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    茯苓多糖組成結構及生物活性研究進展

    2023-02-12 03:03:04劉珮瑤
    食品科學 2023年1期
    關鍵詞:茯苓多糖活性

    劉珮瑤,王 琨,梁 杉,黎 攀,杜 冰

    (華南農業(yè)大學食品學院,廣東 廣州 510642)

    茯苓是多孔菌科茯苓屬真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核,常寄生在馬尾松或赤松的根上。茯苓性平,味甘、淡,歸入心、肺、脾、腎經,入藥具有滲濕利水,益脾和胃、安魂養(yǎng)神的功效[1],是重要的藥食同源原料。茯苓主要活性成分有茯苓多糖、三萜類化合物,還含蛋白質、氨基酸、脂肪酸、茯苓酸、膽堿等其他成分[2]。大部分茯苓多糖是水溶性較差的堿溶性多糖,活性低且?guī)缀鯚o抗腫瘤活性[3],而改性后的茯苓多糖水溶性和生物活性提高,具有調節(jié)免疫、抗氧化、抗炎抑菌、祛濕消腫、保肝健脾、抗抑郁等多方面的生物活性[4],是保健品和藥品開發(fā)的重要原料。因此,茯苓多糖的構效關系以及如何提高茯苓多糖生物活性等成為研究熱點。本文總結茯苓多糖的活性機制,探討茯苓多糖結構和活性的關系,以期為茯苓多糖的進一步研究、開發(fā)和應用提供思路。

    1 茯苓多糖的結構研究

    1.1 茯苓多糖的化學結構

    茯苓多糖初級結構研究已比較成熟,許多結構研究揭示了茯苓多糖的分子質量、單糖組成、糖環(huán)類型、糖苷鍵類型、糖鏈末端及分支組成等特征。但多糖復雜的空間結構還難以揭示,大多數表征方法(如原子力顯微鏡、電子顯微鏡、X射線衍射法(X-ray diffraction,XRD)、圓二色光譜法和剛果紅法[5])只能確定其基本特征。測定多糖的特性黏度、旋光度、重均分子質量等參數,通過理論算法可以分析多糖鏈剛性及在溶液中的構象[6]。

    茯苓多糖來源于茯苓的子實體、菌絲和發(fā)酵液,液體發(fā)酵分泌到培養(yǎng)基中的多糖稱為胞外多糖,從子實體和菌絲提取的多糖稱為胞內多糖[7]。這些多糖根據單糖組成不同可分為兩類,一類為含有少量或不含1→6和1→2支鏈的β-(1→3)-D-葡聚糖,水溶性較差,占茯苓菌核的93%[8],分子質量在2.33~4486.00 kDa。另一類是以葡萄糖(glucose,Glu)為主,兼有果糖(fructose,Fru)、阿拉伯糖(arabinose,Ara)、木糖(xylose,Xyl)、半乳糖(galactose,Gal)、甘露糖(mannose,Man)的雜多糖,其水溶性良好[9],分子質量在10.6~208.0 kDa。此外,茯苓多糖含量是茯苓品質評價的主要依據,與茯苓的部位、產地、炮制和干燥方式密切相關,但在這些影響因素下茯苓多糖的化學結構和活性差異并沒有得到深入研究。因此,完善茯苓評價標準,加強對不同產地、來源和加工方式茯苓多糖的結構研究意義重大。

    茯苓多糖在不同溶劑和條件下溶解性和聚集情況不同,高級結構會存在差異。茯苓葡聚糖能溶于堿液和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),在0.5 mol/L NaOH溶液和0.2 mol/L尿素溶液中呈柔性線型鏈[10]。茯苓多糖經過改性后在水溶液中可形成三螺旋、球狀和類球狀等高級結構。Liu Feng等[11]利用剛果紅法進行研究,發(fā)現兩種羧甲基茯苓多糖(carboxymethyl pachymaran,CMP)均為三螺旋結構,通過高分辨率的透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察,在超純水中CMP-1呈尺寸不一的不規(guī)則球形,CMP-2呈規(guī)則的球形構象。茯苓多糖在0.25 mol/L的LiCl/DMSO中,40 ℃時呈現部分聚集形態(tài),80 ℃時以單鏈形式存在,而根據Mark-Houwink方程可知,在DMSO中茯苓多糖可能呈隨機線圈狀[12]。多糖構象如三螺旋結構在不同極性溶劑、溫度和遞送體系等因素下的組裝聚集或變性解旋會導致其生物活性改變,明確這些因素如何導致多糖生物活性產生差異是未來活性多糖研究的趨勢之一,而茯苓多糖相關方面的研究仍處于起步階段。因此,明晰不同介質中茯苓多糖的結構變化和活性變化是其成功應用于食品、保健品和藥品的關鍵。

