手性毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)中手性選擇劑取代度的影響研究

謝天堯，鄧愛玲，肖華，朱芳

中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣州 510275

當(dāng)藥物分子結(jié)構(gòu)含有手性中心時(shí)，由于空間構(gòu)型的不同就可以得到結(jié)構(gòu)上互為鏡像的一對(duì)分子，成為對(duì)映異構(gòu)體。手性藥物對(duì)映體在人體內(nèi)往往顯示出不同的生理和藥物治療效果，通常只有一種有藥理活性，另外一種活性很弱，或沒有活性，甚至有毒副作用[1,2]。由于對(duì)映體的化學(xué)組成、理化性質(zhì)均完全相同，用一般的方法難以得到分離，因此手性藥物對(duì)映體分離檢測(cè)方法是分析化學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一[3,4]。手性毛細(xì)管電泳具備分離效率高、試劑消耗少、環(huán)境友好、分析成本低等特點(diǎn)，在手性化合物的分離分析中極具應(yīng)用前景[5,6]。由于手性毛細(xì)管電泳的運(yùn)行和維護(hù)成本較低，從根本上解決了在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展手性藥物對(duì)映體分離檢測(cè)存在的實(shí)驗(yàn)費(fèi)用昂貴問題。為此，我們“儀器分析實(shí)驗(yàn)”教學(xué)小組在科研成果基礎(chǔ)上[7]，設(shè)計(jì)開發(fā)出“毛細(xì)管電泳/非接觸式電導(dǎo)分離檢測(cè)手性藥物氧氟沙星對(duì)映體”的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，并應(yīng)用于我院本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)[8,9]。該實(shí)驗(yàn)理論與實(shí)踐相結(jié)合，采用了熟知的市售手性藥物氧氟沙星，且學(xué)生能夠親自動(dòng)手操作毛細(xì)管電泳儀器進(jìn)行手性藥物對(duì)映體的分離檢測(cè)，深受學(xué)生歡迎。

氧氟沙星(Ofloxacin)是常見的喹諾酮抗菌類藥物，在臨床上有著廣泛的應(yīng)用。氧氟沙星屬于手性藥物，存在2個(gè)對(duì)映體分子(S-ofloxacin，R-ofloxacin)。羥丙基-β-環(huán)糊精結(jié)構(gòu)式中含有多個(gè)手性中心并略呈錐形的中空?qǐng)A筒立體杯狀結(jié)構(gòu)[10]。其外緣親水而內(nèi)腔疏水，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特性使其作為主體可以選擇性地與合適的客體分子形成包合物。這種選擇性的包絡(luò)作用即通常所說的分子識(shí)別。羥丙基-β-環(huán)糊精的空腔結(jié)構(gòu)與氧氟沙星分子結(jié)構(gòu)匹配，能夠形成穩(wěn)定的包合物，如圖1所示。由于羥丙基-β-環(huán)糊精與氧氟沙星的2個(gè)對(duì)映體分子之間所形成的包合物具有不同的穩(wěn)定常數(shù)，在手性毛細(xì)管電泳中其電泳淌度將會(huì)表現(xiàn)出顯著差異，進(jìn)而可采用毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)法(CE-C4D)實(shí)現(xiàn)氧氟沙星對(duì)映體的良好分離和靈敏檢測(cè)。

圖1 羥丙基-β-環(huán)糊精與氧氟沙星的包合反應(yīng)

在教學(xué)實(shí)踐過程中，我們發(fā)現(xiàn)所采用的手性選擇劑羥丙基‐β‐環(huán)糊精除了濃度對(duì)氧氟沙星對(duì)映體的分離效果存在顯著影響外，還存在著取代度的影響。這是以前被忽略而沒有引起重視的一個(gè)較為重要的因素。具體表現(xiàn)為不同品牌、不同產(chǎn)家，甚至是同一產(chǎn)家在不同時(shí)期所提供的羥丙基‐β‐環(huán)糊精，雖然商品名稱相同但對(duì)氧氟沙星對(duì)映體的分離效果存在顯著差異，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的異常波動(dòng)，影響了實(shí)驗(yàn)教學(xué)效果。經(jīng)查閱文獻(xiàn)資料，并反復(fù)試驗(yàn)，最終確定引起對(duì)映體分離效果異常波動(dòng)的主要原因是手性選擇劑羥丙基‐β‐環(huán)糊精的取代度不同所造成。

