PET水解酶傳統(tǒng)與智能分子設(shè)計研究進(jìn)展

苗瑞菊 ， 丁尊丹 ， 田健 ， 張紅兵 ， 關(guān)菲菲

1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081

合成塑料屬于長鏈聚合物，通常是化石燃料的副產(chǎn)品，制成的產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)良，日常生活中應(yīng)用廣泛，自1950年問世伊始就得以大規(guī)模生產(chǎn)使用［1］。據(jù)統(tǒng)計，2018年全球塑料產(chǎn)量為3.59億t，2019增長到3.68億t，該數(shù)字還在持續(xù)增長［2］。由于大多數(shù)塑料用品生產(chǎn)成本低，導(dǎo)致重復(fù)使用的意愿不高，大部分是一次性使用，塑料垃圾亂扔亂放屢禁不止，如漁具、塑料瓶、購物袋等一次性塑料用品污染環(huán)境的現(xiàn)象屢見不鮮，不僅導(dǎo)致化石資源過度消耗，還會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。由于塑料的降解性差，在環(huán)境中不會完全消失，而是通過機(jī)械作用生成直徑小于5 mm的微塑料顆粒轉(zhuǎn)移到土壤和海洋中，甚至在空氣中也能檢測到［3-4］，在土壤中直接影響土壤微生物的功能和結(jié)構(gòu)多樣性，危害植物健康，還可以通過食物鏈或呼吸等方式在動物及人體中富集［5］。聚對苯二甲酸乙二醇酯是一種以對苯二甲酸（terephthalic acid，TPA）、乙二醇（ethylene glycol，EG）為單體的聚酯塑料，具有重量輕、絕緣性好、強(qiáng)度和透明度高、熱學(xué)性能好、耐化學(xué)腐蝕等特點，被廣泛應(yīng)用在聚酯織物、普通塑料容器、包裝材料以及電子設(shè)備中，年消費量約占世界塑料總產(chǎn)量的13%［6］。雖然PET和其他合成聚合物塑料被認(rèn)為是無毒的，但它們是潛在的有毒著色劑和添加劑的載體，對全球生態(tài)系統(tǒng)和人類健康造成嚴(yán)重威脅［1，5］。本文對脂肪酶、角質(zhì)酶、IsPETase和IsMHETase這4種PET水解酶的發(fā)現(xiàn)歷史、結(jié)構(gòu)特點與催化機(jī)制進(jìn)行了介紹，重點闡述了PET水解酶傳統(tǒng)蛋白質(zhì)工程與人工智能分子設(shè)計的研究進(jìn)展。以期為進(jìn)一步設(shè)計和構(gòu)建高效PET水解酶、提高熱穩(wěn)定性以及拓寬其他生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域提供有益參考。

1 塑料廢棄物的處理現(xiàn)狀

截至目前，塑料廢棄物的處理方法主要有垃圾填埋、焚燒、機(jī)械回收和化學(xué)回收四種方法。填埋法是將塑料作為垃圾進(jìn)行填埋，最終沉積在土壤和海洋中，造成地下水污染［7］。在“太平洋垃圾帶”中，塑料垃圾的累積量已達(dá)到了7萬t，而且仍在以驚人的速度增長［8］。焚燒法是將塑料作為一種能源，通過焚燒獲取能量，如日本等土地資源匱乏的國家，更傾向于這種處理方法，但這一過程通常會釋放出有毒物質(zhì)，如呋喃和二噁英等，造成環(huán)境的二次污染［9］?；厥辗ㄊ菍⑺芰蠌U物轉(zhuǎn)化為可重復(fù)使用的材料，是解決塑料廢物污染的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，其中機(jī)械回收要經(jīng)過分類、粉碎、融化、造粒等過程，由于不會改變材料的基本結(jié)構(gòu)，回收塑料與非回收塑料可共同作為原料用于工業(yè)生產(chǎn)［10-11］，但機(jī)械回收不適用于溫度敏感性差的塑料和多層塑料［12］，材料變質(zhì)現(xiàn)象也較為常見。此外，回收法還存在新PET材料在壽命期內(nèi)會自發(fā)降解［13］、塑料垃圾中潛在的有毒有機(jī)化合物仍然會危害環(huán)境和公共健康［14］、分類帶來的經(jīng)濟(jì)和適用性等問題［15］?；瘜W(xué)回收法則是通過水解、糖酵解或甲醇水解，將塑料解聚成單體或其他有用的產(chǎn)品，常需要高溫、高壓、催化劑等苛刻條件，成本較高，還存在產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物的風(fēng)險［10，16］。

