土壤硒干預(yù)與5種作物集硒特性研究

楊 濤，龍 瀾，商龍臣，萬海英，張 馳，向極釬

(1.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000；2.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北恩施 445000；3.湖北省富硒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，湖北恩施 445000)

硒是人體必需的微量元素，硒缺乏會導(dǎo)致大骨節(jié)病、克山病等疾病[1]。國內(nèi)僅湖北恩施、陜西紫陽兩地是當(dāng)前已探明的富硒區(qū)，其他大部分地區(qū)土壤均表現(xiàn)出一定的低硒或缺硒狀況，由此導(dǎo)致在地區(qū)種植的農(nóng)作物難以達(dá)到富硒標(biāo)準(zhǔn)[2]。在人口劇增與倡導(dǎo)大健康的時(shí)代背景下，食用富硒農(nóng)產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品是當(dāng)前缺硒地區(qū)人群最有效、最直接與最安全的補(bǔ)硒途徑[3-5]。目前，硒的生物強(qiáng)化主要是通過土壤施硒、葉面噴硒以及營養(yǎng)液水培等方式來提高農(nóng)作物的硒含量[6]。但相較而言，葉面噴硒易形成表面殘留，存在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，而營養(yǎng)液水培多用于水培植物且不適宜大規(guī)模生產(chǎn)。因此，使用土壤施加硒肥方式是改善缺硒地區(qū)農(nóng)作物硒營養(yǎng)狀況的有效途徑。昝亞玲等[7]以硒酸鈉為硒源，在不同硒濃度土壤中種植向日葵，結(jié)果表明，200 mg/kg組籽粒硒含量相較于對照組硒含量增加了156.8%。馬小艷等[8]探究了硒酸鈉對小麥各器官硒聚集能力的影響，結(jié)果表明，施硒增加了小麥產(chǎn)量及地上生物量，提高了小麥各器官的硒含量，并促進(jìn)了小麥對微量元素硒的利用。

研究表明，部分植物吸收土壤、水分以及肥料中的硒元素，往往以硒代半胱氨酸形式特異性插入到蛋白質(zhì)中并儲存在植物體內(nèi)[9]。硒蛋白除具備蛋白質(zhì)本身的營養(yǎng)特性外，還具有硒的抗氧化、抗炎、抗癌、改善免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)功能[10-14]。由于植物源硒蛋白具有來源廣泛、獲得成本低、環(huán)境友好度高等特點(diǎn)，其研究與商業(yè)價(jià)值備受學(xué)者關(guān)注[15]。研究表明，不同科植物對硒的耐受、吸收能力存在差異，集硒能力表現(xiàn)為十字花科>百合科>豆科>禾本科[16]，而目前有關(guān)農(nóng)作物植株富硒、耐硒力的研究相對較少。筆者以5種不同科常見作物為研究對象，探究其在不同濃度硒處理下硒的吸收能力，揭示其硒積累與耐受特性，篩選出最適合種植的施硒濃度及最優(yōu)的硒蛋白生產(chǎn)原料，從而為硒蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試材料基本信息見表1。

儀器設(shè)備：BJ-1000A樣品粉碎機(jī)(杭州拜杰科技有限公司)；GXZ-9140數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；AFS-9760雙道原子熒光光度計(jì)(北京海光儀器公司)；MARS6微波消解儀(美國CEM公司)；K9860全自動(dòng)凱式定氮儀(鄭州海能儀器公司)；SH220F石墨消解儀器(海能儀器公司)；UPH-I-20T型超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)；B11-2恒溫磁力攪拌器(上海凌儀生物有限公司)。

試劑：亞硒酸鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、濃硫酸、硼氫化鉀、過氧化氫、硫酸、95%乙醇、硫酸銨、氯化鋇均為分析純；氫氧化鈉、過氧化氫、硝酸、鹽酸均為優(yōu)級純；考馬斯亮藍(lán)G250、溴甲酚綠；甲基紅；硒標(biāo)準(zhǔn)品GSB-04-1751-2004。

表1 材料基本信息Table 1 Materials’ basic information

1.2 盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)盆栽試驗(yàn)在2021年4—9月于恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院(109°29′11.77″E、30°16′12.44″N)園區(qū)大棚進(jìn)行作物種植。2021年4月向土壤基質(zhì)中加入Na2SeO3(分析純)調(diào)節(jié)營養(yǎng)液，使土壤中Se濃度達(dá)20、40、60、80 mg/kg，同時(shí)以不施硒基質(zhì)為對照組(CK)，充分混勻后加入30 cm×20 cm(直徑×高)的塑料盆中，保持土壤濕度為60%。篩選顆粒大小均勻的種子播種，其中，玉米、番茄、油菜每盆3株，綠豆每盆30～40株，洋蔥每盆5株，每種濃度設(shè)置4次重復(fù)。播種后定期觀察并適量澆水。