為此，本文系統(tǒng)研究了不同取代度的羥丙基‐β‐環(huán)糊精對(duì)手性藥物氧氟沙星對(duì)映體的分離度影響，尋找出最佳取代度的羥丙基‐β‐環(huán)糊精。同時(shí)依據(jù)取代度的測(cè)定方法，提出對(duì)市售羥丙基‐β‐環(huán)糊精質(zhì)量的評(píng)估方法，以確保手性毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和取得良好教學(xué)效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

毛細(xì)管電泳儀(配備非接觸式電導(dǎo)C4D檢測(cè)器，廣州涵天科儀公司)；石英毛細(xì)管柱(50 μm id.，邯鄲永年銳沛色譜器件公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀公司)。

乙酸、乙酸鈉、NaOH、HCl (廣州化學(xué)試劑廠)；氧氟沙星對(duì)照品(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)。不同取代度(DS = 4.1，6.2，7.9，9.1)的羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)購自化學(xué)試劑公司。所用試劑除注明外均為分析純。水為超純水。

市售左旋氧氟沙星和氧氟沙星片劑(或者是滴眼液)購自廣州市當(dāng)?shù)氐乃幍瓿小?/p>

電泳運(yùn)行液用時(shí)現(xiàn)配。質(zhì)量濃度為100 mg?L?1的氧氟沙星對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存在4 °C的冰箱中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，取適量的上述標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液用超純水配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 樣品處理

市售氧氟沙星藥片(包括左旋體和外消旋體氧氟沙星藥片，標(biāo)示含量100 mg/片)，經(jīng)超聲助溶和0.45 μm濾膜過濾后制成樣品溶液。對(duì)于滴眼液樣品(標(biāo)示含量2.40 mg/支，0.8 mL)，可直接用超純水稀釋。進(jìn)樣時(shí)，用50 μmol?L?1HAc + 5 mmol?L?1HP-β-CD溶液稀釋到合適濃度，上機(jī)測(cè)定。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟和相關(guān)參數(shù)

石英毛細(xì)管在使用前的處理及其他實(shí)驗(yàn)條件參照文獻(xiàn)方法[8]。實(shí)驗(yàn)中，每2次進(jìn)樣之間僅需用運(yùn)行液沖洗3 min，基線運(yùn)行6 min。CE儀器參數(shù)：分離電壓：+15 kV，電動(dòng)進(jìn)樣：+11 kV × 8 s；石英毛細(xì)管：45 cm × 50 μm i.d.，Leff= 40 cm；C4D檢測(cè)器的信號(hào)經(jīng)數(shù)據(jù)工作站采集到計(jì)算機(jī)中，進(jìn)行電泳譜圖顯示、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和定量分析處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品分析及結(jié)果

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，按1.2節(jié)方法處理實(shí)際樣品和進(jìn)樣分析。通過標(biāo)準(zhǔn)加入法確定CE-C4D譜圖中氧氟沙星對(duì)映體(S-ofloxacin，R-ofloxacin)所對(duì)應(yīng)的電泳峰。結(jié)果表明，S-ofloxacin峰在前，R-ofloxacin峰在后，參見氧氟沙星對(duì)映體的CE-C4D譜圖。以取代度7.9的羥丙基-β-環(huán)糊精為手性選擇劑，對(duì)某廠家氧氟沙星藥片和氧氟沙星滴眼液的測(cè)定結(jié)果分別為101 mg/片和2.45 mg/支，與產(chǎn)品標(biāo)示值100 mg/片和2.40 mg/支相符。

2.2 羥丙基‐β‐環(huán)糊精取代度對(duì)分離度的影響

羥丙基-β-環(huán)糊精是由β-環(huán)糊精經(jīng)衍生化獲得，文獻(xiàn)方法一般采用β-環(huán)糊精和環(huán)氧丙烷在氫氧化鈉的作用下通過取代反應(yīng)合成[10–12]，見圖2。

圖2 羥丙基-β-環(huán)糊精的合成

β-環(huán)糊精由7個(gè)葡萄糖單元組成，而每個(gè)葡萄糖單元中2位和6位上的羥基易反應(yīng)，因此β-環(huán)糊精骨架上有14個(gè)易發(fā)生取代反應(yīng)的活性位點(diǎn)[10,12]。這些活性位點(diǎn)在與環(huán)氧丙烷的反應(yīng)中由于受到反應(yīng)溫度、時(shí)間和原料比的影響，將會(huì)產(chǎn)生多種取代度的產(chǎn)物，其中原料配比是決定羥丙基-β-環(huán)糊精取代度的重要因素[12]。在實(shí)際工作中，用平均取代度DS (degree of substitution)來代表環(huán)糊精骨架上羥基被取代的數(shù)量。文獻(xiàn)[13]指出不同取代度的羥丙基-β-環(huán)糊精與客體藥物分子之間的包合物表觀平衡常數(shù)存在顯著的差異。