因此，為減少塑料垃圾的影響，實行新的具有環(huán)保意義的回收策略成為當(dāng)務(wù)之急，生物降解法應(yīng)運而生，該方法是利用微生物產(chǎn)生的酶（通常是水解酶［17］，在水分子的幫助下降解聚合物）將塑料聚合物裂解為單體及其他降解物，進(jìn)一步作為微生物的碳源和能源［18］。與傳統(tǒng)方法相比，生物降解法條件溫和，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，具有不可替代的優(yōu)勢和廣闊的發(fā)展前景。目前在生物降解的塑料中，有關(guān)PET的研究最多，已發(fā)現(xiàn)多種放線菌、藻類、細(xì)菌和真菌具有降解PET的能力［19-20］。自2005年Müller等［21］在Thermobifida fusca中首次分離出了具有降解PET活性的酶以來，研究人員在降解PET的微生物中分離得到了脂肪酶［22］、角質(zhì)酶［23-24］、IsPETase和IsMHETase［25］等一系列水解酶，它們水解PET的酯鍵生成對苯二甲酸雙羥乙酯［Bis（2-hydroxyethyl）terephthalic acid，BHET］、對苯二甲酸單羥乙酯［Mono（2-hdroxyethyl）terephthalic acid，MHET］、TPA和EG等組分（圖1），水解產(chǎn)物可用于合成新的PET材料［26］或生產(chǎn)其他高附加值產(chǎn)品，如柴油級燃料、多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic，PCA）、沒食子酸（gallic acid，GA）、鄰苯三酚（pyrogallol，PG）等［27］。Rorrer等［28］利用己二烯二酸、丙烯酸等物質(zhì)與PET部分結(jié)構(gòu)產(chǎn)物BHET聯(lián)合制造了新型高性能玻璃纖維增強(qiáng)塑料。總之，PET水解酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用降低了PET回收再利用的成本，促進(jìn)了PET循環(huán)可持續(xù)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。

圖1 PET酶解示意圖[6]Fig. 1 The schematic diagram of PET enzymatic hydrolysis[6]

盡管許多PET水解酶已被表征，但PET分子量高、結(jié)晶度高、疏水性強(qiáng)等特性限制了酶解效率［29］，加之PET水解酶本身催化效率低、穩(wěn)定性和生產(chǎn)性能差，難以滿足工業(yè)需求，因此采用酶工程方法提高PET水解酶的降解性能。定向進(jìn)化、半理性設(shè)計等傳統(tǒng)的分子設(shè)計方法需要依賴高通量篩選技術(shù)，然而在對酶的進(jìn)化機(jī)制、結(jié)構(gòu)等基礎(chǔ)信息了解有限的情況下，利用人工智能分子設(shè)計方法輔助蛋白質(zhì)工程，比傳統(tǒng)方法更加高效、準(zhǔn)確［30］。

2 PET水解酶

2.1 脂肪酶

脂肪酶作為一類多功能酶，不僅能水解長鏈甘油三酯生成脂肪酸和甘油，還參與氨解和醇解［31］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些脂肪酶對PET纖維或者薄膜有降解作用。這些脂肪酶具有相同的α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)、 Ser-His-Asp催化三聯(lián)體和氧陰離子空穴結(jié)構(gòu)，活性中心因埋藏在蓋子結(jié)構(gòu)域中，不利于與底物結(jié)合，因此影響水解活性［32］。據(jù)報道，Thermomyces lanuginosusLipase （TlLip）具有PET水解能力，但與角質(zhì)酶相比水解產(chǎn)物的釋放量要低［33］。Candida antarcticaLipase B（CaLipB或CALB）不能直接用于降解PET，但對BHET和MHET有較高活性，Carniel等［22］利用CaLipB與Humicola insolensCutinase（HiCut）協(xié)同作用使得從PET到TPA的回收率提高了7.7倍。

