circ_0016788靶向調(diào)控miR-1200抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

于海東 楊海明 馬存凱 郭應(yīng)興

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院介入診療科，青海 西寧 810000)

肝細(xì)胞癌是全球最常見的癌癥，其死亡率高，近年來，分子靶向療法已經(jīng)在臨床上用于治療包括肝癌在內(nèi)的多種癌癥，更具選擇性和特異性，因此研發(fā)出更多旨在靶向特定途徑的靶向藥物對肝細(xì)胞癌的臨床治療具有重要意義〔1,2〕。環(huán)狀核糖核酸(circRNA)在人類癌癥的發(fā)生中起重要作用，circRNA表達(dá)的改變與肝癌的發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)，有作為診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛在價值〔3〕。研究報道在肝癌組織和細(xì)胞系中circ_0016788被上調(diào)；circ_0016788沉默可通過miR-486/細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK4)途徑抑制肝細(xì)胞癌體外細(xì)胞的增殖、侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕。circ_0016788高表達(dá)與較短的總生存期相關(guān)，其具有潛在的生物標(biāo)志物的作用，可協(xié)助外科肝癌患者進(jìn)行個性化治療，腫瘤治療和預(yù)后監(jiān)測〔5〕。然而circ_0016788影響肝癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的分子機制尚未完全清楚。本實驗通過在線預(yù)測軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)circ_0016788和miR-1200存在互補結(jié)合位點。且研究報道RGMB-AS1通過海綿miR-1200促進(jìn)同源異型盒基因(HOX)B2表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力〔6〕。circ-0001785通過使miR-1200海綿化以上調(diào)HOXB2表達(dá)來調(diào)節(jié)骨肉瘤的發(fā)病機制〔7〕。說明長鏈非編碼RNA(lncRNA)和circRNA均可通過靶向調(diào)控miR-1200的表達(dá)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。因此，本實驗旨在研究circ_0016788是否可通過調(diào)控miR-1200抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2018年1月至2020年6月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院接受肝切除術(shù)治療的肝癌患者9例，收集患者手術(shù)切除癌組織及癌旁組織。所有患者臨床及病理資料完整，且簽署知情同意書。

1.2材料 肝癌細(xì)胞MHCC97購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司；實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購自美國Biovision公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；凋亡檢測試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購自上海谷研實業(yè)有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 將肝癌細(xì)胞MHCC97接種至RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞長至對數(shù)生長期，將circ_0016788干擾載體質(zhì)粒si-circ_0016788及其陰性對照si-NC分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，記為si-circ_0016788組、si-NC組；將si-circ_0016788與miR-1200抑制劑anti-miR-1200及其陰性對照anti-miR-NC分別共轉(zhuǎn)染至MHCC97細(xì)胞內(nèi)，記為si-circ_0016788+anti-miR-1200組和si-circ_0016788+anti-miR-NC組。

1.4RT-qPCR檢測癌組織及癌旁組織circ_0016788和miR-1200表達(dá)水平 提取癌組織及癌旁組織中細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA進(jìn)行PCR擴增。miR-1200以U6為內(nèi)參，circ_0016788以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算其相對表達(dá)量。其中circ_0016788上游引物：5′-CAGTTTATGATTGCCG TCCTCC-3′，下游：5′-GTGATCGTCTAGGTGGTAACC-3′；miR-1200上游引物：5′-ACACT CCAGCTGGGCT CCTGAGCCATTCTG-3′，下游：5′-CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGGCTCA-3′；GAPDH上游引物：5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′，下游：5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′；U6上游引物：5′-CGTTCACGCATCTTTAAAATTGGA-3′，下游：5′-TTATGCGTGTCATCCTTGCG-3′。

1.5circ_0016788對細(xì)胞增殖活性的影響檢測 將對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞MHCC97制成細(xì)胞懸液后接種至96孔板，于CO2孵育箱常規(guī)培養(yǎng)24 h，在96孔板內(nèi)加入20 μl MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔中再加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)于搖床上振蕩10 min充分反應(yīng)，通過多功能酶標(biāo)儀于450 nm波長下檢測其吸光度(OD)值。

1.6Western印跡檢測蛋白表達(dá) 將對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞MHCC9裂解提取總蛋白，測定蛋白濃度后進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，在凝膠中加入封閉液37℃封閉2 h，加入一抗4℃孵育24 h；次日加入相應(yīng)二抗37℃孵育1 h，采用ImageJ軟件對各蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.7Transwell檢測細(xì)胞遷移、侵襲 侵襲實驗前需要預(yù)先在Transwell小室上層鋪設(shè)基質(zhì)膠，遷移實驗無需鋪膠，其余實驗步驟一致。收集對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞MHCC9接種至24孔板，加入無血清培養(yǎng)基孵育12 h后棄去培養(yǎng)基，胰酶消化后通過無血清培養(yǎng)將其液制成至1×105個/ml的單細(xì)胞懸液，Transwell小室上層加入150 μl/孔肝癌細(xì)胞MHCC9，下層加入600 μl/孔培養(yǎng)基于CO2孵育箱孵育24 h，多聚甲醇固定15 min，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加結(jié)晶紫染色20 min，再次用PBS沖洗至背景清晰后于熒光顯微鏡下拍照，計數(shù)穿膜細(xì)胞。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將各組對數(shù)生長期肝癌細(xì)胞MHCC9接種至96孔板培養(yǎng)48 h，加入不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰蛋白酶制成單細(xì)胞懸液。加PBS沖洗細(xì)胞后，重懸于結(jié)合緩沖液中并制成1.0×106個/ml的單細(xì)胞懸液。加入10 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)染液和5 μl的碘化丙啶(PI)染液，充分混勻后4℃避光孵育20 min；上機檢測細(xì)胞凋亡率。