    1.2 茯苓多糖的結構改性

    水溶性茯苓多糖具有抗腫瘤、抗炎等活性,但含量極低且提取困難,而茯苓中堿溶性多糖β-(1→3)-D-葡聚糖含量最高,可水溶性差、生物活性低,幾乎無抗腫瘤活性[8],這使得茯苓堿性多糖結構改性成為研究熱點。

    茯苓多糖化學改性常見的是羧甲基化、硫酸酯化,還包括磷酸化、阿魏酸化[8]和2,2,6,6-四甲基哌啶-氮-氧化物(2,2,6,6-tetramethyl-1-1piperidinyloxy,TEMPO)/NaBr/NaClO體系對茯苓多糖進行氧化降解[13]。Wang Yifeng等[14]對茯苓堿性多糖(分子質量123 kDa)C2、C4、C6位羥基進行5 種化學修飾,其中硫酸化茯苓多糖分子質量降低至38 kDa,羧甲基化茯苓多糖分子質量升高至189 kDa,這兩種多糖不同位號碳原子的取代度(degree of substitution,DS)依次為C6>C4>C2,二者在水溶液中溶解性良好,以相對膨脹鏈形式存在,鏈剛度有所提高。但化學改性會產生污染環(huán)境的廢料廢液,且化學殘留難以去除,存在極大的安全隱患。因此,生物修飾和物理改性逐漸成為研究熱點。

    生物修飾包括發(fā)酵法和酶解法。茯苓液態(tài)發(fā)酵可解決傳統(tǒng)培植時間長、松材消耗大的問題,更適合工業(yè)化生產[15]。廖彥[16]通過單因素試驗優(yōu)化茯苓液態(tài)發(fā)酵條件,確定了合成茯苓多糖的培養(yǎng)基,如碳源、氮源、金屬離子、輔助因子組成及配比。此外,培養(yǎng)基組成不同可影響茯苓多糖的結構特性,Jin Yong等[17]通過發(fā)酵獲得了10 種水溶性多糖,發(fā)現玉米漿培養(yǎng)基發(fā)酵的茯苓多糖能夠比麩皮發(fā)酵茯苓多糖結合更多的蛋白質,Man和Gal含量更高。茯苓多糖的酶法修飾主要采用β-葡聚糖酶,Wu Peng等[18]用黑曲霉中的β-葡聚糖酶降解特定糖苷鍵,獲得較低分子質量的多糖或寡糖,顯著提高了多糖的產率。

    茯苓多糖物理改性方法主要有超微粉碎、輻照、超聲波、蒸汽爆破等方法。梅光明等[19]對茯苓粉和茯苓多糖進行超微粉碎,發(fā)現機械剪切力使堿溶性茯苓多糖主鏈或側鏈部分被打斷,導致分子質量降低,產生可溶性多糖,提高多糖溶出率。龔志華[20]采用60Co輻照茯苓,降解產生的水溶性多糖的隨輻照劑量增加而顯著增加,其中1000 kGy處理后水溶性多糖得率最高。近年來,鮮見新的和具有突破性的新技術應用到茯苓多糖的提取和改性中。

    現有文獻中茯苓多糖的結構特征及生物活性如表1所示。

    表1 茯苓多糖的結構特征Table 1 Structural information of P.cocos polysaccharides

    續(xù)表1

    2 茯苓多糖的生物活性

    2.1 抗腫瘤活性

    癌癥治療包括手術、化療、放療法等,會產生器官衰竭、免疫力低下等毒副作用,增加癌癥的治療難度[5]。茯苓多糖可對抗多種癌,毒性弱且成本低,能激活機體免疫應答,增強對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視,是極具潛力的免疫療法[47]。茯苓多糖H11能夠顯著抑制皮下肉瘤S180而對腹水S180抑制不明顯,通過增強宿主的防御機制發(fā)揮抗腫瘤活性[48]。羧甲基茯苓多糖可以激活H22荷瘤小鼠的巨噬細胞,提高淋巴細胞轉化率及自然殺傷(natural killer,NK)細胞殺傷癌細胞的活性[49]。