2.2 角質(zhì)酶

角質(zhì)酶屬于絲氨酸水解酶類，結(jié)構(gòu)中含有的α螺旋、β折疊和催化三聯(lián)體（Ser-His-Asp），其主要作用于中短鏈酯類（C8-C10）［34-35］。角質(zhì)酶與脂肪酶同源性很高，但仍有獨特之處，一是沒有蓋子結(jié)構(gòu)域，催化位置直接暴露在溶劑中［36］，二是氧陰離子空穴不是配體結(jié)合引導(dǎo)形成的，而是預(yù)先形成的，有助于陰離子底物復(fù)合物的穩(wěn)定［37］?；诖耍琴|(zhì)酶成為被研究最多的PET水解酶，目前發(fā)現(xiàn)的主要有以下幾種：LC-cutinase（LCC）、Saccharomonospora viridisAHK190 cutinase（SvCut190或Cut190）、Thermobifida fuscaKW3cutinase 2（TfCut2）、Humicola insolenscutinase （HiCut或HiC）、Fusarium solani pisicutinase （FsCut或FsC）和Pseudomonas mendocinacutinase （PmCut或PmC）［2］。其中LCC是Sulaiman等［23］從枝葉堆肥中分離出來一種典型角質(zhì)酶，它對多種脂肪酸單酯都具有水解活性。在最適反應(yīng)條件（pH 8.0、50 ℃）下PET降解率為12 mg·h-1·mg-1酶，且主要降解產(chǎn)物為TPA。LCC與Thermobifida fuscaHydrolases 1和2（BTA1 and BTA2）、Fusarium solani pisiCutinase （FsC）、Ideonella sakaiensisPETase （IsPETase）相比，具有更高的PET水解活性和熱穩(wěn)定性［38］。

2.3 IsPETase

2016年Yoshida等［25］從PET碎片污染的環(huán)境樣本中分離到一種能在PET薄膜上生長的細(xì)菌，命名為Ideonella sakaiensis201-F6，這種細(xì)菌可以同化PET作為主要的碳源及能源，從中分離并鑒定出發(fā)揮PET水解功能的酶為IsPETase和IsMHETase（簡稱PETase和MHETase）。兩者協(xié)同作用降解PET，通過高效液相色譜檢測發(fā)現(xiàn)MHET為主要產(chǎn)物，TPA和BHET為次要產(chǎn)物。在30 ℃和pH 7的條件下，PETase對PET有較高的活性，對脂肪酸酯的活性較低，這表明PETase對PET具有偏好性。其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的α/β水解酶折疊，在活性中心發(fā)現(xiàn)一個由Ser160、His237和Asp206殘基組成的保守催化三聯(lián)體［39］。與其他PET水解酶相比，PETase具有以下特點［39-41］。①PETase具有兩個二硫鍵——DS1（Cys203-Cys239）和DS2（Cys273-Cys289），其中DS2在已知的PET水解酶中是保守的，而DS1是PETase特有的。DS1位于活性中心附近，對于催化活性和活性中心的完整性具有重要作用。②PETase的β8-α6環(huán)與其他酶相比多出3個殘基（Asn244、Ser245和Asn246），導(dǎo)致底物結(jié)合袋的裂縫被擴(kuò)大，從而擴(kuò)大了酶與大分子底物的結(jié)合空間。③Trp185的3種構(gòu)象的轉(zhuǎn)換與Ser214形成的較小空間位阻都導(dǎo)致底物結(jié)合口袋變大，以適應(yīng)PET大分子。

IsPETase被認(rèn)為是在溫和條件下降解PET最活躍的酶［25］，盡管一些研究表明這種酶的穩(wěn)定性和活性都有所改善，但即使在中等溫度下穩(wěn)定性仍然是一個問題。

2.4 IsMHETase

由以上可知，Ideonella sakaiensis201-F6還表達(dá)了另一種酶IsMHETase用來催化PETase啟動后的PET降解步驟，可以將MHET降解為EG和TPA，后來的研究證實IsMHETase對BHET沒有活性［25，42］。對IsMHETase結(jié)構(gòu)的研究表明，采用α/β-水解酶折疊，屬于絲氨酸水解酶，蓋子結(jié)構(gòu)域包含活性位點和Ca2+結(jié)合位點［42-43］。催化三聯(lián)體由Ser225、His528和Asp492組成，氧陰離子孔由Gly132和Glu226的主鏈酰胺氮原子組成，并含有5個二硫鍵（Cys51-Cys92、Cys224-Cys529、Cys303-Cys320、Cys340-Cys348和Cys577-Cys599），這些二硫鍵在單寧酶家族成員中較為保守［44］。