1.3 樣品采收及預(yù)處理開花期采收植株地上部分，清水洗凈后烘干、稱重，粉碎后過80目篩儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1作物與土壤硒含量測定。作物硒含量測定參照國標(biāo)《GB 5009.93—2017食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測定》第一法：氫化物原子熒光光譜法-微波消解儀法，土壤硒含量測定參照嚴(yán)綺莉[17]的氫化物原子熒光光譜-微波消解法。

1.4.2作物硒積累計(jì)算。樣品硒積累量可反映出作物對硒積累能力，硒積累量計(jì)算公式：

硒積累量=作物干重總質(zhì)量×硒含量

1.4.3蛋白含量測定。樣品蛋白含量測定參照國標(biāo)《GB 5009.5—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》第一法：自動(dòng)凱式定氮儀法。

1.4.4蛋白硒含量測定。參照唐巧玉[18]的方法并略作修改。稱取1 g原料，按照料液比1∶20、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間3 h、堿液濃度0.25 mol/L的提取條件提取粗蛋白，加入硫酸銨使溶液達(dá)到4 ℃硫酸銨溶解度的50%，4 ℃冷藏放置過夜，12 000 r/min、4 ℃離心后取沉淀加入5 mL提取液至透析袋透析24 h，透析后測定硒含量及利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。

1.4.5蛋白中硒積累量計(jì)算。蛋白中硒積累量反映出蛋白與硒結(jié)合量，進(jìn)而判斷出最適合生產(chǎn)硒蛋白的最佳原料，計(jì)算公式：

蛋白中硒積累量=蛋白硒含量×蛋白含量

1.5 數(shù)據(jù)處理分別采用SPSS Statistics 21和 OriginPro 2022對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤硒含量經(jīng)測定土壤中實(shí)際硒含量與施硒濃度基本一致(圖1)。

圖1 土壤中實(shí)際硒含量Fig.1 Actual selenium content in soil

2.2 作物硒含量不同施硒濃度下5種作物植株地上部分的硒含量見圖2。總體上看，5種作物硒含量均達(dá)到GH/T 1135—2017《富硒農(nóng)產(chǎn)品》中的富硒標(biāo)準(zhǔn)(蔬菜類以干質(zhì)量計(jì))。玉米與番茄的硒含量隨施硒濃度的升高逐漸增加，油菜、綠豆、洋蔥的硒含量均出現(xiàn)峰值。

注：小寫字母表示不同施硒濃度間差異顯著(P<0.05) 。 Note：Different lowercase letters indicated significant difference between different selenium concentrations at 0.05 level.圖2 不同施硒濃度下5種作物的硒含量Fig.2 Selenium content of five crops under different application of selenium concentrations

植物根系吸收的硒主要以硒蛋白、硒多糖等有機(jī)硒的形態(tài)儲存于各個(gè)組織[19]。玉米硒含量隨施硒濃度的升高而逐漸升高，且CK～60 mg/kg施硒濃度組硒含量有顯著差異(P<0.05)。CK組玉米硒含量為2.057 0 mg/kg，80 mg/kg施硒濃度組玉米硒含量達(dá)到最大值60.813 1 mg/kg，約為CK的30倍。

CK～40 mg/kg組洋蔥硒含量隨著施硒濃度的升高逐漸升高，CK組和20 mg/kg施硒濃度組洋蔥硒含量有顯著差異(P<0.05)，20與40 mg/kg組洋蔥硒含量無顯著差異。40 mg/kg施硒濃度組洋蔥硒含量達(dá)到最大值3.920 9 mg/kg，40～80 mg/kg組洋蔥硒含量隨著施硒濃度的升高而逐漸降低，且硒含量間有顯著差異(P<0.05)。

CK～60 mg/kg組綠豆硒含量隨著施硒濃度的升高逐漸升高，且硒含量有顯著差異(P<0.05)，當(dāng)施硒濃度達(dá)80 mg/kg時(shí)，其硒含量下降至39.000 5 mg/kg，此時(shí)綠豆硒含量與60 mg/kg組相比無顯著差異。CK組綠豆硒含量為1.270 0 mg/kg，60 mg/kg施硒濃度組綠豆硒含量達(dá)到最大值40.279 3 mg/kg，約為CK組的32倍。

番茄硒含量隨著施硒濃度升高而逐漸升高，且硒含量有顯著差異(P<0.05)。CK組番茄硒含量為1.762 6 mg/kg，80 mg/kg施硒濃度組番茄硒含量達(dá)到最大值42.674 2 mg/kg，約是CK的24倍。