    茯苓多糖直接作用于腫瘤細胞,改變腫瘤細胞信號傳導途徑中關鍵蛋白和酶的表達,從而達到抑制腫瘤細胞增殖、分化、侵襲和誘導其凋亡的目的。茯苓多糖能夠增強白血病細胞HL-60中磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(phosphotyrosyl protein phosphatase,PTPP)的活力,減弱TPK的活力,減緩癌細胞增殖分化[50]。同時,茯苓多糖對腫瘤細胞凋亡的兩條主要途徑均有調控作用,CMP對HepG2肝癌細胞的抑制作用呈濃度依賴效應,100 μg/mL的CMP肝癌細胞抑制率能達到76%,使線粒體通路的胱天蛋白酶(Caspase)-8表達增加,降低抗凋亡蛋白B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和促凋亡蛋白Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的比值,促進線粒體內膜釋放細胞色素c,激活Caspase-3。死亡受體通路的Fas分子、Fas配體(Fas ligand,FasL)和Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated protein with death domain,FADD)的轉錄水平均增加,級聯激活Caspase-3,促使癌細胞凋亡[51]。值得關注的是,研究表明Janus激酶(Janus kinase,JAK)/信號轉導和轉錄激活因子(signal transducer and activators,STAT)通路以及細胞外信號調節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)通路的異常激活也與癌細胞增殖分化、侵襲、凋亡密切相關。茯苓多糖以劑量依賴效應下調高糖誘導下乳腺癌MCF-7細胞的JAK/STAT通路,其中高劑量抗增殖和誘導凋亡的效果最好[52]。唐恩紅[53]發(fā)現茯苓多糖下調ERK1/2的磷酸化,宮頸癌HeLa細胞阻滯于G2/M期,降低癌細胞克隆形成能力和遷移率。

    減輕癌癥毒性也是茯苓多糖抗腫瘤的機制之一,抑制腫瘤復發(fā)轉移還有減輕癌癥治療過程中化療、放療、藥物引起的器官損傷。茯苓發(fā)酵液多糖干預轉化生長因子β受體(transforming growth factor β receptor,TGFβR)信號通路,降低胃癌腫瘤移植小鼠的TGFβRI和轉移蛋白Slug的表達,減少局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的磷酸化,顯著抑制肺癌CL1-5細胞的轉移和侵襲[34]。茯苓多糖降低宮頸癌HeLa細胞遷移蛋白如基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP-9)和血管內皮生長因子(vascular endotheliar growth factor,VEGF)A的表達,抑制新生血管的形成,不利于腫瘤細胞的遷移、浸潤和轉移[53],人乳腺癌MDA-MB-231細胞中與癌變密切相關的關鍵蛋白核基質結合區(qū)結合蛋白1(special AT-rich sequence-binding protein,SATB1)表達也顯著降低,癌細胞侵襲轉移明顯減少[54]。在CT26結腸癌荷瘤小鼠模型中,CMP可能通過核因子(nuclear factor,NF)-κB、核因子紅細胞系2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)-抗氧化反應原件(antioxident response element,ARE)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/p38途徑來減輕5-氟尿嘧啶治療引起的結腸細胞炎癥和氧化損傷,恢復腸道菌群多樣性[55]。茯苓多糖抗腫瘤活性的作用機制及效果如圖1所示。