3 PET水解酶傳統(tǒng)分子設(shè)計

想要實現(xiàn)PET水解酶的工業(yè)化應(yīng)用，首先要提高PET水解酶的催化活性，還要考慮PET材料本身的表面疏水性、結(jié)晶度、玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度（Tg）等特性。聚酯在空氣中的Tg約為80 ℃，在酶解反應(yīng)過程中，溶劑分子在聚合物鏈內(nèi)的擴(kuò)散削弱了氫鍵，使得碎片的取向隨機(jī)化，增加了整體的靈活性，聚酯的Tg降低至65 ℃左右［45-46］。當(dāng)高于玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度時，將產(chǎn)生柔性的、靈活的、更易接受酶攻擊的聚酯鏈。因此，人們相信通過提高酶解反應(yīng)的溫度，可以實現(xiàn)更快的PET降解速度，這要求酶具有較高的熱穩(wěn)定性［47］。

3.1 修飾活性中心與底物結(jié)合口袋

3.1.1改變底物結(jié)合口袋空間大小 酶與底物的識別和結(jié)合是酶發(fā)揮作用的關(guān)鍵，活性部位和底物結(jié)合口袋需要足夠的空間來容納底物，因此擴(kuò)大底物結(jié)合空間是酶工程的常用方法。增大底物結(jié)合口袋的方法之一是將部分氨基酸突變?yōu)閭?cè)鏈更小的丙氨酸。Joo等［39］研究發(fā)現(xiàn)PETase第280位的精氨酸是一個極性氨基酸，在三維結(jié)構(gòu)中呈凸起形狀，可能會阻礙PET底物的穩(wěn)定結(jié)合，用Ala取代了Arg280后，PETaseR280A的PET膜降解活性在18 h和36 h分別比PETase野生型提高了22.4%和32.4%。觀察PETaseR280A晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，R280A通過提供疏水和非凸起的裂隙擴(kuò)展了Ⅱc亞基，說明小的疏水殘基可能會利于更長底物的穩(wěn)定結(jié)合，從而導(dǎo)致PETase活性的提高。Araújo等［48］創(chuàng)建的突變體L81A、N84A、L182A、V184A和L189A，擴(kuò)大了角質(zhì)酶FsC的活性部位。在這些突變體中，L81A和L182A的活性分別增加了4倍和5倍。Silva等［49］利用定點突變的方法，對來自Thermobifida fusca的角質(zhì)酶Tfu_0883進(jìn)行改造，構(gòu)建了單突變體I218A和雙突變體Q132A/T101A。該突變擴(kuò)大了催化空間，增加了疏水性，單突變體和雙突變體都表現(xiàn)出相當(dāng)高的水解效率。Kawabata等［50］設(shè)計突變體Q138A修飾Cut190以擴(kuò)大結(jié)合口袋的額外空間，得到的突變體酶活性顯著提高。

擁有較大的活性中心裂縫的PET水解酶其催化活性并不一定高，有時適當(dāng)縮小反而會提高活性。Austin等［40］對比PETase與同源角質(zhì)酶的晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，PETase具有更寬的活性中心裂縫，通過突變兩個活性中心殘基（S238F和W159H）來縮小裂縫范圍。S238F為底物結(jié)合提供了新的π-π堆積和疏水相互作用使底物結(jié)合作用增強(qiáng)，W159H縮小了側(cè)鏈，使長鏈PET聚合物結(jié)合到更深的活性中心通道中。實驗發(fā)現(xiàn)該突變體不僅改善了PET的降解能力，還能降解PET替代品聚2，5-呋喃二甲酸乙二醇酯（polyethylene 2，5-furandicarboxylate，PEF）。以上研究表明，設(shè)計并改變底物口袋空間大小可以提高PET水解酶的催化能力和專一性。

3.1.2相似結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基交換TfCut2與LCC是兩種具有較高序列和結(jié)構(gòu)相似性的PET水解酶，它們位于蛋白質(zhì)表面的結(jié)合凹槽中都有暴露的活性位點，將TfCut2中參與底物結(jié)合的氨基酸殘基與LCC相對應(yīng)的氨基酸殘基進(jìn)行交換，獲得了具有更高PET水解活性的突變體G62A和雙點突變體G62A/I213S，水解50 h后，兩種突變體都導(dǎo)致PET膜的重量損失超過42%，與野生型TfCut2相比增加了2.7倍。其中G62A相較于野生型水解速率常數(shù)提高了4倍，底物結(jié)合常數(shù)降低了1.5倍［51］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，PETase的一個底物結(jié)合殘基W185具有擺動的構(gòu)象，該氨基酸所在的β6-β7環(huán)高度靈活，經(jīng)過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)PETase存在特有的兩個氨基酸S214和I218，而在其他同源酶中對應(yīng)的分別是His和Phe。較小的側(cè)鏈為W185的擺動提供了空間，多種同源酶的Ser/Ile雙點突變提高了PET降解活性［52］。

