右美托咪定通過(guò)P2X7調(diào)控NLRP3/IL-1β通路減輕大鼠炎性痛

李屹 張際政 孫曉華 車(chē)津立 任萬(wàn)陸

(天津醫(yī)院麻醉科，天津 300211)

炎性疼痛是常見(jiàn)的臨床癥狀，廣泛存在于各種急慢性疾病中。一般情況下，急性炎癥對(duì)于保護(hù)身體免受入侵的病原體及促進(jìn)組織重塑和修復(fù)至關(guān)重要。持續(xù)6 w或更長(zhǎng)時(shí)間的慢性炎癥是嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的最常見(jiàn)不適之一，可導(dǎo)致組織損傷〔1〕。促炎介質(zhì)(如前列腺素、細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白酶、神經(jīng)肽和生長(zhǎng)因子)在炎癥部位釋放能夠使周?chē)耐从X(jué)神經(jīng)元敏感。目前，非甾體抗炎藥和阿片類(lèi)鎮(zhèn)痛藥仍是臨床上常用的藥物，但近50%的患者會(huì)感到疼痛緩解不足、胃腸道不適和其他嚴(yán)重的副作用(如便秘、抑郁)〔2,3〕。因此，開(kāi)發(fā)高效、低毒的鎮(zhèn)痛藥一直受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。右美托咪定(Dex)是一種具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、輔助麻醉等作用的新一代高選擇性α2腎上腺素能受體(α2 AR)激動(dòng)劑；是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的在重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)中對(duì)插管和機(jī)械通氣患者進(jìn)行鎮(zhèn)靜的常用藥物〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)誘導(dǎo)的大鼠慢性炎性?xún)?nèi)臟痛表現(xiàn)較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用〔5,6〕；研究發(fā)現(xiàn)Dex區(qū)域麻醉干預(yù)對(duì)術(shù)后鎮(zhèn)痛非常有用，可以減少對(duì)阿片類(lèi)藥物的需求并提高術(shù)后患者的滿(mǎn)意度〔7〕。

嘌呤能P2X7已被證明在傷害性炎癥和神經(jīng)性疼痛的動(dòng)物模型中起核心作用，在患有慢性傷害性和神經(jīng)性疼痛的患者外周血中可見(jiàn)P2X7明顯上調(diào)和白細(xì)胞介素(IL)-1β釋放增加〔8～10〕。動(dòng)物研究也發(fā)現(xiàn)P2X7可通過(guò)激活VOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(NLRP)3/IL-1β信號(hào)通路，參與大鼠炎性痛的形成〔11〕。Dex可抑制P2X4和NLRP3的表達(dá)，減弱糖尿病性神經(jīng)性疼痛大鼠〔12〕；并可下調(diào)NLRP3的表達(dá)，降低IL-1β的釋放，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥〔13〕。而Dex能否通過(guò)P2X7調(diào)控NLRP3/IL-1β減輕大鼠炎性痛還未可知，故本研究通過(guò)建立慢性炎性痛大鼠模型，探討Dex在該模型中對(duì)P2X7及NLRP3/IL-1β通路的影響，為Dex能否作為安全、高效的鎮(zhèn)痛藥提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料 SPF級(jí)雄性SD大鼠66只，體重(180±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證為SCXK(京)2019-0009。將所有大鼠放在可控制的光照下保持12 h明暗交替，溫度(20±2)℃，相對(duì)濕度為45%～60%，可以自由獲取食物和水。研究已由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)，并遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》。鹽酸Dex注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20090248,2 ml:200 μg)；2′(3′)-O-(4-苯甲酰苯甲酰)腺苷5′-三磷酸三乙銨鹽(Bz-ATP，P2X7激動(dòng)劑，≥93%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司，CAS號(hào)：112898-15-4)；完全弗氏佐劑(CFA，P2036)、RIPA裂解液(P0013B)和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(P0012S)均購(gòu)自碧云天生物科技公司；大鼠IL-1β(RA20020)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司；兔抗P2X7(ab109054)、NLRP3(ab263899)、半胱天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-1(ab238972)、IL-1β(ab200478)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(ab9485)、羊抗兔IgG H&L辣根過(guò)氧化物酶(HRP)(ab205718)、小鼠抗神經(jīng)元特異核蛋白(NeuN，ab104224)、Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗兔IgG H&L(ab150079)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG H&L(ab6785)均購(gòu)自英國(guó)abcam公司；BME-403 Von Frey、BME-410C全自動(dòng)熱痛刺激儀均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所；iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。將60只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、Dex低、高劑量組(10、20 μg/kg)〔12〕、Bz-ATP組(Dex 20 μg/kg+P2X7激動(dòng)劑Bz-ATP 15 μg/kg)〔11〕，每組12只。1%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后，左后爪足底內(nèi)注射20 μl的CFA誘發(fā)炎癥性疼痛模型〔14〕。大鼠于建模前1 d、建模后即刻及建模后1、2、3 d進(jìn)行腹腔注射給藥，對(duì)照組和模型組注射生理鹽水，Dex低、高劑量組分別注射相應(yīng)劑量的Dex，Bz-ATP組在給予Dex的同時(shí)注射P2X7激動(dòng)劑Bz-ATP(溶于無(wú)菌的0.9%生理鹽水中，并稀釋至所需濃度)，1次/d，注射體積為1 ml。