    圖1 茯苓多糖抗腫瘤活性機制Fig.1 Anti-tumor mechanism of P.cocos polysaccharides

    2.2 免疫調節(jié)活性

    CMP激活以巨噬細胞為中心的固有免疫,增加RAW264.7巨噬細胞活化標志分子白細胞分化抗原(cluster of differentiation,CD)86表達,刺激巨噬細胞向具有抑炎作用的M2型極化[56]。目前發(fā)現茯苓多糖調節(jié)巨噬細胞免疫調節(jié)相關通路主要有3 條。首先,茯苓菌核多糖提高巨噬細胞膜受體CD14、Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR 4)、補體受體3(complement receptor 3,CR3)和p38激酶活性,通過NF-κB/轉錄因子Rel蛋白和p38激酶促進誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表達,從而增加NO釋放[57],還能調節(jié)Ca2+/蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)/p38/NF-κB通路,提高巨噬細胞鈣水平、p38及NF-κB的轉錄和翻譯水平,進而激活PKC,增加NO、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α、白細胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6的釋放[58]。同時,茯苓堿性多糖CMP33又能抑制脂多糖誘導巨噬細胞產生過量的炎癥介質,降低NO、IL-6、TNF-α和IL-1β釋放水平[45]。TLR 4信號通路是茯苓多糖調節(jié)免疫的重要通路,顯著增加TLR4、髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)、腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumor necrosis factor associated factor 6,TRAF-6),通過級聯反應提高NO、IL-2、IL-6、IL-17A、TNF-α和干擾素(interferon,IFN)-γ的水平來加強體內外的免疫調節(jié)[59]。

    在特異性免疫方面,茯苓多糖能夠促進T淋巴細胞增殖,調節(jié)T淋巴細胞分泌細胞因子,進而刺激NK細胞、輔助性T細胞(T helper cell,Th)和殺傷T細胞(cytotoxic T cell,Tc)發(fā)揮更強的細胞免疫作用[60],還會促進B淋巴細胞合成免疫球蛋白,增強機體體液免疫[9]。茯苓多糖已被用作炭疽、狂犬病、甲型流感病毒H1N1的新型疫苗佐劑[25],與傳統(tǒng)的明礬和鋁佐劑相比能產生更強和持久的體液免疫和細胞免疫反應[15],Liu Kun等[61]發(fā)現茯苓多糖可顯著提高炭疽疫苗免疫小鼠的抗原特異性抗體的水平和親和力,Th2免疫偏倚轉變?yōu)門h 1/Th 2免疫平衡應答,抗原特異性記憶B細胞的頻率增加,促進脾細胞增殖,活化樹突狀細胞。Zhang Weijiao等[62]發(fā)現經含有茯苓多糖佐劑炭疽疫苗免疫的兔子體內,淋巴結的B淋巴細胞和血液中B、T淋巴細胞增加,強烈誘導脾細胞分泌高水平的細胞因子。

    腸道是人體最大的免疫器官,腸黏膜屏障是防止有害物質和細菌侵入機體的第一道防線[63]。近年來研究發(fā)現腸道黏膜免疫系統(tǒng)可能是茯苓多糖發(fā)揮免疫調節(jié)作用的重要靶點。茯苓多糖調整脾虛免疫低下模型小鼠的腸道菌群結構,增加脾和胸腺組織CD3+T、CD 19+B 細胞數量,小腸液分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,SIgA)和小腸組織免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A和閉鎖小帶蛋白1(zonula occluden 1,ZO-1)的表達增加,促進IgG、IgM的表達[64]。茯苓多糖免疫調節(jié)活性的作用機制如圖2所示。

    圖2 茯苓多糖免疫調節(jié)活性機制Fig.2 Immunomodulatory mechanism of P.cocos polysaccharides

    2.3 抗炎活性

    病原體入侵機體時,機體會分泌免疫因子從而提高機體免疫功能,但過度的免疫反應如炎癥反應會對機體自身造成傷害[60],炎癥是影響癌癥、抑郁癥等病理過程發(fā)展的關鍵因素。茯苓多糖對皮下肉芽腫及耳腫[65]、腎炎[66]、結腸炎[67-69]、胰腺炎[70]、非細菌性前列腺炎[33]等均有很好的治療效果。

    炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD)因高發(fā)生率、難治愈、易復發(fā)和致死而漸漸成為中國乃至世界亟待解決的公共健康問題[71],茯苓多糖的抗炎活性為IBD治療提供新思路。茯苓多糖抗結腸炎的機制可能是改善腸道菌群失衡,增加抗炎癥的普雷沃氏菌屬、乳桿菌科和短鏈脂肪酸產生菌的豐度,減少潛在致病菌定植,從而促進腸道屏障恢復[64]。三硝基苯磺酸誘導的大鼠結腸炎模型中,茯苓多糖抑制IL-33/血清可溶性ST2受體(serum soluble ST2 receptor,sST2)信號通路,黏膜損傷細胞和肥大細胞活化數目減少、胰蛋白酶含量減少[67],Liu Xiaofei等[68]還發(fā)現CMP作用于三硝基苯磺酸誘發(fā)的小鼠結腸炎后,結腸組織中MPO活性和MDA含量減少,通過調控潛在的靶向蛋白組和關鍵蛋白代謝保護小鼠結腸炎。CMP干預的TNF-α損傷的人結腸上皮Caco-2細胞中NF-κB、肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)、磷酸化肌球蛋白輕鏈(phosphorylated myosin,p-MLC)信號通路下調,腸道緊密連接蛋白表達加強,從而有效預防結腸炎[69]。上述機制均能抑制促炎因子的產生,同時增加抗炎因子水平,減輕氧化應激和腸道屏障損傷,發(fā)揮抗結腸炎作用。茯苓多糖抗結腸炎機制如圖3所示。

    圖3 茯苓多糖抗結腸炎活性機制Fig.3 Anti-IBD mechanism of P.cocos polysaccharides

    血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)中的炎癥反應、氧化應激和泡沫細胞的形成在動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)誘導的VSMCs氧化應激和炎癥模型中,茯苓多糖通過ERK/Nrf2/HO-1通路降低氧化應激和炎性細胞因子NO、IL-6、TNF-α、環(huán)氧化酶(cyclooxygenase,COX-2)和iNOS,抑制ox-LDL誘導的氧化低密度脂蛋白受體1(low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)上調,減少ox-LDL的攝取和細胞內脂質的積累,抑制VSMCs泡沫細胞的形成和增殖[72]。在同樣的模型中,茯苓多糖還可以抑制TLR4/NF-κB p65炎癥通路從而治療動脈粥樣硬化[73]。

    2.4 護肝活性

    不良飲食習慣、過度飲酒、藥物和環(huán)境的毒性化學物等因素可能導致肝細胞不同程度的壞死,最終導致脂肪肝、肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等肝病的發(fā)生[74]?,F代藥理學研究證明,茯苓多糖、三萜與醇類等都有護肝功效[75]。異硫氰酸-α-萘酯誘導的大鼠黃疸模型中,高劑量茯苓多糖的退黃作用最佳,能夠顯著降低血清丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶的水平和血清總膽紅素含量,同時顯著提高肝臟免疫功能,降低IL-1β、TNF-αmRNA表達水平,提升IL-4mRNA表達水平[76]。茯苓雜多糖能減輕機體氧化應激來改善肝功能,研究人員利用茯苓雜多糖干預醋酸酚誘導的小鼠肝損傷,結果表明茯苓雜多糖能夠提高SOD和GSH-Px的活力,減少肝組織MDA含量,降低肝細胞炎癥因子TNF-β和TNFsR-I水平和熱休克蛋白90的生物活性[26]。

    茯苓多糖護肝活性由一些細胞凋亡和炎癥應激通路介導,5-氟尿嘧啶誘導小鼠肝臟損傷模型中促凋亡蛋白磷酸化p38和Bax的表達降低,Bcl-2的水平提高,通過MAPK/p38/JNK通路減輕肝細胞的凋亡并增強其抗氧化能力,有效緩解5-氟尿嘧啶引起的肝損傷[77]。茯苓多糖干預醋酸酚誘導的小鼠肝損傷后,免疫熒光染色顯示小鼠肝臟中代謝乳酸和解毒的醛酮還原酶、c-Jun、Bcl-2陽性細胞水平增加,而Bax標記細胞減少,NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白α表達呈劑量依賴性下降,TNF-α、IL-6水平降低,說明茯苓多糖抑制NF-κB通路介導的肝細胞凋亡和炎癥應激[78]。

