lncRNA HOTAIR 調(diào)節(jié)miR-326/NUS1 軸對宮腔粘連子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞纖維化的影響

陳國斌 祝文峰 史文娟 董倩

宮腔粘連 (intrauterine adhesion,IUA) 是最常見的子宮內(nèi)膜病變疾病之一［1］。近年來,由于子宮內(nèi)膜損傷和感染的增加,IUA 的發(fā)病率有所上升［2］。目前盡管經(jīng)宮腔鏡下宮腔粘連分離術(shù)是IUA 的標準治療方法,但治療后復(fù)發(fā)率仍較高［3］。IUA 與繼發(fā)性不孕和流產(chǎn)密切相關(guān),是目前影響女性生殖健康的重要病因之一［4］,因此研究IUA 的發(fā)病機制對于IUA 的防治具有重要的意義。相關(guān)研究表明,子宮內(nèi)膜纖維化是IUA 最重要的病理特征之一［5］?；|(zhì)細胞作為子宮內(nèi)膜的主要細胞群之一,是子宮內(nèi)膜功能的重要介質(zhì),因此,探究IUA 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞纖維化相應(yīng)的分子機制具有重要的意義。同源框轉(zhuǎn)錄反義RNA (homeobox gene antisense intergenic RNA,HOTAIR)是一種與多種纖維化疾病相關(guān)的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),已有研究報道,過表達HOTAIR 可促進子宮內(nèi)膜纖維化［6］,但具體分子機制尚不完全明確。lncRNA 通過海綿化miRNA 來調(diào)控mRNA 表達是其發(fā)揮其作用的方式之一［7］。本研究通過生物信息學分析發(fā) 現(xiàn),HOTAIR 與miR-326、miR-326 與NUS1 存 在結(jié)合位點。相關(guān)文獻報道,miR-326 在IUA 子宮內(nèi)膜組織中下調(diào)表達,過表達miR-326 通過下調(diào)促纖維化基因來抑制子宮內(nèi)膜纖維化［8］；NUS1 在IUA 組織中上調(diào),且其高表達與IUA 的嚴重程度呈正相關(guān)［9］。而HOTAIR 能否通過調(diào)控miR-326/NUS1 軸影響IUA 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞纖維化尚不明確。因此,本研究主要探究HOTAIR 對IUA 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞纖維化的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2018 年2 月～2020 年2 月在本院首次確診為IUA 的18 例患者的子宮內(nèi)膜組織,另取同期因不孕癥接受宮腔鏡子宮內(nèi)膜活檢的18 例患者的子宮內(nèi)膜組織作為對照。本研究得到本院倫理委員會審核批準,術(shù)前獲得所有患者的書面知情同意書。HESC 細胞購自上海弘順生物公司。

1.2主要試劑 HOTAIR 小干擾RNA(si-HOTAIR)及其陰性對照(si-NC)、HOTAIR 過表達物(pIRES2-HOTAIR) 及其陰 性對照(pIRES2)、miR-326 模擬物(miR-326 mimic)及其陰性對照(mimic NC)均購自上海美軒生物公司；CCK-8 試劑盒購自上海廣銳生物公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自上海富雨生物公司；兔源-抗纖連蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ型膠原蛋 白α1 鏈(collagen type 1 α1 chain,COL1A1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NUS1、GAPDH 及過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗均購自英國Abcam 公司。

1.3細胞培養(yǎng)及分組 將HESC 細胞置于含有10%胎牛血 清、100 U/ml 青霉素 和100 μg/ml 鏈 霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)基中,并在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將HESC 細胞用10 ng/ml TGF-β1處理48 h［2］以誘導(dǎo)IUA 子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞模型,命名為IUA HESC細 胞。將IUA HESC 細胞分 為Ct 組(TGF-β1處 理HESC 細 胞48 h)、pcDNA 組(轉(zhuǎn) 染pcDNA 24 h 后 再用TGF-β1處 理HESC 細 胞48 h)、pcDNA-HOTAIR組(轉(zhuǎn) 染pcDNA -HOTAIR 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)、si-NC 組(轉(zhuǎn)染si-NC 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)、si-HOTAIR 組(轉(zhuǎn)染si-HOTAIR 24 h 后 再用TGF-β1處 理HESC 細 胞48 h)、si-HOTAIR+inhibitor NC 組(轉(zhuǎn) 染si-HOTAIR+inhibitor NC 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)、si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組(轉(zhuǎn)染si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)。