油菜硒含量隨著施硒濃度的升高呈先升高后降低的趨勢。CK組油菜硒含量為3.236 5 mg/kg，20 mg/kg施硒濃度組油菜硒含量達(dá)到最大值157.999 6 mg/kg，約是CK的49倍，不同施硒濃度組油菜硒含量有顯著差異(P<0.05)。

5種作物在不同施硒濃度下對硒的吸收情況擬合方程及相關(guān)系數(shù)見表2，玉米和綠豆的硒含量與施硒濃度呈線性正相關(guān)關(guān)系，洋蔥和番茄的硒含量與施硒濃度呈非線性負(fù)相關(guān)關(guān)系，油菜的硒含量與施硒濃度在20～80 mg/kg呈非線性正相關(guān)。綜上所述，土壤施硒可以增加受試作物對硒的吸收與利用，但不同作物對硒的吸收明顯不同。研究表明，百合科(洋蔥)植物的硒吸收能力僅次于十字花科(油菜)植物[20]，但該研究結(jié)果表明，受試作物吸收硒能力表現(xiàn)為油菜>玉米>番茄>綠豆>洋蔥，原因在于相同科屬，不同品種的植物吸收硒能力也不同。如大蒜與洋蔥同屬于百合科蔥屬植物，洋蔥硒含量最大為3.920 9 mg/kg，而王永勤等[21]使用土壤施硒方式種植富硒大蒜，在施硒濃度10 g/m2時(shí)大蒜平均硒含量可達(dá)142.13 mg/kg。因此，作物對硒的吸收能力不能僅通過科屬判斷。

表2 5種作物在不同施硒濃度下對硒的吸收情況擬合方程Table 2 Fitting equations for selenium uptake by five crops under different soil selenium concentrations

2.3 作物硒積累量研究表明，硒會影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能，過量施硒會對作物產(chǎn)生毒害作用，影響作物生長代謝[9，22]。種植在不同施硒濃度下的5種作物生物學(xué)產(chǎn)量(干重)見表3。由表3可知，在適宜硒濃度土壤中，硒會促進(jìn)植物生長，硒濃度過高則降低產(chǎn)量。硒積累量見圖3。由圖3可知，5種作物的硒積累量隨著施硒濃度的增加先增加后減少。5種作物在不同施硒濃度下的硒積累量最大值分別為玉米7.599 1 mg、洋蔥0.050 7 mg、綠豆3.505 9 mg、番茄2.029 1 mg、油菜22.818 3 mg，油菜的硒積累量最高。由此可知，作物最佳施硒濃度分別為玉米60 mg/kg、洋蔥20 mg/kg、番茄40 mg/kg、綠豆60 mg/kg、油菜60 mg/kg，5種作物硒富集能力表現(xiàn)為油菜>玉米>綠豆>番茄>洋蔥。

表3 5種作物在不同濃度施硒濃度處理下的生物學(xué)產(chǎn)量(干重)Table 3 Biological yield of 5 crops at different concentrations of selenium(dryweight) 單位：g

注：不同小寫字母表示不同施硒濃度間差異顯著(P<0.05)。 Note：Different lowercase letters indicated significant difference between different selenium concentrations at 0.05 level.圖3 5種植物在不同施硒濃度處理下的硒積累量Fig.3 Selenium accumulation of five crops under different application of selenium concentration

2.4 作物蛋白含量與蛋白硒含量根據(jù)硒積累量結(jié)果，選擇玉米60 mg/kg、洋蔥20 mg/kg、番茄40 mg/kg、綠豆60 mg/kg、油菜60 mg/kg的樣品進(jìn)行總蛋白與蛋白硒含量的測定。由圖4可知，5種作物蛋白含量分別為玉米16.01%、洋蔥13.35%、番茄25.81%、綠豆24.26%、油菜27.85%。蛋白含量表現(xiàn)為油菜>番茄>綠豆>玉米>洋蔥，經(jīng)SPSS單因素顯著性分析，5種作物蛋白含量有顯著差異(P<0.05)。

玉米蛋白硒含量為33.769 2 mg/kg，占玉米總硒含量的64.31%；洋蔥蛋白硒含量為2.816 5 mg/kg，占洋蔥總硒含量的79.76%；番茄蛋白硒含量為19.535 4 mg/kg，占番茄總硒含量的52.18%；綠豆蛋白硒含量為5.482 6 mg/kg，占綠豆總硒含量的23.55%；油菜蛋白硒含量為126.279 1 mg/kg，占油菜總硒含量的90.31%。蛋白硒含量表現(xiàn)為油菜>玉米>番茄>綠豆>洋蔥，經(jīng)SPSS軟件單因素顯著性分析，5種作物蛋白硒含量有顯著差異(P<0.05)。

注：不同小寫字母表示不同作物間差異顯著(P<0.05)。 Note：Different lowercase letters indicated significant difference between different crops at 0.05 level.圖4 作物總硒、蛋白含量及蛋白硒含量Fig.4 Crops selenium，protein content and selenium content in protein