3.1.3其他修飾 Furukawa等［53］在PETase底物結(jié)合口袋中的陽離子氨基酸位置引入單一的陰離子氨基酸突變，如R53E、R90E和K95E，這些突變在陰離子表面活性劑的輔助下能夠有效地促進(jìn)和加速PET的水解。表面活性劑有助于PET表面向酶活性部位的排列。雖然降解過程在30 ℃下進(jìn)行，但降解效果與70 ℃甚至更高溫度下使用耐熱酶的降解效果相當(dāng)。Ma等［54］探索了PETase底物結(jié)合槽周圍的6個關(guān)鍵殘基，R61A、L88F和I179F突變體對PET的親和力比野生型分別增加了1.4、2.1和2.5倍。在PETase活性部位、底物結(jié)合口袋或參與穩(wěn)定活性部位剛性的殘基上發(fā)生突變，產(chǎn)生了幾個突變體（Y58A、W130A、W130H、A180I和S185H），使水解物的產(chǎn)量提高了3倍［55］。

3.2 添加新的化學(xué)鍵

Son等［56］在先前工作產(chǎn)生的PETaseR280A上增加額外的氫鍵來穩(wěn)定分子，獲得三點突變體S121E/D186H/R280A，研究表明，三點突變體（S121E/D186H/R280A）對PET的降解率是天然蛋白的13.9倍，是先前建立的R280A的2.3倍。

鈣離子結(jié)合酶的高熱穩(wěn)定性是由于結(jié)合酶的結(jié)構(gòu)波動比未結(jié)合酶小引起的［57］。二價金屬離子結(jié)合部位的引入對提高水解酶熱穩(wěn)定性和催化性能起著至關(guān)重要的作用。鈣離子的存在改善了酶結(jié)構(gòu)的巨大構(gòu)象變化，使底物結(jié)合槽保持在開放的構(gòu)象中，并促進(jìn)了酶與底物的結(jié)合［58］。在聚酯水解酶TfCut2上引入二硫鍵取代其鈣結(jié)合部位。由此產(chǎn)生的變異體的熔點增加到94.7 ℃（野生型TfCut2：69.8 ℃），其半失活溫度增加到84.6 ℃（TfCut2：67.3 ℃）［59］。差示掃描熒光實驗表明，LCC在鈣離子存在下是熱穩(wěn)定的。為了避免補充鹽，Tournier等［38］通過酶工程提高LCC的活性和熱穩(wěn)定性。采用二硫鍵取代二價金屬鍵的替代策略，獲得了熱穩(wěn)定高且不依賴于鈣離子的LCC突變體D238C/S283C，Tm值上升9.8 ℃，WCCG（F243W/D238C/S283C/Y127G）和ICCG（F243I/D238C/S283C/Y127G）分別在10.5 h和9.3 h內(nèi)將90%以上的PET解聚成單體。這些研究結(jié)果表明，用二硫鍵取代鈣離子結(jié)合部位可以得到高效的、不依賴鈣離子的耐熱聚酯水解酶。

3.3 修飾表面氨基酸

經(jīng)過建模和結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，來自Thermobifida cellulosilyticaDSM44535的角質(zhì)酶Thc_Cut1和Thc_Cut2兩種酶活性口袋附近表面的靜電和疏水性質(zhì)不同是導(dǎo)致它們降解效率不同的主要原因。選擇Thc_Cut2活性位點外表面區(qū)域的氨基酸進(jìn)行了定點突變，這些突變體對PET的水解效率遠(yuǎn)低于Thc_Cut1，但與Thc_Cut2相比，攜帶R29N和A30V的突變體在可溶性底物上表現(xiàn)出較高的比活和Kcat/Km值。酶表面帶正電的精氨酸（Arg19和Arg29）突變?yōu)椴粠д姷慕z氨酸和天冬酰胺，顯著提高了3PET和PET的水解活性。相反，不帶電的谷氨酰胺（Glu65）突變?yōu)閹ж?fù)電荷的谷氨酸會完全失去PET薄膜水解活性［60］。這些發(fā)現(xiàn)清楚地表明，表面性質(zhì)（即位于蛋白質(zhì)表面活性位點外的氨基酸）在PET水解中發(fā)揮重要作用。

