不同脫水條件對草珊瑚種子萌發(fā)及生理指標(biāo)的影響

藍(lán)祖栽，潘春柳，余麗瑩，黃雪彥，姚李祥，王春麗，姚紹嫦，李 瑩*

(1.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園廣西中藥資源普查與整理研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530100)

草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]為金粟蘭科(Chloranthaceae)多年生常綠亞灌木[1]，全草可供藥用，藥材名為腫節(jié)風(fēng)，具有清熱涼血、活血消斑、祛風(fēng)通絡(luò)的功效，用于血熱發(fā)斑發(fā)疹、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷[2]。研究表明，草珊瑚主要含有倍半萜、倍半萜聚合體、酚酸、香豆素和黃酮類等化學(xué)成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化和神經(jīng)保護(hù)等生物活性，是多種中成藥的重要原料[3]。草珊瑚是我國常用大宗藥材。然而，由于野生資源的過度利用，全國野生草珊瑚蘊(yùn)藏量逐年銳減，已難滿足制藥企業(yè)對草珊瑚藥材的需求，急需開展人工栽培研究，進(jìn)一步提高該資源的利用效率。目前在草珊瑚組培快繁技術(shù)方面已取得重要突破[4-5]。然而，生產(chǎn)上草珊瑚以種子繁殖為主，其種子具有休眠且不耐貯藏的特性成為其規(guī)?；耘嗟闹匾拗埔蛩豙6]。該研究以了解草珊瑚脫水耐性的生理基礎(chǔ)為出發(fā)點(diǎn)，對不同梯度脫水條件下的草珊瑚種子進(jìn)行含水量測定、種子萌發(fā)試驗(yàn)及生理指標(biāo)測定，比較分析不同脫水條件對種子萌發(fā)和生理指標(biāo)的影響，為闡釋草珊瑚種子脫水耐性機(jī)制及萌發(fā)生理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料試驗(yàn)材料來源于廣西融安縣。于草珊瑚果實(shí)成熟期采集新鮮果實(shí)，搓洗去除果皮后，置于室內(nèi)通風(fēng)處晾干種子表面水分。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1脫水處理。將種子分為2份。一份置于裝有變色硅膠的干燥器中進(jìn)行快速脫水處理，另一份置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行慢速脫水處理。于脫水后4、8、16和24 h將種子取出，獲得不同脫水條件下不同含水量的種子。以未經(jīng)脫水處理的種子作為對照(CK)。

1.2.2指標(biāo)測定。種子含水量及萌發(fā)試驗(yàn)參照李合生[7]的方法進(jìn)行。過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性、過氧化氫(H2O2)含量、超氧陰離子含量、脯氨酸含量、淀粉酶活性、淀粉含量及可溶性糖含量等生理指標(biāo)參照李合生等[7-8]的方法進(jìn)行測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理使用Microsoft Excel 2013對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。使用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，多重比較采用 Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同脫水條件對種子含水量的影響從表1可以看出，不同慢速脫水條件下，草珊瑚種子含水量差異顯著。隨著草珊瑚脫水時(shí)間的延長，無論慢速脫水還是快速脫水，其含水量均呈逐漸下降趨勢。但在相同脫水時(shí)間內(nèi)，快速脫水的草珊瑚種子均比慢速脫水條件下的種子含水量低；慢速脫水16 h后，種子含水量仍在30%以上；而快速脫水4 h后，草珊瑚種子含水量已降至30%以下，說明硅膠快速脫水對草珊瑚種子含水量影響更大。此外，快速脫水條件下，脫水8和16 h的草珊瑚種子含水量無顯著差異。

表1 不同脫水條件下草珊瑚種子含水量的比較Table 1 Comparison of water content of S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：%

2.2 不同脫水條件對種子萌發(fā)率及發(fā)芽指數(shù)的影響由表2可知，脫水方式對草珊瑚種子萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)均有影響。無論是慢速脫水還是快速脫水，隨著脫水時(shí)間的延長，草珊瑚種子萌發(fā)率及發(fā)芽指數(shù)均呈逐漸下降趨勢，脫水24 h萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)均降為0。慢速脫水4 h對草珊瑚種子萌發(fā)率影響不大，萌發(fā)率仍有90%，但延長脫水時(shí)間至8 h萌發(fā)率急劇下降，與對照相比下降了40%，且顯著低于脫水4 h的種子萌發(fā)率。草珊瑚種子在快速脫水4 h后即出現(xiàn)萌發(fā)率的急劇下降，脫水至8 h，萌發(fā)率僅為對照的17%；脫水16 h后，萌發(fā)率已降至不足5%。