1.4qRT-PCR 檢測組織和細胞中HOTAIR、miR-326 表達 使用TRIzol 試劑從組織勻漿和細胞中提取總RNA。將總RNA(2 μg)逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 后,以cDNA為模板進行定量聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)。GAPDH 作為HOTAIR 的內(nèi)參基因,U6 作為miRNA 的內(nèi)源性對照,采用2-ΔΔCt法計算基因的表達量。引物序列：GAPDH：正向為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'；反向為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；HOTAIR：正向為5'-CCTTATAAGCTCATCGGAGCA-3'；反向為5'-C ATTTCTGGGTGGTTCCTTT-3'；miR-326：正向為5'-C CTCTGGGCCCTTCC-3'；反向為5'-CAGTGCGTGTCGT GGAGT-3'；U6：正向為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5CCK-8 法檢測IUA HESC 細胞增殖 將各組細胞以2×104個/孔的密度接種在96 孔板中,孵育48 h 后每孔加入10 μl CCK8 試劑。使用SpectraMax M5 酶標儀檢測OD450。

1.6流式細胞術(shù)檢測IUA HESC 細胞凋亡 將各組細胞用PBS 洗滌后調(diào)整細胞濃度為5×104個/ml,加入5 μl Annexin-V-FITC 和 5 μl PI 在4 ℃下避光孵育20 min 后,再用500 μl 結(jié)合緩沖液重懸細胞。通過流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.7western blot 檢測組織和細胞中NUS1、COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達 在冰上使用RIPA 裂解緩沖液從組織勻漿和細胞中提取總蛋白。將獲得的裂解物在4℃下以12000×g 離心30 min。通過使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。蛋白質(zhì)通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉封閉后,將膜與一抗NUS1(1∶1000)、COL1A1(1∶2000)、FN(1∶1000)、α-SMA(1∶2000)、GAPDH(1∶1000)在 4℃下孵育過夜,然后將膜與二抗(1∶1000)在室溫下孵育2 h。使用ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)檢測條帶,并使用ImageJ 1.51軟件對所有蛋白質(zhì)條帶進行定量分析。

1.8雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?構(gòu)建HOTAIR-WT 和HOTAIR-MUT,將HOTAIR-WT 和HOTAIR-MUT 分別與mimic NC 或miR-326 mimic 共轉(zhuǎn)染于IUA HESC 細胞,48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.9RNA pull down實驗 對pIRES2-HOTAIR或pIRES2的DNA 片段進行PCR 擴增、酶切后,得到線性化的質(zhì)粒DNA。使用生物素RNA 標記線性化的pIRES2-HOTAIR 和pIRES2,分別命名為bio-HOTAIR、bio-NC。將bio-HOTAIR、bio-NC 在體外轉(zhuǎn)錄、純化后,將其分別與IUA HESC 細胞的總細胞裂解物一起孵育,洗脫的RNA 被純化并通過qRT-PCR 評估HOTAIR、miR-326 的表達量。

1.10統(tǒng)計學方法 使用IBM SPSS Statistics 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數(shù)±標準差()表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩組間的比較采用SNK-q 檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在組織和細胞中的表達 IUA 子宮內(nèi)膜組織中 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表達水平高于正常子宮內(nèi)膜組織,miR-326 表達水平低于正常子宮內(nèi)膜組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1,表1。IUA HESC 細胞中 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表達水平高于HESC 細胞,miR-326 表達水平低于HESC 細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2,表2。

圖1 western blot 檢測組織中NUS1 蛋白表達

表1 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在組織中的表達(,n=18)

表1 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在組織中的表達(,n=18)

注：與正常子宮內(nèi)膜組織比較,aP<0.05

圖2 western blot 檢測細胞中NUS1 蛋白表達

表2 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在細胞中的表達(,n=6)

表2 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在細胞中的表達(,n=6)