1.9circ_0016788和miR-1200的靶向關(guān)系驗證 構(gòu)建circ_0016788野生型(WT-circ_0016788)和circ_0016788突變型(MUT-circ_0016788)熒光素酶表達(dá)載體，將上述載體與miR-1200過表達(dá)質(zhì)粒(miR-1200 mimics)、陰性對照質(zhì)粒(miR-NC)共轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞MHCC97中，通過雙熒光素酶活性檢測試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行t檢驗和單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肝癌組織circ_0016788和miR-1200表達(dá)水平 circ_0016788在肝癌組織中表達(dá)水平顯著高于癌旁組織(P<0.05)，miR-1200表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(P<0.05)。見表1。

表1 肝癌組織circ_0016788和miR-1200表達(dá)水平

2.2抑制circ_0016788表達(dá)降低肝癌MHCC97細(xì)胞增殖活性 與si-NC組相比，si-circ_0016788組肝癌MHCC97細(xì)胞增殖活性及circ_0016788、CyclinD1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，p21表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖1、表2。

2.3抑制circ_0016788表達(dá)抑制肝癌MHCC97細(xì)胞遷移、侵襲 與si-NC組相比，si-circ_0016788組肝癌MHCC97細(xì)胞遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)及MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2、圖3。

圖1 兩組CyclinD1、p21蛋白表達(dá)

表2 抑制circ_0016788表達(dá)降低肝癌MHCC97細(xì)胞增殖活性及遷移、侵襲能力

2.4抑制circ_0016788表達(dá)促進(jìn)肝癌MHCC97細(xì)胞凋亡 與si-NC組比，si-circ_0016788組肝癌MHCC97細(xì)胞凋亡率及Bax表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖4、表3。

圖2 兩組MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

圖3 抑制circ_0016788表達(dá)抑制肝癌MHCC97細(xì)胞遷移侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 抑制circ_0016788表達(dá)促進(jìn)肝癌MHCC97細(xì)胞凋亡

表3 抑制circ_0016788表達(dá)促進(jìn)肝癌MHCC97細(xì)胞凋亡

2.5circ_0016788靶向調(diào)控miR-1200的表達(dá) circ_0016788的序列中包含與miR-1200的結(jié)合位點(圖5)。實驗結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0016788和miR-NC的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-circ_0016788和miR-1200的細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而共轉(zhuǎn)染MUT-circ_0016788與miR-1200細(xì)胞的熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染MUT-circ_0016788和miR-NC的細(xì)胞相比無顯著差異(P>0.05)。見表5。

2.6miR-1200的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0016788對肝癌MHCC97細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與si-circ_0016788+anti-miR-NC組相比，si-circ_0016788+anti-miR-1200組肝癌MHCC97細(xì)胞活性及遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)；miR-1200、p21、Bax表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。見圖6、圖7、表5、表6、圖8。

圖5 circ_0016788與miR-1200互補結(jié)合位點

表5 細(xì)胞熒光素酶活性

圖6 肝癌MHCC97細(xì)胞遷移、侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×200)

圖7 細(xì)胞凋亡流式圖

表5 miR-1200的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0016788對肝癌MHCC97細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

表6 miR-1200的下調(diào)逆轉(zhuǎn)了抑制circ_0016788對肝癌MHCC97細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1～4:si-NC組，si-circ_0016788組，si-circ_0016788+anti-miR-NC組，si-circ_0016788+anti-miR-1200組

3 討 論

越來越多的分子靶向藥物已用于治療晚期肝癌，但是，因為腫瘤的異質(zhì)性和復(fù)雜的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，單靶標(biāo)治療結(jié)果不盡如人意，因此提出針對多靶點的聯(lián)合治療〔8〕。而深入研究肝癌發(fā)病的分子機制，才能尋找更有效的靶點以開發(fā)新的靶向藥物。研究表明circRNA可通過調(diào)控miRNA影響肝癌的進(jìn)展〔9〕。如circ_0000502通過靶向miR-124促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移并抑制細(xì)胞凋亡〔10〕。circRNA_103809通過調(diào)節(jié)miR-377-3p/成纖維細(xì)胞生長因子受體(FGFR)1/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)軸促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)展〔11〕。circRNA-104718通過miR-218-5p/TXNDC5可加速肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲并抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。研究證實，circ_0016788在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，抑制circ_0016788表達(dá)可降低肝癌MHCC97細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力，促進(jìn)其凋亡〔4〕。本實驗結(jié)果顯示，肝癌組織中circ_0016788表達(dá)水平升高，而抑制circ_0016788表達(dá)可抑制肝癌MHCC97細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與既往研究結(jié)果相一致。

研究表明，miRNA在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，miR-1179過表達(dá)減弱了肝癌細(xì)胞的增殖和遷移能力〔13〕。miR-206通過調(diào)節(jié)cMET表達(dá)抑制肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，但促進(jìn)凋亡〔14〕。本實驗通過在線預(yù)測軟件預(yù)測顯示circ_0016788與miR-1200存在互補結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實circ_0016788可靶向調(diào)控miR-1200。有研究報道顯示circ_0026359通過靶向miR-1200/DNA聚合酶δ4亞基(POLD4)途徑增強胃癌的順鉑耐藥性〔15〕。本實驗結(jié)果提示miR-1200可能參與了肝癌的進(jìn)展過程。同時抑制miR-1200和circ_0016788表達(dá)可促進(jìn)肝癌MHCC97細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，說明下調(diào)miR-1200表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制circ_0016788對MHCC97細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用。綜上，circ_0016788可通過靶向調(diào)控miR-1200抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。