1.3行為學(xué)測(cè)試

1.3.1機(jī)械痛敏 在大鼠注射前1 d及給藥結(jié)束后30 min進(jìn)行機(jī)械痛敏測(cè)定。實(shí)驗(yàn)前將大鼠連續(xù)3 d放置在測(cè)試籠中30 min以適應(yīng)測(cè)試環(huán)境，每次測(cè)試前，將大鼠放進(jìn)測(cè)試籠中適應(yīng)15 min，然后用電子Von Frey刺激針刺激大鼠左側(cè)足底，從1.0 g開(kāi)始，逐漸增加纖毛折力，記錄出現(xiàn)抬足或舔足反射的最小刺激強(qiáng)度為機(jī)械縮足反射閾值(MWT)，每只大鼠測(cè)量5次，每次間隔5 min，計(jì)算其平均值。

1.3.2熱痛敏 分別用移動(dòng)的熱輻射光源照射各組大鼠左側(cè)足底，大鼠快速抬足或舔足即停止照射，記錄熱輻射持續(xù)時(shí)間即縮足反射潛伏期(PWTL)，每只大鼠測(cè)量5次，每次間隔5 min，計(jì)算其平均值。為避免灼傷大鼠足底，刺激時(shí)間設(shè)置為15 s，若15 s內(nèi)大鼠對(duì)熱刺激無(wú)反應(yīng)則記為15 s。

1.3.3ELISA檢測(cè)腦脊液IL-1β水平 行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，使用戊巴比妥(80 mg/kg)深度麻醉大鼠，固定于腦立體定位儀上，剪開(kāi)枕骨嵴附近皮膚，使用微量進(jìn)樣器穿過(guò)肌肉進(jìn)入延髓池，緩慢抽取100 μl腦脊液，-80℃冰箱保存。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作檢測(cè)腦脊液中IL-1β水平。

1.3.4免疫熒光檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中P2X7、NLRP3與NeuN的共表達(dá) 取腦脊液完成后處死大鼠，經(jīng)心灌注150 ml生理鹽水和400 ml 4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。分離L4～L6 DRG，每組隨機(jī)選取6只大鼠的樣本，在4%多聚甲醛中固定3 h，然后轉(zhuǎn)移至15%和30%的蔗糖進(jìn)行脫水。OCT包埋后在冷凍低溫恒溫器上將DRG切成14 μm的切片。將切片用TBST(0.1%Tween-20)沖洗，并在37℃下用5%正常山羊血清封閉1 h。然后將切片與兔抗P2X7(1∶100)、NLRP3(1∶100)和小鼠抗NeuN(1∶200)于4℃孵育過(guò)夜。清洗后，與Alexa Fluor 647標(biāo)記的山羊抗兔和FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗IgG抗體(1∶200)進(jìn)行第二次孵育2 h。4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)孵育30 min，漂洗后使用熒光顯微鏡拍攝圖像。每張切片選擇四個(gè)區(qū)域，分別計(jì)算P2X7(紅色)與NeuN(綠色)、NLRP3(紅色)與NeuN(綠色)共表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度(黃色)。