3.4 降低產(chǎn)物抑制

在PET降解過程中，PET水解酶釋放中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物，包括BHET、MHET、TPA和EG，這些降解產(chǎn)物會抑制水解過程［61］。為緩解產(chǎn)物抑制，Barth等［62］使用含TfCut2的超濾膜反應(yīng)器降解PET薄膜，超濾可溶的水解物（TPA、MHET和BHET），以最大限度地減少對酶的產(chǎn)物抑制，將生物催化水解率提高70%。另一個有希望緩解產(chǎn)物抑制的策略是建立雙酶體系。以脂肪酶CaLipB和角質(zhì)酶HiCut為例，CaLipB的加入將BHET全部轉(zhuǎn)化為TPA，解決了HiCut的產(chǎn)物抑制，兩種酶的組合顯示出協(xié)同作用，使PET完全解聚為TPA［22］。此外，通過蛋白質(zhì)工程來減少酶和水解物之間的相互作用是一種很有前途的策略。Wei等［51］設(shè)計并構(gòu)建了TfCut2單點突變體G62A，結(jié)合常數(shù)較野生型降低了約5.5倍，主要是因為Ala的空間位阻比Gly低，解除了MHET對TfCut2的產(chǎn)物抑制。

4 人工智能分子設(shè)計在PET水解酶研究中的應(yīng)用

定向進(jìn)化受到自然進(jìn)化的啟發(fā)，通過反復(fù)突變與篩選來積累所需功能的有益突變，因此對高通量篩選技術(shù)有較強(qiáng)的依賴性，需要花費大量的時間和精力［63-64］。人工智能通過從先前的篩選中學(xué)習(xí)表征變體的屬性并使用所學(xué)習(xí)的信息來選擇可能具有所需功能的新序列，從而減少迭代次數(shù)，可用來指導(dǎo)定向進(jìn)化［65］。人工智能輔助的蛋白質(zhì)工程已經(jīng)解決了許多問題，如提高催化活性、預(yù)測底物專一性和溶解度等［66］。人工智能技術(shù)為研究PET水解酶帶來了新方案。

4.1 提高熱穩(wěn)定性

到目前為止，對于提高PET水解酶熱穩(wěn)定性的研究是以一種合理而又隨意的方式進(jìn)行的，即操作者對酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，根據(jù)經(jīng)驗或半經(jīng)驗的方法選擇要突變的殘基，這種方法不能提出多個氨基酸的突變體。據(jù)報道，某些氨基酸突變同時應(yīng)用會發(fā)生拮抗作用，導(dǎo)致性能低于野生型。這種現(xiàn)象被稱為上位效應(yīng)，阻礙了酶在較高溫度下保持水解能力或與晶體底物親和力的充分優(yōu)化［67-68］。

崔穎璐等［69］開發(fā)了蛋白質(zhì)工程的貪婪累積策略（GReedy accumulated strategy for protein engineering，GRAPE），并將其應(yīng)用于PETase的設(shè)計，提高了酶的穩(wěn)定性。該方法結(jié)合了系統(tǒng)的聚類分析和有益突變的貪婪積累，根據(jù)位置、Tm值的變化、與Ser160的距離（催化三聯(lián)體的水解性殘基）、相對于PET結(jié)合區(qū)的位置以及可能的穩(wěn)定機(jī)制（H鍵的形成、疏水相互作用）和熵變來表征21個候選分子。得到的十點突變體DuraPETase熱穩(wěn)定性得到大幅度改善，Tm比野生型提高了31 ℃，對于半結(jié)晶度PET底物（30%），37 ℃處理72 h的產(chǎn)物得率是野生型的100倍。