注：與HESC 細胞比較,aP<0.05

2.2HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC細胞中的表達 pcDNA-HOTAIR 組 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表達水平高于Ct 組、pcDNA 組,miR-326 表達水平低于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表 達水平低于Ct 組、si-NC 組,miR-326 表達水平高于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組 及si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組 HOTAIR 表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組miR-326 表達水平低于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,NUS1/GAPDH 表達水平高于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3,表3。

表3 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC 細胞中的表達(,n=6)

表3 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC 細胞中的表達(,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

圖3 western blot 檢測IUA HESC 細胞中NUS1 蛋白表達

2.3過表達或沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞增殖的影響 pcDNA-HOTAIR 組IUA HESC 細 胞OD450值高于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組IUA HESC 細胞OD450值低于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組IUA HESC 細胞OD450值高于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 七組IUA HESC 細胞OD450 值比較(,n=6)

表4 七組IUA HESC 細胞OD450 值比較(,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

2.4過表達或沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞凋亡的影響 pcDNA-HOTAIR 組IUA HESC 細胞凋亡率低于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組IUA HESC 細胞凋亡率高于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組IUA HESC 細胞凋亡率低于si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4,表5。

表5 七組IUA HESC 細胞凋亡率比較(,%,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

圖4 流式細胞術(shù)檢測IUA HESC 細胞凋亡

2.5過表達或沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞纖維化的影響 pcDNA-HOTAIR 組IUA HESC 細胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表達水平高于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組IUA HESC 細胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表達水平低于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組IUA HESC 細胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表 達水平高于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 western blot 檢測IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達

表6 七組IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達比較(,n=6)

表6 七組IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達比較(,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

2.6HOTAIR 靶向調(diào)控miR-326/NUS1 軸 starbase 預(yù)測lncRNA HOTAIR 與miR-326、miR-326 與NUS1 的結(jié)合位點,見圖6。miR-326 mimic 和HOTAIR-WT 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性低于mimic NC 和HOTAIR-WT共轉(zhuǎn)染組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mimic NC 和HOTAIR-MUT 共轉(zhuǎn)染組與miR-326 mimic 和HOTAIRMUT 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-326 mimic 和NUS1-WT 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性低于mimic NC 和NUS1-WT 共轉(zhuǎn)染組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mimic NC 和NUS1-MUT共轉(zhuǎn)染組與miR-326 mimic 和NUS1-MUT 共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。bio-lncRNA HOTAIR 沉淀中 的lncRNA HOTAIR 和miR-326 水平均顯著高于bio-NC,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

表7 熒光素酶活性比較(,n=6)

表7 熒光素酶活性比較(,n=6)

注：與mimic NC 和HOTAIR-WT 共轉(zhuǎn)染組比較,aP<0.05；與mimic NC 和NUS1-WT 共轉(zhuǎn)染組比較,bP<0.05

圖6 starbase 預(yù)測lncRNA HOTAIR 與miR-326、miR-326 與NUS1 的結(jié)合位點

圖7 RNA pull down 驗證HOTAIR 與miR-326 的靶向結(jié)合

3 討論

IUA 是以子宮內(nèi)膜損傷后宮腔前后壁部分或全部粘連為特征的常見婦科疾病。臨床表現(xiàn)包括月經(jīng)量減少、閉經(jīng)、不孕、前置胎盤、反復(fù)流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎盤粘連、胚胎著床困難、胎盤發(fā)育異常等,嚴重影響女性的生殖健康［10］。IUA 的治療主要是宮腔鏡手術(shù)分離粘連,其次是防止再粘連,治療目的是恢復(fù)宮腔形態(tài)、促進內(nèi)膜生長、改善妊娠結(jié)局。然而,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)輕、中度IUA 治療后的再粘連率為30%,而嚴重者高達62.5%。且妊娠率僅為22.5%～33.3%［11］。據(jù)報道,子宮內(nèi)膜纖維化進展參與了IUA 的發(fā)生、發(fā)展［12］。因此,探究IUA 子宮內(nèi)膜纖維化相關(guān)的分子機制具有重要意義。