1.3.5Western印跡檢測(cè)DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá) 每組剩余6只大鼠DRG加入RIPA裂解液研磨后，置于冰上，靜置后離心，提取上清液為總蛋白溶液。用BCA法測(cè)量組織裂解液中的蛋白濃度，變性后取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入相應(yīng)的一抗(P2X7、NLRP3、Caspase、IL-1β 1∶1 000，GAPDH按1∶2 000比例稀釋)于4℃下孵育過(guò)夜，洗去一抗，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗去二坑，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影，測(cè)量每個(gè)條帶的蛋白表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參，分析目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0和Image-Pro Plus6.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Dex對(duì)慢性炎性痛大鼠痛閾的影響 與建模前相比，建模后大鼠MWT、PWTL均顯著下降(P<0.05)；給藥結(jié)束后，與對(duì)照組相比，模型組MWT、PWTL顯著下降(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組MWT、PWTL明顯升高(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組MWT、PWTL明顯降低(P<0.05)；見(jiàn)表1。

表1 各組痛閾、腦脊液中IL-1β水平及DRG中P2X7、NLRP3與NeuN共表達(dá)的比較

2.2Dex對(duì)慢性炎性痛大鼠腦脊液中IL-1β的影響 與對(duì)照組相比，模型組腦脊液中IL-1β水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組IL-1β水平明顯降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組IL-1β水平明顯升高(P<0.05)；見(jiàn)表1。

2.3Dex對(duì)慢性炎性痛大鼠DRG中P2X7、NLRP3與NeuN共表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組DRG中P2X7與NeuN、NLRP3與NeuN共表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組P2X7與NeuN、NLRP3與NeuN共表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組P2X7與NeuN、NLRP3與NeuN共表達(dá)明顯升高(P<0.05)；見(jiàn)圖1、表1。

圖1 各組DRG中P2X7、NLRP3與NeuN共表達(dá)水平(免疫熒光染色，×400)

2.4Dex對(duì)慢性炎性痛大鼠DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Dex低、高劑量組P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與Dex高劑量組相比，Bz-ATP組P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)明顯升高(P<0.05)；見(jiàn)表2、圖2。

表2 各組DRG中P2X7、NLRP3、Caspase-1、IL-1β表達(dá)的比較

1～5：對(duì)照組，模型組，Dex低劑量組，Dex高劑量組，Bz-ATP組

3 討 論

慢性炎癥疼痛是全球性的健康問(wèn)題，盡管其發(fā)病機(jī)制和調(diào)節(jié)因子方面取得了重大進(jìn)展，但是當(dāng)前的疼痛療法不能充分緩解慢性疼痛，尋找安全、高效的鎮(zhèn)痛藥仍然是研究的重點(diǎn)。促炎性細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)是病理性疼痛發(fā)展不可或缺的部分，這些通信的調(diào)制可能是改善疼痛的關(guān)鍵〔15〕。Dex是新一代高選擇性α2 AR激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛，抑制交感神經(jīng)，降低麻醉劑量，增加血液動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性及提高術(shù)后識(shí)別能力等多種優(yōu)勢(shì)〔16〕。它的安全性和有效性及可為患者提供一定程度的舒適感的能力，使其成為臨床廣泛應(yīng)用的麻醉佐劑〔17〕。近年來(lái)，隨著Dex臨床研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)該藥物在各種神經(jīng)痛〔18〕、術(shù)后疼痛和炎癥控制〔19〕中表現(xiàn)出顯著的鎮(zhèn)痛抗炎作用，可降低患者血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β和C反應(yīng)蛋白(CRP)水平，而且沒(méi)有嚴(yán)重的副作用。因此，Dex是一種有前途的新型高效且安全的鎮(zhèn)痛藥。

