造血干細(xì)胞移植條件對(duì)小鼠造血重建的影響

肖方楠 ， 呂雪 ， 袁佳佳 ， 張明英 ， 邢文 ， 周圓

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院血液學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，細(xì)胞生態(tài)海河實(shí)驗(yàn)室，天津 300020

造血干細(xì)胞（haematopoietic stem cell，HSC）是一群具有自我更新以及多向分化潛能的特殊細(xì)胞群體，通過(guò)定向分化形成各系造血祖細(xì)胞及成熟血細(xì)胞，在維持血液系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)上起著至關(guān)重要的作用。在造血干細(xì)胞分化模型中，逐級(jí)向下分化為長(zhǎng)期造血干細(xì)胞（long-term haematopoietic stem cell，LT-HSC）和短期造血干細(xì)胞（short-term haematopoietic stem cell，ST-HSC）。體內(nèi)移植研究已經(jīng)證實(shí)，ST-HSC可以維持6～8周的正常造血功能，而LT-HSC則能維持生命體整個(gè)生命周期內(nèi)正常造血群體和細(xì)胞類型［1］。正是由于造血干細(xì)胞具有自我更新以及多向分化潛能的特殊性質(zhì)，自1957年起，臨床上應(yīng)用造血干細(xì)胞移植策略治療血液以及自身免疫性等疾病［2-3］。目前臨床上利用CD34+的造血干祖細(xì)胞（haematopoietic stem and progenitor cell，HSPC）作為供體細(xì)胞治療腫瘤等疾病的手段已經(jīng)相對(duì)成熟，為進(jìn)一步提高臨床治愈率、擴(kuò)大應(yīng)用范圍及實(shí)現(xiàn)個(gè)體化治療，已經(jīng)研發(fā)出對(duì)HSPC進(jìn)行基因修飾后進(jìn)行移植的基因療法［4］。如使用病毒載體修飾HSPC的藥物已經(jīng)獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床，此外使用CRISPR-Cas9等基因編輯技術(shù)對(duì)HSPC進(jìn)行位點(diǎn)特異性修飾的方案也具有廣闊的臨床應(yīng)用前景［5-7］。而HSPC經(jīng)過(guò)基因編輯等預(yù)處理后是否能完成造血重建以及會(huì)發(fā)生何種不良反應(yīng)尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。

在基礎(chǔ)研究中常通過(guò)小鼠造血干細(xì)胞的移植模型來(lái)探究血液系統(tǒng)疾病的機(jī)制。全骨髓單個(gè)核細(xì)胞、利用磁珠富集的c-Kit+細(xì)胞群體以及通過(guò)流式分選得到純度更高的造血干細(xì)胞均可作為移植的供體細(xì)胞。此外，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求的不同，還會(huì)對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行病毒感染、分選等預(yù)處理后再進(jìn)行移植。但供體細(xì)胞植入后，能否持久并有效地進(jìn)行重建還受到供體細(xì)胞質(zhì)量、來(lái)源以及骨髓微環(huán)境等多種因素的影響。已有研究表明，骨髓微環(huán)境中活性氧的水平以及細(xì)胞因子的含量等可以顯著影響移植后供體細(xì)胞的植入情況，而使用抗氧化藥物改善骨髓微環(huán)境以及適當(dāng)升高微環(huán)境中IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平將有助于造血干細(xì)胞的植入并降低植入后不良反應(yīng)的發(fā)生率［8-11］。但不同供體細(xì)胞的選擇是否會(huì)影響移植后的造血重建效果以及預(yù)處理操作對(duì)移植效果產(chǎn)生何種影響尚不十分清楚。

本研究選用小鼠移植實(shí)驗(yàn)中最常見的2種供體細(xì)胞，即全骨髓單個(gè)核細(xì)胞（whole bone marrow mononuclear cells，BMNCs）和c-Kit+造血干細(xì)胞進(jìn)行移植，并對(duì)2種供體細(xì)胞進(jìn)行病毒感染，以探究不同來(lái)源的供體細(xì)胞以及供體細(xì)胞的預(yù)處理對(duì)移植后重建的影響。在進(jìn)行造血干細(xì)胞移植后，對(duì)各系造血重建的檢測(cè)是評(píng)估移植效果的重要指標(biāo)。前期研究表明移植2周后便會(huì)出現(xiàn)粒細(xì)胞的重建，在6～8周出現(xiàn)B細(xì)胞重建，最后進(jìn)行T細(xì)胞重建［12］。因此，我們通過(guò)檢測(cè)移植后小鼠外周血成分的動(dòng)態(tài)變化以及小鼠移植后的狀態(tài)來(lái)比較不同供體細(xì)胞以及預(yù)處理因素對(duì)移植效果的影響，以期為造血干細(xì)胞的移植研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