2.3 不同脫水條件對種子CAT活性的影響從表3可知，脫水方式對草珊瑚種子CAT活性亦有影響。在慢速脫水過程中，草珊瑚種子CAT活性呈先升高后下降的趨勢；脫水4 h時(shí)種子CAT活性與對照相比無顯著差異，8 h時(shí)CAT活性提高至148.34 U/(g·min)，顯著高于對照；脫水16 h時(shí)種子CAT活性還維持在較高水平，為136.11 U/(g·min)，24 h時(shí)降至最低。在快速脫水條件下，草珊瑚種子在脫水前期(8 h以內(nèi))的CAT活性與對照相比無顯著差異，在脫水后期(16 h以后)CAT活性顯著高于對照。

表2 不同脫水條件下草珊瑚種子萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)的比較Table 2 Comparison of germination rate and germination index of S. glabra seeds under different dehydration conditions

表3 不同脫水條件下草珊瑚種子CAT活性的比較Table 3 Comparison of CAT activity of S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：U/(g·min)

2.4 不同脫水條件對POD活性的影響由表4可知，不同脫水條件對草珊瑚種子POD活性影響顯著。脫水8 h內(nèi)，慢速脫水和快速脫水均可引起草珊瑚種子POD活性急劇下降，且相同時(shí)間下快速脫水的種子POD活性比慢速脫水低。脫水4 h，慢速脫水的種子POD活性為對照的45.15%，而快速脫水的種子POD活性僅為對照的17.26%；脫水8 h，2種脫水方式的種子POD活性均降至對照的5.00%以下,分別是對照的4.19%、1.76%;隨著脫水時(shí)間延長，慢速脫水和快速脫水的種子POD活性趨于平穩(wěn)，與8 h脫水處理相比均無顯著差異。

表4 不同脫水條件下草珊瑚種子POD活性的比較Table 4 Comparison of POD activity of S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：U/(g·min)

2.5 不同脫水條件對H2O2含量的影響由表5可知，不同脫水方式對草珊瑚種子H2O2含量均有不同程度的影響，但快速脫水和慢速脫水對種子H2O2含量的影響不同。在慢速脫水條件下，隨著脫水時(shí)間延長，草珊瑚種子H2O2含量呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢；在脫水4和8 h時(shí)，其H2O2含量分別比對照高48.39%和43.23%，均顯著高于對照，但二者之間差異不顯著；隨著脫水時(shí)間持續(xù)延長，H2O2含量急速下降，慢速脫水16 h已降至對照水平，與對照無顯著差異；隨后脫水24 h時(shí)，其H2O2含量急劇增加達(dá)到最大值(2.68 μmol/g)。在快速脫水條件下，草珊瑚種子H2O2含量呈現(xiàn)先增大再減小后平穩(wěn)的趨勢；快速脫水4 h時(shí)，其H2O2含量比對照顯著增加了49.68%，而脫水8 h時(shí)其H2O2含量又降低至對照水平，隨后逐漸趨于平穩(wěn)，脫水8～24 h草珊瑚種子內(nèi)H2O2含量均與對照無顯著差異。

表5 不同脫水條件下草珊瑚種子H2O2含量的比較Table 5 Comparison of H2O2 content in S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：μmol/g

2.6 不同脫水條件對超氧陰離子含量的影響從表6可以看出，不同脫水方式對草珊瑚種子的超氧陰離子含量有不同程度的影響，但慢速脫水和快速脫水對其超氧陰離子含量的影響不同。在慢速脫水4 h條件下，其超氧陰離子含量比對照略有上升；而快速脫水4 h時(shí)，其超氧陰離子含量比對照略有下降。隨著脫水時(shí)間的持續(xù)延長，在脫水4～24 h 草珊瑚種子的超氧陰離子含量均呈現(xiàn)先減小后增大再減小的趨勢，但慢速脫水8 h的超氧陰離子含量與對照相比雖略有降低，但差異不顯著，而快速脫水8 h，其超氧陰離子含量與對照差異顯著。慢速脫水16 h時(shí)，草珊瑚種子的超氧陰離子含量達(dá)到最大值，比對照顯著增加了44.68%;而慢速脫水24 h時(shí)，其超氧陰離子含量快速減小，但與對照相比差異不顯著。而

表6 不同脫水條件下草珊瑚種子超氧陰離子含量的比較Table 6 Comparison of superoxide anion content in S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：μg/g