    在代謝水平上,茯苓多糖可降低毒性化學物的代謝水平和改善肝臟脂質代謝,減輕肝脂肪變性。50~100 mg/kgmb劑量范圍茯苓多糖內能夠逆轉肝臟構成性雄甾烷受體的過表達來抑制細胞色素P4502E1酶活性,降低小鼠肝臟對毒性CCl4的代謝[26]。在水溶性茯苓多糖干預的乙醇誘導酒精性肝脂肪變性小鼠模型中,乳酸脫氫酶、甘油三酯、血清總膽固醇水平減少,單核細胞趨化蛋白1表達減少,激活過氧化物酶增殖物激活受體γ通路,同時調節(jié)腸道菌群,抑制乙醇誘導的真菌過度生長,有效地改善了肝臟炎癥損傷和脂肪堆積[79]。

    2.5 抗抑郁活性

    茯苓是傳統(tǒng)疏肝解郁中草方劑逍遙散[75]、半夏厚樸湯[32]的成分之一,近年的研究證明逍遙散可改善慢性不可預測輕度應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)引起的抑郁行為、腦代謝紊亂和盲腸菌群的異常及氨基酸代謝紊亂[80-81]。茯苓多糖作為其主要活性成分,有協(xié)同戊巴比妥鈉抑制中樞神經系統(tǒng)、安神鎮(zhèn)靜的療效[82]。茯苓多糖抗抑郁的主要機制是降低腦區(qū)炎癥因子水平,調控神經遞質代謝并增強免疫功能。茯苓多糖灌胃的CUMS小鼠中炎癥因子p38、NF-κB和TNF-α的表達量降低,額葉皮質多巴胺(dopmine,DA)和5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的轉換率變慢[38],能協(xié)同厚樸多糖減輕全腦血清素和多巴胺系統(tǒng)功能異常[32]。陳可琢等[83]發(fā)現茯苓酸性多糖抑制CUMS小鼠的NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3炎癥小體通路,降低腦區(qū)IL-1β、IL-18、TNF-α等炎癥因子水平,升高神經遞質DA、5-HT、5-羥吲哚乙酸水平而下調谷氨水平。硫酸化茯苓多糖干預卵巢摘除和CUMS復合誘導的抑郁大鼠后,海馬α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體的亞基谷氨酸受體1的磷酸化水平和功能提高,刺激海馬腦源性神經營養(yǎng)因子和磷酸化cAMP反應原件結合蛋白的表達,顯著減輕海馬神經元損傷,從而發(fā)揮抗抑郁活性[84]。

    2.6 其他活性

    茯苓多糖還有抗氧化、抗衰老、抗疲勞、降糖降脂、調節(jié)泌尿系統(tǒng)、抑菌等多種生理活性。茯苓多糖體外螯合亞鐵離子、清除羥自由基和2,2’-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS)陽離子自由基的能力較強,能保護DNA免受氧化損傷[22],還可上調抗氧化酶T-SOD和Cu-SOD的表達,降低多?;o酶A脫氫酶和單胺氧化酶的活性,減輕細胞氧化損傷,發(fā)揮抗衰老的活性[47]。CMP還可減輕人腎近端小管上皮細胞氧化損傷,抑制草酸鈣晶體的形成來發(fā)揮抗結石的活性[27]。

    茯苓堿性多糖降低糖化血紅蛋白A1c,改善糖耐量和胰島素抵抗,從而降低糖尿病小鼠空腹血糖和自由飲食血糖[35]。茯苓水溶性及水不溶性多糖有調控下焦水濕的功效,能改善腎陽虛下焦水腫大鼠模型的腎功能、促進水的重吸收和脂質的代謝[85]。同樣地,茯苓多糖干預慢性高尿酸大鼠后,減少腎臟尿酸轉運體1表達,促進尿酸排泄,腎臟病理恢復正常水平[86]。CMP對革蘭陽性菌的抑菌能力高于革蘭陰性菌[87]。

    3 茯苓多糖結構和生物活性的關系

    復雜的多糖糖鏈為其結構研究帶來巨大困難的同時也使其能攜帶巨大的生物信息[5]。多糖分子質量、單糖組成、側鏈基團、糖苷鍵類型、分支度及高級構象不同,直接導致多糖的溶解度、電荷性、黏阻力等物理性質發(fā)生改變[8],從而顯著影響其活性作用。針對茯苓多糖結構與活性關系的研究,對其活性提高有很大的指導意義,對藥物和保健食品的開發(fā)至關重要。