供體小鼠C57BL/6J（白細(xì)胞抗原表型為45.2）和受體小鼠B6.SJL（白細(xì)胞抗原表型為45.1）均由本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自主繁育。所有實(shí)驗(yàn)用鼠均飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所SPF級(jí)動(dòng)物房，且所有用于實(shí)驗(yàn)研究的小鼠均得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所倫理委員會(huì)的管理與批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)選取6～10周的小鼠作為供體或者受體小鼠。

1.2 試劑與儀器

小鼠骨髓c-Kit富集使用的anti-mouse c-Kit（CD117）magnetic beads及磁力分選器LS柱均購(gòu)自美天旎公司。流式分析以及分選所用到的單克隆熒光抗體包括：APC-Anti-CD117、FITC-Anti-CD45.1、APC-Anti-CD45.2、APC-cy7-Anti-Ly6G/Ly6C、PE-cy7-Anti-CD11b、PE-cy7-Anti-CD3、PEpercp 5.5-Anti-B220均購(gòu)自eBioscience以及Invitrogen公司。紅細(xì)胞裂解液以及PBS粉末購(gòu)自索萊寶公司。骨髓細(xì)胞沖洗液PBE為PBS+2%血清+2 μmol·L-1EDTA配制。流式分選儀Aria Ⅱ以及流式分析儀Cantoll均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.3 小鼠全骨髓單核細(xì)胞的獲取

實(shí)驗(yàn)小鼠安樂(lè)死后在75%酒精溶液中浸泡5 min進(jìn)行消毒，之后取小鼠脛骨、股骨以及髂骨置于PBE溶液中，用1 mL注射器吸取PBE溶液沖出骨髓細(xì)胞，過(guò)300目塑料膜制備成單細(xì)胞懸液。

1.4 小鼠c-Kit細(xì)胞的磁珠富集

獲得的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞懸液300g離心5 min，用1 mL PBS進(jìn)行重懸，每只鼠取出的骨髓細(xì)胞加入200 μLCD117磁珠進(jìn)行標(biāo)記，4 ℃避光標(biāo)記30 min，LS柱進(jìn)行富集，即得到小鼠c-Kit+細(xì)胞。

1.5 小鼠骨髓細(xì)胞感染以及分選

將獲得的小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞以及c-Kit+細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以5×105個(gè)·孔-1的數(shù)目鋪在24孔板內(nèi)，每孔加入100 μL帶熒光標(biāo)簽的逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染48 h后，流式分選儀分選熒光陽(yáng)性細(xì)胞。

1.6 小鼠骨髓細(xì)胞移植

取8～10周左右B6.SJL小鼠，用X-Ray輻照儀進(jìn)行致死劑量照射，總劑量8 Gy。照射完成約3 h后，將5×105c-Kit+細(xì)胞或1×106全骨髓細(xì)胞與5×105CD45.1保護(hù)細(xì)胞混合后進(jìn)行小鼠尾靜脈移植。

1.7 小鼠外周血表型的分析

小鼠移植2、4、8、12、16周后，取小鼠尾靜脈外周血，使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，分別標(biāo)記抗體（FITC-CD45.1、APC-CD45.2、APC-cy7-Ly6G/Ly6C、PE-cy7-CD11b 或 FITC-CD45.1、APCCD45.2、PE-cy7-CD3、PE-percp5.5-B220），4 ℃孵育30 min?？贵w標(biāo)記結(jié)束后加入3 mL PBS清洗，離心后流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 小鼠體質(zhì)量變化

在小鼠骨髓移植1周后對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，以該次測(cè)量數(shù)據(jù)當(dāng)作小鼠基礎(chǔ)體質(zhì)量數(shù)值，此后在移植16周后，小鼠完全造血重建后再對(duì)小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，取最后測(cè)量值與基礎(chǔ)體質(zhì)量數(shù)值的差值作為小鼠體質(zhì)量?jī)粼鲩L(zhǎng)數(shù)值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用FlowJo軟件對(duì)流式圖進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用GraphPad 8.0進(jìn)行分析，使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)之間比較采用One Way-ANOVA進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，P＜0.05即認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.000 1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供體細(xì)胞群體對(duì)髓系重建的影響