快速脫水16和24 h時(shí)，其超氧陰離子含量均比對照小，但二者之間無顯著差異。

2.7 不同脫水條件對脯氨酸含量的影響從表7可以看出，慢速脫水和快速脫水對草珊瑚種子脯氨酸含量的變化規(guī)律相似，隨著脫水時(shí)間的延長，其脯氨酸含量均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。在脫水4 h時(shí)，脯氨酸含量均比對照略有下降，但差異不顯著。隨著脫水時(shí)間延長，脯氨酸含量快速下降，慢速脫水至8 h時(shí)脯氨酸含量與對照呈顯著差異，脫水16 h時(shí)脯氨酸含量持續(xù)下降，但與脫水8 h無顯著差異；至脫水24 h時(shí)，慢速脫水和快速脫水草珊瑚種子的脯氨酸含量均有大幅上升，且在快速脫水條件下，脫水24 h的脯氨酸含量達(dá)到最大值，較對照顯著提高21.54%。

表7 不同脫水條件下草珊瑚種子脯氨酸含量的比較Table 7 Comparison of proline content in S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：μg/g

2.8 不同脫水條件對淀粉酶活性的影響由表8可知，在相同脫水處理?xiàng)l件下，β淀粉酶活性均比α淀粉酶活性高，但不同脫水方式對草珊瑚種子的淀粉酶活性影響不同。在慢速脫水條件下，不同脫水時(shí)間對α淀粉酶活性影響不顯著；而在快速脫水條件下，α淀粉酶活性隨著脫水時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，且不同脫水時(shí)間(4～24 h)對α淀粉酶活性的影響差異顯著。草珊瑚種子β淀粉酶活性隨著慢速脫水時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢，慢速脫水后，其草珊瑚種子淀粉酶活性急速上升，脫水4 h時(shí)其β淀粉酶活性達(dá)到最大值[25.16 mg/(g·min)]，為對照的4.87倍，隨著慢速脫水時(shí)間的持續(xù)延長，β淀粉酶活性又急速下降至對照水平后逐漸趨于平穩(wěn)?？焖倜撍摩碌矸勖富钚宰兓厔菖c慢速脫水不同，在快速脫水條件下，草珊瑚種子β淀粉酶活性則呈現(xiàn)先增大后減小再增大的趨勢，除脫水16 h之外，其余脫水時(shí)間的β淀粉酶活性均比對照顯著提高；脫水8 h時(shí)其β淀粉酶活性達(dá)到最大值[15.39 mg/(g·min)]，為對照的2.98倍。

2.9 不同脫水條件對淀粉含量的影響從表9可以看出，慢速脫水和快速脫水對草珊瑚種子淀粉含量有不同程度的影響，但慢速脫水和快速脫水對淀粉含量影響不同。在慢速脫水條件下，淀粉含量呈無規(guī)律的波動趨勢，脫水4 h時(shí)淀粉含量較對照顯著降低，隨著脫水時(shí)間延長，其淀粉含量略有回升，且脫水8和16 h淀粉含量差異不顯著，至脫水24 h時(shí)淀粉含量急劇上升，達(dá)到最大值(5.40 mg/g)，為對照的1.90倍。在快速脫水條件下，淀粉含量呈先下降后上升再下降的趨勢；與慢速脫水不同，快速脫水在16 h時(shí)草珊瑚種子淀粉含量達(dá)到最大值，當(dāng)進(jìn)一步延長快速脫水時(shí)間至24 h，其淀粉含量則下降至與對照相同水平。

表8 不同脫水條件下草珊瑚種子淀粉酶活性的比較Table 8 Comparison of amylase activity of S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：mg/(g·min)

表9 不同脫水條件下草珊瑚種子淀粉含量的比較Table 9 Comparison of starch content in S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：mg/g

2.10 不同脫水條件對可溶性糖含量的影響由表10可知，慢速脫水和快速脫水對草珊瑚種子的可溶性糖含量有不同程度的影響。在慢速脫水條件下，草珊瑚種子可溶性糖含量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢，慢速脫水4 h時(shí)種子可溶性糖含量急劇下降，與對照相比減少了24.44%;隨著脫水時(shí)間的延長，其可溶性糖含量持續(xù)顯著上升，至脫水16 h時(shí)其淀粉含量達(dá)到最大值(29.15 mg/g)，為對照的2.34倍。在快速脫水條件下，草珊瑚種子可溶性糖含量呈現(xiàn)上升—下降—上升—下降的趨勢。2種脫水條件均在脫水16 h時(shí)，其可溶性糖含量達(dá)到最大值。

