別稱取100 mg 8種動物組織肉末，按組織基因組DNA提取試劑盒操作說明提取DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3DNA濃度純度檢測。用NanoDrop 2000核酸蛋白定量儀測定核酸濃度與純度，記錄A260/A280及A260/A230值；并將DNA進行2%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測其完整性。

1.3.4PCR引物設計。參考相關文獻[19-23]，根據(jù)貉子線粒體cytB基因序列，并使用NCBI Blast、MEGA 7等軟件將貉源cytB基因與豬、牛、羊、雞、鴨、狐貍、貂物種序列進行比對，篩選不同種物種間差異序列，設計特異性引物。選擇較為保守的基因16S rDNA為內參基因，設計通用引物。引物序列如表1所示。

1.3.5實時熒光 PCR反應條件的建立與優(yōu)化。實時熒光PCR反應體系(20 μL)：上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L)0.4 μL，2×Perfect StartTMGreen qPCR SuperMix 10.0 μL，Nuclease-free Water 8.2 μL，模板DNA 1.0 μL。預試驗中在46～54 ℃設置了梯度PCR，最后確定了50 ℃為退火溫度，其擴增效果最佳。PCR反應條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，50 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40個循環(huán)。

表1 特異性引物和通用引物序列Table 1 Specific primer and universal primer

1.3.6特異性引物和通用性引物檢測。將提取8個物種基因組DNA進行稀釋，濃度均為50 ng/μL，分別使用特異性引物cytB及通用引物16S rDNA進行qPCR擴增，ddH2O為陰性對照。根據(jù)所得曲線圖及Ct值分析cytB引物的特異性和16S引物通用性。

1.3.7引物靈敏度檢測。將初始濃度為50 ng/μL的貉DNA樣本進行5倍梯度稀釋，使其終濃度分別為50.0 ng/μL、10.0 ng/μL、2.0 ng/μL、400.0 pg/μL、80.0 pg/μL、16.0 pg/μL、3.2 pg/μL，分別以其為模板進行qPCR擴增，ddH2O為陰性對照。根據(jù)曲線圖及Ct值分析特異性cytB引物所能擴增的最低檢測濃度。

1.3.9標準曲線準確性驗證。以總質量為100 mg，貉肉含量分別為5%、15%、45%、65%和95%的貉羊混合肉進行DNA提取后，統(tǒng)一稀釋為50.0 ng/μL，進行qPCR擴增。將ΔCt值帶入已建立的定量標準曲線，計算羊肉質量百分比及其回收率，16S rDNA作為內參，每個樣品做3個重復，檢驗標準曲線的準確性。

1.3.10檢測方法的穩(wěn)定性評估。取終濃度分別為400.0、80.0、3.2 pg/μL的貉DNA樣本，以其為模板進行qPCR擴增，分別進行組內及組間重復性試驗。每個濃度重復檢測3次，記錄各濃度在檢測體系的Ct值，并計算其變異系數(shù)，以評估檢測方法的穩(wěn)定性和重復性。

2 結果與分析

2.1 DNA濃度和純度測定不同肉類DNA濃度和純度測定結果見表2。按核酸提取要求，無蛋白質污染的核酸溶液A260/A280>1.8，無碳水化合物污染的核酸溶液A260/A230>2.0。測定結果(表2)顯示，提取的各類肉DNA純度和濃度均達到要求，模板DNA質量較好，無蛋白及雜質污染，可用于后續(xù)qPCR檢測。

表2 DNA濃度和純度測定結果Table 2 Determination results of DNA concentration and purity

不同肉類基因組DNA電泳檢測結果如圖1所示。電泳條帶清晰、完整，說明提取的基因組DNA可用于后續(xù)qPCR檢測。

注：M為mark。圖1 各種肉類基因組DNA提取結果電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of genomic DNA extraction results of various meats

2.2 引物cytB特異性及16S通用性檢測結果以cytB作為特異性引物，分別以豬、牛、羊、雞、鴨、貉、狐貍和貂基因組DNA為模板進行qPCR擴增。如圖2所示，8種畜禽肉中，只有貉肉DNA在第17個循環(huán)處開始進入指數(shù)擴增期，而其余6種在第27個循環(huán)處才開始進入指數(shù)擴增期，可以很好地與其他幾個常見物種區(qū)分，表明cytB引物特異性較強，符合試驗要求。

圖2 特異引物cytB對不同肉類DNA的擴增曲線Fig.2 Amplification curves of specific primer cytB on different meat DNA

內參引物16S對8種畜禽肉均有較好的擴增效率，且內參基因16S rDNA 檢測的Ct值均集中在狹窄范圍內，較為穩(wěn)定(圖3)，表明其具有通用性。

圖3 內參引物16S對不同物種肉DNA的擴增曲線Fig.3 Amplification curve of meat DNA of different species by internal reference primer 16S

圖4分別為特異性引物和通用引物的擴增熔解曲線，特異性引物擴增熔解曲線峰值溫度為85.65 ℃，通用引物峰值溫度為84.25 ℃，2個熔解曲線均為規(guī)則特異性單峰，無雜峰，說明試驗所用2個引物均無二聚體產(chǎn)生且特異性較強，符合檢測要求。