小鼠骨髓細(xì)胞包括造血干祖細(xì)胞及由其分化而來(lái)的不同譜系的成熟細(xì)胞，通常可通過(guò)標(biāo)記造血干祖細(xì)胞表面標(biāo)記物CD117來(lái)進(jìn)行分離造血干細(xì)胞。本研究采用BMNCs以及CD117磁珠富集出的c-Kit+細(xì)胞作為供體細(xì)胞，同時(shí)對(duì)獲得的供體細(xì)胞導(dǎo)入攜帶熒光標(biāo)簽的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及分選等預(yù)處理以模擬對(duì)造血干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾操作，預(yù)處理后將獲得的供體細(xì)胞群體移植入經(jīng)致死劑量照射的受體小鼠體內(nèi)進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)（圖1）。在移植2周后，對(duì)受體小鼠外周血進(jìn)行流式分析，觀察早期髓系比例變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示在CD45.2細(xì)胞群體內(nèi)，全骨髓細(xì)胞移植組的髓系比例要高于c-Kit+細(xì)胞移植組，隨著重建時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)兩組髓系比例均開始下降，最終兩組達(dá)到同一水平且逐漸穩(wěn)定。

圖1 小鼠移植流程示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the mouse transplantation process

圖2 移植后早期髓系比例變化Fig. 2 Change in myeloid proportions in the early stages after transplantation

2.2 不同供體細(xì)胞群體對(duì)嵌合比例的影響

檢測(cè)移植后的嵌合比例，可以作為判斷受體細(xì)胞植入效果的另一個(gè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示c-Kit+細(xì)胞移植組的嵌合比例要高于全骨髓移植組，表明c-Kit+細(xì)胞移植組的植入效率要優(yōu)于BMNCs移植組。我們還發(fā)現(xiàn)雖然使用不同供體細(xì)胞均能使受體小鼠達(dá)到穩(wěn)定的造血重建，但BMNCS移植組呈現(xiàn)出較大的個(gè)體差異，同組之內(nèi)的均一性要與c-Kit+細(xì)胞移植組相比較差（圖3）。除此之外，在對(duì)受體小鼠的嵌合率進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)供體細(xì)胞導(dǎo)入的熒光載體出現(xiàn)明顯熒光衰減的現(xiàn)象（圖4）。針對(duì)此現(xiàn)象，設(shè)立不經(jīng)流式細(xì)胞儀分選的實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，對(duì)照組熒光水平則保持穩(wěn)定，并未出現(xiàn)熒光衰減現(xiàn)象（圖4）。此外，我們還對(duì)CD45.2內(nèi)各個(gè)分群的細(xì)胞進(jìn)行熒光檢測(cè)以及統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示（圖4），各個(gè)分群之間的細(xì)胞呈現(xiàn)出均一的熒光衰減現(xiàn)象。

圖3 移植后供體細(xì)胞嵌合比例變化Fig. 3 Change in donor cell chimeric ratio after transplantation

2.3 不同供體細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)期造血重建的影響

造血系統(tǒng)中淋系的重建通常發(fā)生在移植后8周，可用于評(píng)價(jià)長(zhǎng)期造血重建效果的指標(biāo)。因此，我們檢測(cè)受體鼠移植后外周血中T、B細(xì)胞的比例來(lái)探究不同的供體細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)期造血重建的影響。通過(guò)對(duì)兩組移植小鼠8周內(nèi)的外周血檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞在移植后4～8周開始重建，而T細(xì)胞的重建時(shí)間要晚于B細(xì)胞，且c-Kit+細(xì)胞移植組淋系重建要早于全骨髓移植組（圖5）。除此之外，在對(duì)移植效果進(jìn)行評(píng)估時(shí)，移植不良反應(yīng)也是重要的觀察指標(biāo)。我們對(duì)兩組移植小鼠進(jìn)行外觀表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)全骨髓移植的小鼠在移植后出現(xiàn)脫毛、食欲不振等不良反應(yīng)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)全骨髓移植組小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)要明顯比c-Kit+移植組緩慢（圖6）。

圖5 移植后小鼠淋系重建情況Fig. 5 Radiant remodeling in mice after transplantation

圖6 移植后小鼠體重變化Fig. 6 Changes in mouse weight after transplantation

3 討論

造血干細(xì)胞移植作為治療多種血液系統(tǒng)以及自身免疫系統(tǒng)疾病的有效方案在臨床上得到廣泛應(yīng)用。目前造血干細(xì)胞不僅可以作為“種子細(xì)胞”移植入病人體內(nèi)，進(jìn)行造血重建以及提高免疫功能，同時(shí)還可以作為“載體細(xì)胞”進(jìn)行基因編輯達(dá)到對(duì)疾病的定向免疫治療和基因治療的目的［2，4］。除了應(yīng)用于臨床疾病治療外，造血干細(xì)胞移植在基礎(chǔ)研究中也是必不可少的技術(shù)手段。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，供體細(xì)胞的選擇以及對(duì)供體細(xì)胞做出的預(yù)處理都會(huì)影響移植效率，從而影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前已有研究證實(shí)，移植時(shí)采用不同類型的保護(hù)細(xì)胞以及受體骨髓微環(huán)境的差異對(duì)移植效果會(huì)產(chǎn)生不同的影響，但對(duì)于如何選擇合適的供體細(xì)胞群體尚未有明確的研究［1，13-14］。與此同時(shí)，流式細(xì)胞分選技術(shù)作為近30年來(lái)飛速發(fā)展的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究及臨床檢測(cè)中。在造血干細(xì)胞移植過(guò)程中也會(huì)利用流式細(xì)胞分選技術(shù)對(duì)移植的供體細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的純化，但分選過(guò)程是否會(huì)影響移植效果也未有明確的定論。