表10 不同脫水條件下草珊瑚種子可溶性糖含量的比較Table 10 Comparison of soluble sugar content in S. glabra seeds under different dehydration conditions 單位：mg/g

3 結(jié)論與討論

程繼銘等[9]研究表明，遼東櫟種子在快速脫水或慢速脫水條件下，隨著脫水時(shí)間的延長，其含水量逐漸下降，萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)逐漸降低。該試驗(yàn)研究結(jié)果與之相似，慢速脫水和快速脫水均能引起草珊瑚種子萌發(fā)率和發(fā)芽指數(shù)明顯下降，且隨著脫水時(shí)間延長，對種子萌發(fā)的抑制作用加劇，表明脫水能夠明顯影響草珊瑚種子萌發(fā)，不適宜進(jìn)行常規(guī)種子保存。同時(shí)，當(dāng)種子含水量接近且低于10%時(shí)(慢速脫水24 h，快速脫水8 h)，慢速脫水的種子萌發(fā)率已經(jīng)降為0，而快速脫水種子仍有部分種子萌發(fā)，表明慢速脫水對草珊瑚種子的傷害更大。

多項(xiàng)研究表明，種子脫水敏感性與活性氧清除機(jī)制有關(guān)。王艷等[10]研究發(fā)現(xiàn)，正常性種子花生在胚脫水初期，能夠誘導(dǎo)活性氧清除酶活性增加，但脫水則引起頑拗性種子活性氧清除酶活性下降。伍賢進(jìn)等[11]研究也發(fā)現(xiàn)，在玉米種子脫水耐性下降時(shí)，活性氧清除酶的活性降低。此外，李磊等[12]研究還發(fā)現(xiàn)脫水速率影響三七種子的脫水敏感性，快速脫水處理的抗氧化酶活性高于慢速脫水。該試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)種子含水量接近且低于10%時(shí)(慢速脫水24 h，快速脫水8 h)，快速脫水種子中的過氧化氫酶(CAT)活性比慢速脫水高，而H2O2含量和超氧陰離子含量比慢速脫水低，表明快速脫水能夠增強(qiáng)活性氧清除酶的活性，減少種子對脫水的敏感性。

據(jù)報(bào)道，種子脫水與脯氨酸有關(guān)。李朋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蒲葵種子在脫水過程中萌發(fā)率逐漸降低，而脯氨酸含量逐漸上升，當(dāng)含水量高于22%時(shí)，脯氨酸含量增加較快，緩解了水分脅迫，表明適度脫水有利于脯氨酸積累，提高種子對水分脅迫的耐受性。王曉峰等[14]研究發(fā)現(xiàn)，利用脯氨酸對芒果離體胚軸進(jìn)行預(yù)處理，可在一定程度上提高芒果離體胚軸的脫水耐性。該研究中，并未發(fā)現(xiàn)脯氨酸含量在慢速脫水處理中有顯著增加，但在快速脫水后期(24 h)脯氨酸含量增加，推測這種變化與種子對水分脅迫的響應(yīng)機(jī)制有關(guān)。

張鵬等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在水曲柳種子慢速脫水和快速脫水過程中，脫水保護(hù)功能下降與可溶性糖和淀粉含量關(guān)系不大。而張俊杰等[16]研究表明，金絲李種子隨著脫水程度的加深，可溶性糖及脯氨酸含量逐步上升。該試驗(yàn)中，慢速脫水后期(4～24 h)種子可溶性糖含量增加，而快速脫水期間可溶性糖含量基本保持不變；在快速脫水16 h、慢速脫水24 h的淀粉含量均增加，但當(dāng)種子含水量接近且低于10%時(shí)(慢速脫水24 h，快速脫水8 h)，快速脫水種子的淀粉含量比慢速脫水低，這些結(jié)果表明種子脫水耐性與可溶性糖含量、淀粉含量之間可能不存在顯著的相關(guān)性。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的關(guān)鍵酶，參與調(diào)控種子萌發(fā)[7]，根據(jù)水解產(chǎn)物類型不同，淀粉酶可以分為α淀粉酶和β淀粉酶。該試驗(yàn)結(jié)果表明草珊瑚種子內(nèi)β淀粉酶活性高于α淀粉酶，推測β淀粉酶在種子脫水期間調(diào)控淀粉含量的作用更大，但對其具體的調(diào)控作用還需進(jìn)一步深入研究。