2.3 引物靈敏度檢測以不同濃度貉基因組DNA為模板進行qPCR檢測判斷其最低檢測限，結果如圖5所示。當模板濃度為0.64 pg/μL時，cytB引物擴增曲線與陰性對照無酶水擴增曲線不能明確區(qū)分；而當模板濃度為3.2 pg/μL時，特異引物指數(shù)擴增曲線可與其他濃度曲線準確明顯區(qū)分，因此該引物的最低檢測限為3.2 pg/μL。

2.4 標準曲線建立不同比例貉羊混合肉樣實時熒光定量結果如表3所示。每個樣品做3個重復。以貉子肉質量百分比的log10值為橫坐標、ΔCt為縱坐標繪制標準曲線(圖6)，得出回歸方程為Y=-4.212X-0.636 4(R2=0.988 9)，且擴增效率(E)為97.86%，符合《實時熒光定量國際化標準-MIQE指南》中E<105%的標準，表明建立的標準曲線具有良好的線性關系，滿足實時熒光定量國際化標準的要求。

圖4 特異性引物(a)和通用引物(b)擴增熔解曲線Fig.4 Melting curve of amplification with specific primers (a) and universal primers(b)

圖5 引物cytB對不同濃度DNA的擴增曲線Fig.5 Amplification curves of primer cytB on DNA gradients of different concentrations

2.5 標準曲線準確性驗證分別以質量比為5%、15%、45%、65%、95%的貉羊混合肉樣為模板，進行qPCR檢測，Ct值結果如表4所示。將ΔCt值代入標準曲線Y=-4.212X-0.636 4，計算出貉肉的含量及其回收率，由表4可知其回收率為97.71%～104.36%。試驗結果符合要求，具有實踐意義。

2.6 檢測方法的穩(wěn)定性評估為了檢測該方法穩(wěn)定性，該研究分別做了組內及組間重復各3組，每組3個重復。重復性檢測結果見表5，組內變異系數(shù)為0.13%～0.59%，組間變異系數(shù)為0.04%～1.08%，表明檢測方法具有較好的穩(wěn)定性。

表3 不同質量百分比貉肉Ct以及ΔCt值檢測結果Table 3 Test results of raccoon dog meat mass percentage Ct and ΔCt values

3 討論與結論

肉類摻假中最常見的手段是使用廢棄肉或低品質的肉類替代高品質昂貴的肉類，我國貉養(yǎng)殖量巨大，每年都會產(chǎn)生大量的貉廢棄肉，這些肉往往容易被摻入到價格更高的羊肉中去，因此對羊肉中摻入貉源成分的檢測方法的開發(fā)尤為重要。該試驗為檢測羊肉中貉源成分的含量，建立Real-time PCR的方法，以cytB基因為特異性檢測引物，構建了標準定量曲線，檢測結果表明在模擬摻假肉中樣品回收率為97.71%～104.36%，最低檢測限達3.2 pg/μL。董洋洋[24]通過實時熒光PCR法對牛肉中的鴨肉和豬肉成分進行了鑒定，其檢測限分別達0.20 和0.02 ng。姜潔等[25]對羊肉中豬源成分和雞源成分進行定量檢測，結果顯示其質量檢測百分比的絕對誤差可以控制在7%以內。薛晨玉等[26]對羊肉中雞源成分的量化檢測發(fā)現(xiàn)，檢測百分比與理論百分比間的絕對誤差在5%以內。該研究所建立的方法抗干擾能力較強，可有效地檢測出羊肉中的貉源成分，量化研究結果準確。

圖6 混合貉肉含量ΔCt標準曲線Fig.6 Mixed raccoon dog meat content ΔCt standard curve

由于羊肉制品在加工過程中其DNA質量會受到不同程度的損耗，因此選擇一種高質量的核酸DNA提取方法至關重要。在試驗過程中分別采用常見組織DNA提取方法，包括試劑盒吸附柱法、試劑盒磁珠法、SDS法、氯仿-醋酸鈉法、苯酚-氯仿抽提法。通過對提取DNA的完整性、濃度、純度、試驗耗時、耗材等方面比較得出，試劑盒法更適合用于常見動物源性肌肉DNA的提取。相比較試劑盒吸附柱法和試劑盒磁珠法，前者提取的核酸濃度高，糖類雜質少，DNA提取率更高。

表4 模擬混合肉樣Ct值檢測結果Table 4 Ct value of simulated mixed meat sample

表5 組內和組間重復性試驗結果Table 5 Repetitive experimental results within and between groups

該研究拓展了羊肉中動物源性成分檢測的應用，實現(xiàn)了在基因水平對貉肉成分的量化判定，為羊肉摻假工作的檢驗奠定了基礎。今后將進一步研究羊肉摻假中多種肉源成分鑒定的方法，為羊肉制品摻假的檢測提供更為簡單、快捷、準確的技術手段和執(zhí)法依據(jù)，以滿足市場需求。