    3.1 茯苓多糖抗腫瘤構效關系

    多糖抗腫瘤的典型結構是三螺旋結構,研究表明香菇多糖活性最大的空間構型是三股螺旋構型,具有顯著的抗腫瘤活性[88]。茯苓堿溶性多糖與香菇多糖的化學結構相似,由于支鏈過長和分子質量過高,無抗腫瘤活性,但通過適當地高碘酸氧化和Smith降解β-(1-6)支鏈后具有強烈的抗腫瘤活性,XRD分析表明改性后茯苓多糖己形成三螺旋結構[89]。

    多糖能溶于水是其發(fā)揮生物活性的首要條件,低溶解度、高分子質量及其在溶劑中無序的聚集狀態(tài)是堿溶性茯苓多糖抗腫瘤活性低的關鍵原因。茯苓多糖分別經5 種化學修飾后,結果表明經硫酸化和羧甲基化的茯苓多糖總DS較高,分子質量適中,多糖溶解性和鏈剛度提高,對S-180、MKN-45和SGC-7901腫瘤細胞均有明顯的抑制作用[14]。茯苓菌絲多糖ab-PCM3-I和ac-PCM3-I硫酸酯化,分別得到兩個中等分子質量范圍(2.0h 104~40.0h 104kDa)、水溶性良好和鏈剛度較高的磺化衍生物,抗腫瘤活性顯著增強,體內外抗腫瘤活性遠高于天然α-D-茯苓聚糖[38]。DS和分散系數最高、分子種類更豐富和結構呈緊密類球形的CMP-y1抑制AV3和HeLa腫瘤細胞活性高于線形的CMP-y2和CMP-g,綜合利用價值更高[46]。堿處理能使β-(1→3)-D-葡聚糖的主鏈變短,支鏈數量變少,通過控制不同堿液濃度和處理時間產生7 個茯苓多糖組分,在溶劑中呈球形和類球形分布的CMP1~6抗肝癌活性均高于無規(guī)則線形的CMP7,其中適度堿處理的CMP3抑制增殖效果最好[51]。由此可見,茯苓多糖的化學修飾不僅能改變多糖分子間和分子內氫鍵作用和分子質量,大幅提高其水溶性,還能改變多糖高級構象,產生或增強茯苓多糖的抗腫瘤活性。

    3.2 茯苓多糖免疫調節(jié)構效關系

    多糖的單糖組成和其生物活性有密切的關系。研究人員通過高效液相色譜和正交偏最小二乘分析16 批不同產地茯苓多糖的指紋圖譜,發(fā)現Glu、Gal和Man與小鼠巨噬細胞釋放NO的免疫活性呈正相關且有顯著貢獻,Fuc、氨基葡萄糖、葡萄糖醛酸和Xyl與免疫活性呈負相關[90]。但是這些單糖在精細高級結構中如何形成活性中心,進而影響茯苓多糖活性機理并不明晰。

    茯苓多糖的側鏈基團和鏈的柔韌性對免疫活性的提升起關鍵作用。磷酸茯苓多糖P-PCS3-II的磷酸基使其在水溶液中能夠以輕微伸展的柔性長鏈構象存在,與免疫細胞受體結合的機會增加,對體內肉瘤S-180抑制活性增強,而原PCS3-II無生物活性[91]。多糖的多重修飾可使其具有更優(yōu)良的性質和用途,由PCS3-II羧基化和硫酸化衍生而來的CS-PCS3-II在0.15 mol/L NaCl溶液中以延伸的柔性鏈形式存在,使修飾基團與巨噬細胞受體氫結合和靜電吸引力增加,促進多糖與受體的接觸,刺激巨噬細胞增殖分化,產生比僅硫酸化修飾的PCS3-II更強的免疫反應來殺傷腫瘤[40]。