lncRNA 可參與纖維化疾病的各種生物學功能［13,14］。HOTAIR 作為一 種位于HOXC 基因座 的lncRNA,已有研究報道稱沉默HOTAIR 可抑制單側(cè)輸尿管阻塞大鼠腎間質(zhì)纖維化［15］；降低HOTAIR 表達可抑制高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病系膜細胞纖維化［16］。表明HOTAIR 參與了纖維化疾病的進展。本研究通過TGF-β1誘導(dǎo)HESC 以構(gòu)建IUA 體外細胞纖維化模型,并檢測了HOTAIR 在IUA 子宮內(nèi)膜組織及IUA HESC細胞中的表達,結(jié)果顯示HOTAIR 在IUA 子宮內(nèi)膜組織及IUA HESC 細胞中上調(diào)。COL1A1、FN、α-SMA作為衡量纖維化的常見指標,已有研究顯示,槲皮素通過降低TGF-β1誘導(dǎo)的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達來抑制細胞纖維化反應(yīng)［17］。本研究顯示,過表達HOTAIR 可促進IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達,而沉默HOTAIR 則可抑制IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達,提示沉默HOTAIR 可抑制IUA HESC 細胞纖維化。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),過表達HOTAIR 可促進IUA HESC 細胞增殖,抑制細胞凋亡,而沉默HOTAIR 則呈相反趨勢。表明沉默HOTAIR 可能通過抑制細胞增殖,促進細胞凋亡的方式來抑制細胞纖維化。

lncRNA 可通過海綿吸附miRNA 來發(fā)揮其生物學功能。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)HOTAIR 與miR-326 存在結(jié)合位點。miR-326 是一種與纖維化疾病有關(guān)的miRNA,據(jù)報道,miR-326 在IUA 子宮內(nèi)膜組織中的表達低于正常子宮內(nèi)膜組織,并且與纖維化標志物(α-SMA、COL1A1 和 FN)的表達呈負相關(guān)［18］。以上研究表明miR-326 可抑制IUA 進展。本研究結(jié)果與其是一致的,本研究顯示,miR-326 在IUA 子宮內(nèi)膜組織及IUA HESC 細胞中低表達,過表達HOTAIR 可抑制IUA HESC 細胞中miR-326 表達,沉默HOTAIR可促進IUA HESC 細胞中miR-326 表達,且雙熒光素酶報告基因和RNA pull down 實驗證實了HOTAIR 可與miR-326 靶向結(jié)合,推測沉默HOTAIR 可能通過上調(diào)miR-326 表達抑制IUA HESC 細胞纖維化。為了驗證該推測,本研究在沉默HOTAIR 的基礎(chǔ)上再加上miR-326 inhibitor 干預(yù)IUA HESC 細胞,結(jié)果顯示,miR-326 inhibitor 減弱了沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞纖維化的抑制作用,證實了沉默HOTAIR 可能通過上調(diào)miR-326 表達抑制IUA HESC 細胞纖維化。

miRNAs 可直接結(jié)合靶向mRNA 的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)以降解靶向mRNA 或抑制翻譯［19］。為了進一步探究沉默HOTAIR 可能通過上調(diào)miR-326 表達抑制IUA HESC 細胞纖維化的分子機制,本研究通過starbase 預(yù)測發(fā)現(xiàn)miR-326 與NUS1 存在結(jié)合位點。NUS1,也稱為 NgBR,是一種跨膜受體蛋白,已有研究顯示,NUS1 在人IUA 組織中異常高表達,過表達NUS1 減弱了IUA 后的子宮內(nèi)膜上皮細胞凋亡作用［20］,提示NUS1 參與了IUA 進展。本研究發(fā)現(xiàn),NUS1 蛋白在IUA 子宮內(nèi)膜組織及IUA HESC 細胞中高表達,過表達HOTAIR 后,IUA HESC 細胞中miR-326 下調(diào)表達,NUS1 蛋白上調(diào)表達；沉默HOTAIR 后,IUA HESC 細胞中miR-326 上調(diào)表達,NUS1 蛋白下調(diào)表達,且雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了NUS1 蛋白可與miR-326靶向結(jié)合,以上結(jié)果表明沉默HOTAIR 可能通過海綿化miR-326 來下調(diào)NUS1 表達進而抑制IUA HESC 細胞纖維化。

綜上所述,沉默HOTAIR 可能通過海綿化miR-326 來下調(diào)NUS1 表達進而抑制IUA HESC 細胞纖維化,該研究可能為IUA 的治療提供潛在的靶點。