為此，本實(shí)驗(yàn)中采用4種不同取代度(DS = 4.1，6.2，7.9，9.1)的羥丙基-β-環(huán)糊精，考察其對(duì)氧氟沙星對(duì)映體分離度的影響。不同取代度羥丙基-β-環(huán)糊精的氧氟沙星對(duì)映體分離度測(cè)定結(jié)果見表1，其CE-C4D譜圖如圖3所示。

由表1和圖3可知，不同取代度的羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)氧氟沙星對(duì)映體的分離度存在顯著差異，當(dāng)DS = 7.9時(shí)分離度最大。文獻(xiàn)[10,13]指出環(huán)糊精與客體分子之間的包合過程是氫鍵、范德華力和疏水作用力三者協(xié)同作用的結(jié)果。不同取代度的羥丙基-β-環(huán)糊精由于羥丙基數(shù)目的不同，造成了與客體分子氧氟沙星2個(gè)對(duì)映體分子之間包合物平衡常數(shù)的差異，而這種差異在DS = 7.9時(shí)達(dá)到最大。反映在CE分離上，取代度7.9的羥丙基-β-環(huán)糊精作為手性選擇劑時(shí)，可獲得最佳的對(duì)映體分離度。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于不同分子結(jié)構(gòu)的手性藥物，由于其與羥丙基-β-環(huán)糊精的包合作用力也不同,因此適合不同手性藥物對(duì)映體分離的DS值也將不同。

圖3 不同取代度羥丙基-β-環(huán)糊精分離氧氟沙星對(duì)映體的CE-C4D譜圖

表1 不同取代度羥丙基-β-環(huán)糊精的氧氟沙星對(duì)映體分離度測(cè)定結(jié)果(n = 5)

2.3 市售羥丙基-β-環(huán)糊精的質(zhì)量評(píng)估

由2.2節(jié)可知，不同取代度羥丙基‐β‐環(huán)糊精對(duì)氧氟沙星對(duì)映體的分離效果有較大影響，且當(dāng)DS = 7.9時(shí)分離度最佳。因此，十分有必要對(duì)市售羥丙基‐β‐環(huán)糊精的取代度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，以確保手性毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和良好的教學(xué)效果。羥丙基‐β‐環(huán)糊精取代度的方法有很多種，如核磁共振氫譜法[12]、質(zhì)譜法[14]、色譜法和容量法[15–17]等。核磁共振氫譜法是根據(jù)核磁共振譜圖的積分曲線計(jì)算取代度，與其他方法比較，核磁共振氫譜法具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)。本文采用核磁共振氫譜法對(duì)上述不同取代度(DS = 4.1，6.2，7.9，9.1)的市售羥丙基‐β‐環(huán)糊精進(jìn)行取代度測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與產(chǎn)品標(biāo)示值基本一致，相對(duì)誤差在3%以內(nèi)。因此核磁共振氫譜法是評(píng)估市售羥丙基‐β‐環(huán)糊精質(zhì)量的良好方法。對(duì)于一般實(shí)驗(yàn)室，可采用化學(xué)滴定法測(cè)定羥丙基‐β‐環(huán)糊精的取代度[17]。

3 結(jié)語

本研究選取4種不同取代度的羥丙基‐β‐環(huán)糊精，采用毛細(xì)管電泳-非接觸式電導(dǎo)法研究了其對(duì)氧氟沙星對(duì)映體的分離度影響。結(jié)果表明，取代度DS = 7.9的羥丙基‐β‐環(huán)糊精具有最優(yōu)的分離度。據(jù)此對(duì)市售羥丙基‐β‐環(huán)糊精的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估，可確保手性毛細(xì)管電泳實(shí)驗(yàn)的結(jié)果穩(wěn)定性和良好教學(xué)效果。同時(shí)，為深入探討不同取代度的羥丙基‐β‐環(huán)糊精對(duì)其他手性藥物對(duì)映體的分離提供了參考。