    3.3 茯苓多糖其他活性構效關系

    龔志華[20]研究發(fā)現茯苓多糖葡聚糖主鏈輻照后主鏈的共價鍵和非共價鍵被打斷,產生了含有羧基、分子質量較小的酸性多糖,其降血糖功能和綜合抗氧化能力增強。Tang Jin等[22]用不同濃度H2O2降解得到3 種的茯苓多糖均具有抗氧化活性和DNA損傷保護能力,其中分子質量適中的茯苓多糖PCP-1螯合鐵離子和保護DNA的能力最強。Wang Nani等[29]比較了熱水提取、超聲輔助提取、酶輔助提取和微波輔助提取的4 種茯苓多糖,結果發(fā)現微波輔助提取的茯苓多糖PCP-M由于中性糖含量較低、糖醛酸含量較高、相對分子質量較低而具有最佳的抗氧化活性。

    研究表明,茯苓多糖羧甲基化的過程中,抗氧化活性基團充分暴露,更易與1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基結合,與未修飾多糖相比,對上述自由基的最大清除率分別提高了33.91%、52.86%和72.62%[92]。Wang Yongjia等[44]發(fā)現5 種CMP離子基團隨DS增加,離子基團數量增加,物質水溶性增加,亞鐵離子的螯合效果增強,羥自由基清除活性增強,同時碳雜環(huán)上的電子密度增加,清除超氧化物的能力增強。CMP空間構象與制備方式有關,當制備條件為0.8 mol/L NaOH溶液、反應時間8 h、乙醇體積分數80%,重均分子質量降到最低(168.3 kDa),結構呈規(guī)則的類球形,與其他堿處理呈無規(guī)卷曲分布的CMP比,表現出更強的抗氧化能力,且存在劑量-效應關系[93]。

    茯苓多糖的化學修飾可改變自身的疏水性和親水性。羧甲基的引入和兩者之間適當的濃度配比使CMP與蓮房原花青素之間的相互作中產生更小的分子尺寸、更少的負電荷、更高的疏水性和黏度,抑菌活性增強[41]。別蒙等[87]的研究表明CMP羧甲基化程度越高,茯苓多糖重均分子質量從2.218h 105Da降至1.510h 105Da,中性糖含量降低,水溶性及電位絕對值均升高,破壞細菌的細胞膜的活性越大,在CMP質量濃度為10 mg/mL時,DS為0.728的CMP對金黃色葡萄球菌的抑制率可達到60.91%。

    茯苓多糖構效關系如圖4所示。

    圖4 茯苓多糖構效關系Fig.4 Relationship between structure and biological activity of P.cocos polysaccharides

    4 結語

    不良飲食習慣、工作和環(huán)境等多因素誘發(fā)的惡性腫瘤、免疫力低下、腸胃炎、酒精肝、脂肪肝、抑郁、高血糖等疾病引起人們對藥食同源食品的廣泛關注。茯苓作為傳統(tǒng)藥食同源食品,在中藥方劑中配伍應用廣泛,近年來其多種活性功能被深入挖掘,在食品、藥品、保健品方面開發(fā)潛力巨大。茯苓多糖聯合中草藥配方、抗癌藥物和疫苗將是研究的熱點,如逍遙散、五苓散和桂枝茯苓丸等配方中茯苓多糖和其他活性成分的協(xié)同作用和構效機制值得進一步挖掘。與此同時,茯苓食用部位和來源、貯存、加工方式不同,多糖含量、結構和活性不同,加強茯苓的質量控制是茯苓多糖在食品和制藥應用方面保持化學結構和生物活性可靠和一致的關鍵。

    茯苓堿性多糖水溶性差,產率低、分離純化困難且生物活性低,通過改性得到溶于水的茯苓多糖,可改善原有生物活性或產生新的生物活性。因此,茯苓多糖的結構改性是目前國內外學者研究的主要方向。盡管茯苓多糖的市場開發(fā)已經取得了很大的突破,但受到空間結構分析技術的限制,茯苓多糖結構與生物活性機理的關系和提高其構效的研究都比較淺顯,此外,臨床試驗研究尚不充分,限制了其開發(fā)應用。因此,進一步規(guī)范茯苓多糖品質標準、深入挖掘茯苓多糖多種生理活性、闡明多糖精細結構及其構效關系,從而改善多糖衍生物活性,特別是調控茯苓多糖衍生物的化學修飾程度,并對其進行可靠的藥代動力學研究,可促進茯苓多糖藥品或保健食品的開發(fā)。

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