本研究結(jié)果顯示，在經(jīng)過(guò)相同條件預(yù)處理情況下，使用全骨髓細(xì)胞以及c-Kit+細(xì)胞均可使受體鼠達(dá)到造血穩(wěn)態(tài)水平，但利用磁珠富集得到較高純度的HSPC進(jìn)行移植對(duì)受體產(chǎn)生的影響最小。我們發(fā)現(xiàn)在利用全骨髓細(xì)胞移植時(shí)，并不能保證受體獲得足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞，同時(shí)受體將被植入大量已分化的成熟細(xì)胞，極易導(dǎo)致受體出現(xiàn)免疫排斥等不良反應(yīng)。而利用c-Kit+細(xì)胞進(jìn)行移植時(shí)，雖然在短期造血重建上，髓系比例要低于全骨髓細(xì)胞移植組，但其長(zhǎng)期造血中的T、B細(xì)胞重建早于全骨髓細(xì)胞移植組。推測(cè)其原因可能是全骨髓細(xì)胞移植組中已經(jīng)含有大量成熟髓系細(xì)胞，因此在移植后短期內(nèi)呈現(xiàn)出髓系比例高于c-Kit+細(xì)胞移植組。此前有研究表明，在移植的初期，造血干細(xì)胞及其后代暴露在輻照骨髓環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生DNA損傷等“旁觀者效應(yīng)”，從而使植入的供體細(xì)胞無(wú)法迅速增殖分化［15-16］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，c-Kit+細(xì)胞移植組比全骨髓細(xì)胞移植組出現(xiàn)更早的淋系重建，提示含有純度更高HSC的c-Kit+移植組比全骨髓細(xì)胞移植組能夠更快地?cái)[脫輻照引起的負(fù)面“旁觀者效應(yīng)”。此外，除了本研究中檢測(cè)的粒細(xì)胞以及淋系重建之外，血小板和紅細(xì)胞的重建也是臨床上重要的觀察指標(biāo)，但是由于紅細(xì)胞與血小板發(fā)育成熟的特殊性，以及人與小鼠紅細(xì)胞的差異性，使得紅細(xì)胞和血小板的重建難以完整展現(xiàn)。在后續(xù)研究中或許可以通過(guò)使用人源化小鼠模型來(lái)實(shí)現(xiàn)相關(guān)研究［17］。另一方面，本研究通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)供體細(xì)胞進(jìn)行分選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然分選后得到的細(xì)胞也可以達(dá)到完全造血重建，但會(huì)出現(xiàn)熒光衰減現(xiàn)象。先前有研究報(bào)道，體內(nèi)造血干細(xì)胞在分化過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致SFFV啟動(dòng)子序列的廣泛甲基化，從而使導(dǎo)入基因表達(dá)沉默［18］，但我們的研究結(jié)果顯示在向T細(xì)胞、B細(xì)胞以及髓系細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞中熒光衰減的水平是一致的。因此，推測(cè)熒光衰減的原因?yàn)榱魇郊す庹丈鋵?dǎo)致的細(xì)胞熒光載體淬滅現(xiàn)象，在一定程度上將導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)中分析基因改造供體細(xì)胞對(duì)造血影響時(shí)分群不明確，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這提示我們?cè)诤罄m(xù)實(shí)驗(yàn)分析中不能完全通過(guò)熒光表達(dá)來(lái)區(qū)分細(xì)胞群體。通過(guò)以上的實(shí)驗(yàn)研究，我們發(fā)現(xiàn)不同處理?xiàng)l件下的供體細(xì)胞均可完成造血重建，但c-Kit+細(xì)胞移植組的重建效果要優(yōu)于全骨髓細(xì)胞移植組。

造血干細(xì)胞移植的應(yīng)用提高了血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)代謝性疾病等病人的治愈率和生存期。研究發(fā)現(xiàn)，造血干細(xì)胞移植后供體細(xì)胞內(nèi)含有的造血干細(xì)胞數(shù)量以及狀態(tài)是決定移植結(jié)果的關(guān)鍵因素［13］。本研究探究了2種最常見移植供體細(xì)胞群體的優(yōu)劣以及流式分選對(duì)移植效果的影響，這些研究結(jié)果對(duì)于骨髓移植后如何促進(jìn)早期重建、預(yù)防移植相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生具有一定參考價(jià)值。