2.5 作物蛋白中硒積累量經(jīng)計(jì)算得，5種植物蛋白中硒積累量表現(xiàn)為油菜(35.18 mg/g)>玉米(5.41 mg/g)>番茄紅柿(5.04 mg/g)>綠豆(1.33 mg/g)>洋蔥(0.38 mg/g)。

綜上所述，以60 mg/kg施硒濃度種植的油菜，蛋白中硒積累量最高，是最優(yōu)的硒蛋白生產(chǎn)原料。

3 討論

3.1 施硒肥對作物硒吸收的影響土壤施加硒肥是一種有效提高作物硒含量的方式。王曉麗等[23]發(fā)現(xiàn)施硒濃度為250 kg/hm時(shí)，淮山的硒含量達(dá)0.767 mg/kg，約為對照組的31倍。袁偉玲等[24]發(fā)現(xiàn)隨著施硒濃度的增加，葉用萵苣的總硒含量逐漸增加，而生物產(chǎn)量先增加后降低，這與該試驗(yàn)中玉米與番茄的硒含量及生物產(chǎn)量一致。研究表明，植物對土壤中硒實(shí)際吸收情況主要取決于土壤中硒濃度及植物本身的特性[8，20，25]。該研究中5種作物地上對硒的吸收情況與能力有明顯差異，如油菜的硒含量受品種影響，其硒含量變化符合“S”型曲線，其原因是該試驗(yàn)使用的油菜品種是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所的“硒滋園1號”，其對硒的吸收與積累能力遠(yuǎn)超于其他研究中使用的油菜品種。植物對硒的吸收除受施硒濃度和植物本身的特性外還與施硒方式、施硒時(shí)期、硒的形態(tài)、土壤中其他元素營養(yǎng)含量、土壤中硒元素的有效性等多重因素影響[26-29]。

3.2 施硒肥對作物硒積累及產(chǎn)量的影響有關(guān)硒對作物硒積累量及產(chǎn)量的影響，目前還存在一定的爭議。研究表明，適量施硒會提高作物的產(chǎn)量與硒積累量，但過量施硒會對作物產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致作物植株矮小、產(chǎn)量降低等[7，8，20，24，26，28，30-32]；研究表明，施硒對作物產(chǎn)量無顯著影響[3，6，29，33-34]。而該研究中，施硒可增加作物的硒含量及提高生物學(xué)產(chǎn)量，施硒濃度過高時(shí)，5種作物的生物學(xué)產(chǎn)量均呈下降趨勢，硒積累量均出現(xiàn)峰值，作物產(chǎn)量與硒積累量均明顯下降，表明硒對作物的生物學(xué)產(chǎn)量有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的作用。

3.3 作物總硒含量、蛋白硒含量對硒蛋白原料篩選的影響總硒含量、蛋白含量、蛋白中硒含量與作物產(chǎn)量是硒蛋白原料篩選的重要指標(biāo)。該研究中，綠豆在最佳施硒濃度中總硒含量為40.279 3 mg/kg，蛋白硒含量為5.482 6 mg/kg，僅占總硒含量的23.55%，而玉米、洋蔥、番茄、油菜的蛋白硒含量分別占總相應(yīng)作物總硒含量的64.31%、79.76%、52.18%、90.31%。由此可知，與其他作物相比，種植在最佳施硒濃度中的作物總硒含量與其蛋白中硒含量不一定呈正相關(guān)關(guān)系，作物的蛋白硒含量也與作物本身特性有關(guān)。因此，通過計(jì)算蛋白中硒積累量可以有效篩選出生產(chǎn)硒蛋白的最佳原料。

4 結(jié)論

該研究中，通過土壤施硒種植后，得到了5種富硒農(nóng)作物，且5種作物最大硒含量均符合GH/T 1135—2017《富硒農(nóng)產(chǎn)品》(蔬菜類以干質(zhì)量計(jì))標(biāo)準(zhǔn)。此外，分析作物中硒含量、硒積累量、蛋白含量、生物產(chǎn)量、蛋白硒含量、蛋白中硒積累量，發(fā)現(xiàn)十字花科植物甘藍(lán)型油菜的吸收與積累硒的能力最強(qiáng)，是最優(yōu)的硒蛋白提取原料，最佳施硒濃度為60 mg/g，在此條件下種植的油菜硒含量為60.813 1 mg/kg、硒積累量22.818 3 mg、蛋白含量27.85%、蛋白硒含量126.279 1 mg/kg、蛋白中硒積累量35.18 mg/g。該研究為工業(yè)生產(chǎn)硒蛋白篩選出最優(yōu)提取原料提供一定的理論基礎(chǔ)。