三磷酸腺苷(ATP)是在所有組織和細(xì)胞中普遍存在的分子，在生理和病理?xiàng)l件下均會(huì)釋放到細(xì)胞外環(huán)境中。ATP是感覺(jué)神經(jīng)節(jié)中釋放的主要遞質(zhì)，可激活嘌呤受體，嘌呤受體在外周(PNS)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中具有廣泛組織分布，參與炎癥和慢性疼痛的發(fā)病〔20〕。DRG中的嘌呤受體在促進(jìn)細(xì)胞間通訊中起重要作用，特別是在疼痛信號(hào)傳遞方面。P2X7是ATP配體門(mén)控離子通道P2X受體家族的主要成員，在P2X家族中，P2X7具有ATP誘導(dǎo)激活的最高閾值，只有在細(xì)胞外ATP達(dá)到病理濃度時(shí)才會(huì)觸發(fā)下游機(jī)制。在DRG中神經(jīng)元可以通過(guò)ATP釋放和P2X7激活進(jìn)行通訊，參與調(diào)節(jié)炎癥性和慢性疼痛〔21〕。IL-1β是第一種被描述為與炎性疼痛和痛覺(jué)過(guò)敏有關(guān)的促炎細(xì)胞因子。IL-1β可增強(qiáng)脊髓板層Ⅱ神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞并抑制抑制性突觸傳遞，增強(qiáng)疼痛信號(hào)向大腦的傳遞；研究發(fā)現(xiàn)降低DRG中的P2X7的表達(dá)，抑制IL-1β的釋放，可減弱大鼠脊髓炎癥引起的痛覺(jué)過(guò)敏〔22〕。而IL-1β成熟和分泌的關(guān)鍵過(guò)程是ATP誘導(dǎo)的P2X7的激活，在我們的研究中獲得了相似的結(jié)果，將CFA注射于大鼠左后爪的足底以誘發(fā)炎癥性痛覺(jué)過(guò)敏，然后發(fā)展為持續(xù)的慢性炎性痛，其特征為強(qiáng)烈的局部發(fā)紅，水腫和發(fā)熱〔23〕。NeuN是神經(jīng)元特異性標(biāo)志物，本研究也證實(shí)P2X7廣泛分布在神經(jīng)元中。本文結(jié)果提示P2X7在Dex介導(dǎo)的鎮(zhèn)痛作用中起重要作用。

研究還發(fā)現(xiàn)在CFA誘導(dǎo)大鼠炎性痛模型的DRG神經(jīng)元中NLRP3表達(dá)也顯著增加。而細(xì)胞外ATP刺激P2X7釋放IL-1β的過(guò)程依賴(lài)NLRP3炎性小體的激活〔24〕。NLRP3與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，正常情況下，神經(jīng)系統(tǒng)中NLRP3的表達(dá)很低，在感染、炎癥、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下，釋放到胞外的ATP可通過(guò)激活靶細(xì)胞中P2X7，進(jìn)一步激活NLRP3炎性小體〔25〕，隨后活化半胱天冬氨酸蛋白酶前體(Pro-Caspase)-1分解為Caspase-1，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18的成熟和釋放，進(jìn)而影響感覺(jué)神經(jīng)元功能〔26〕。本研究提示Dex可能通過(guò)下調(diào)P2X7，進(jìn)一步抑制NLRP3/IL-1β通路。

綜上，Dex可能通過(guò)下調(diào)P2X7，抑制NLRP3/IL-1β通路，減輕大鼠慢性炎性痛。慢性炎性痛有許多類(lèi)型，本研究?jī)H采用CFA誘導(dǎo)建立了一種炎性痛大鼠模型，在其他疼痛模型中Dex是否發(fā)揮相同的對(duì)P2X7的調(diào)控作用，有待研究。