三維自我監(jiān)督卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)MutCompute使用PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中19 000多條序列進(jìn)行訓(xùn)練，在平衡蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上學(xué)習(xí)氨基酸的局部化學(xué)微環(huán)境，因此可以預(yù)測出野生型蛋白質(zhì)中不適合局部環(huán)境的氨基酸位置。Lu等［56］使用MutCompute獲得了IsPETase野生型和ThermoPETase（晶體結(jié)構(gòu)PDB 5XJH和6IJ6）中20個典型氨基酸在每個位置結(jié)構(gòu)擬合的離散概率分布結(jié)構(gòu)，以確定野生型氨基酸殘基與潛在替代相比不太適合的位置。通過催化活性（酯酶活性和塑料降解率）和熱穩(wěn)定性（蛋白質(zhì)熔化溫度Tm）來篩選出有益突變體，進(jìn)一步組裝、分析得到FAST-PETase（MutCompute預(yù)測得出的N233K/R224Q/S121E疊加ThermoPETase的D186H/R280A）。與野生型相比，F(xiàn)AST-PETase在30～50 ℃和一系列pH條件下表現(xiàn)出優(yōu)越的PET水解活性，1周內(nèi)可水解51種不同熱成型的且未經(jīng)預(yù)處理的PET，還可以在50 ℃下解聚未經(jīng)預(yù)處理的商用水瓶的無定形部分和經(jīng)過熱預(yù)處理的水瓶［70］。

4.2 提高降解效率

目前尚不清楚IsPETase通過自然選擇進(jìn)化到什么程度，但由于自然界中PET僅有數(shù)十年的短暫歷史，所以該酶理論上沒有充分發(fā)揮進(jìn)化潛力的時間。突變設(shè)計工具Premuse是基于自然序列進(jìn)化規(guī)律開發(fā)的，使用成對對比來構(gòu)建理想比對，通過計算得到的位置特異性氨基酸概率來定量選擇首選突變。利用Premuse從1 486條IsPETase同源序列中篩選出10個單點突變體，優(yōu)選出W159H和F229Y這兩個較穩(wěn)定的突變位點后獲得雙點突變體W159H/F229Y的酶促性能提高更顯著。在40 ℃降解24 h，非晶態(tài)PET的降解活性比野生型提高了近40倍。Premuse充分利用了同源蛋白序列所包含的進(jìn)化信息，成功率高，工作量小，是一種高效的蛋白質(zhì)工程方法［71］。

隨著人工智能技術(shù)的發(fā)展和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器的普及，對于無計算機(jī)基礎(chǔ)的研究者，可以通過在線服務(wù)器進(jìn)行人工智能分子設(shè)計。Pross（Protein Repair One-Stop Shop）就是一個可以在線訪問的服務(wù)器，輸入蛋白質(zhì)的序列或結(jié)構(gòu)信息就可以預(yù)測出提高熱穩(wěn)定性的突變體序列［72］。Rennison等［73］將PETase活性部位、氧陰離子空穴和結(jié)合殘基固定以防止突變，使用Pross服務(wù)器對同源性超過35%和覆蓋率超過75%的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)多序列比對，應(yīng)用Rosetta計算突變掃描，最終預(yù)測出51種突變體。通過與3種高效耐熱的PET水解酶（TfCut2、Cut190和LCC）進(jìn)行對比，確定了3個突變體：S125R、S136E和T270Q進(jìn)行實驗表征，其中S136E的活性增加顯著，比野生型增加了3.3倍。

5 展望

目前，研究學(xué)者利用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)工程和人工智能分子設(shè)計方法有效提高了PET水解酶的降解效率和熱穩(wěn)定性，推動著PET生物降解的綠色高效發(fā)展。然而，PET生物降解研究還處于初步階段，若想實現(xiàn)PET循環(huán)經(jīng)濟(jì)，首先要解決高結(jié)晶度PET降解難的問題，應(yīng)繼續(xù)篩選挖掘PET降解微生物和關(guān)鍵酶基因。隨著生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，創(chuàng)建了越來越多的PET水解酶特異性搜索算法［74-75］，這些技術(shù)手段可以加快PET降解微生物以及新酶基因的發(fā)現(xiàn)。此外，還應(yīng)關(guān)注PET完全降解與單體產(chǎn)物有效回收問題。PET不完全降解產(chǎn)物BHET、MHET等不能直接回收生成新的PET，雙酶體系可將低聚產(chǎn)物及時轉(zhuǎn)化，緩解產(chǎn)物抑制的同時生成更多的TPA產(chǎn)物?？傊?，PET水解酶具有很高的應(yīng)用前景，開發(fā)高結(jié)晶度PET降解酶并創(chuàng)新高附加值產(chǎn)品轉(zhuǎn)化途徑，有望在不久的將來建立更加高效的PET生物降解系統(tǒng)。