電針對(duì)缺氧缺血性腦損傷小鼠抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)神經(jīng)可塑性的作用機(jī)制

喬梁 李榮霞 胡山崗

(1河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002；2青海省人民醫(yī)院)

在我國(guó)，缺氧缺血性腦損傷(HIBI)可導(dǎo)致不同程度神經(jīng)功能障礙〔1〕。神經(jīng)功能障礙的主要原因有氧化應(yīng)激、自由基損傷、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞毒性等〔2，3〕。電針是在傳統(tǒng)的針灸基礎(chǔ)上進(jìn)行改革創(chuàng)新，是利用結(jié)合電刺激發(fā)展起來(lái)的一種治療技術(shù)。電針對(duì)腦缺氧缺血后導(dǎo)致的半暗帶有很好的修復(fù)作用，改善腦能量代謝，并能明顯改善患者后期的恢復(fù)情況，非常具有臨床價(jià)值〔4〕。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)2介導(dǎo)的信號(hào)通路是機(jī)體防御性抗氧化的重要通路，Nrf2可以對(duì)細(xì)胞抗氧化反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，并與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)共同作用對(duì)抗氧化應(yīng)激過(guò)程〔5〕，在生物體中的防御抵抗機(jī)制中扮演著舉足輕重的作用〔5〕。本研究探討電針?lè)▽?duì)HIBI雄性小鼠抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)神經(jīng)可塑性的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)于河南省康華藥業(yè)股份有限公司(許可證號(hào)：SYXK(豫)2017-0015)，體重(18±3)g，在本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行飼養(yǎng)，自由飲食，實(shí)驗(yàn)中心的環(huán)境溫度為(24±3)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，每天12 h循環(huán)光照。

1.2藥品與主要試劑 PowerLab生理記錄儀(澳大利亞AD Instruments公司)，韓氏電針儀HANS-200(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，水迷宮(東樂(lè)自然基因生命科學(xué)公司)，2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC,美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：T8877-25G)；末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(TUNEL)測(cè)定法試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：S7110)，Nrf2 inhibitors(美國(guó)TargetMol公司，批號(hào)：M00240)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：K1622)，Trizol 試劑盒(TaKaRa，批號(hào)：9108-1)，全蛋白抽提試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)：37901)，Western印跡試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)：SNM464)。

1.3動(dòng)物模型建立及分組 將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組和電針+Nrf2 inhibitors組，每組20只。根據(jù)參考文獻(xiàn)中描述的Rice法建立HIBI模型〔6〕，對(duì)模型組、電針組和電針+Nrf2 inhibitors組建立模型：用戊巴比妥鈉對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，仰臥法固定，在頸中部消毒切開(kāi)，分離左頸總動(dòng)脈，采用4-0號(hào)手術(shù)線進(jìn)行血管結(jié)扎，縫合傷口；2 h進(jìn)行恢復(fù)后，將實(shí)驗(yàn)小鼠放入37℃水浴中進(jìn)行密閉缺氧環(huán)境處理，給予8%O2+92%N2混合氣體進(jìn)行缺氧處理持續(xù)2.5 h。假手術(shù)組僅進(jìn)行手術(shù)后縫合，不對(duì)其進(jìn)行血管結(jié)扎和缺氧處理。參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，電針組選取部位為“內(nèi)關(guān)”穴，雙極電針為0.28 mm×25 mm的針灸針制成，針刺深度為1～2 mm，電針參數(shù)為：2 Hz/100 Hz，電流終刺激強(qiáng)度為2 mA，治療時(shí)間20 min，每天治療2次，持續(xù)5 d。電針+Nrf2 inhibitors組在電針刺激結(jié)束后，向小鼠腹腔注射N(xiāo)rf2 inhibitors(ML385)30 mg/kg，1次/d，持續(xù)5 d。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：模型組小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分≥2分。

1.4小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 采用盲法進(jìn)行小鼠的神經(jīng)功能評(píng)分。根據(jù)Bederson法〔7〕，抓取小鼠尾巴并把它抬高至離桌面10 cm處，觀察各組小鼠形態(tài)并打分。標(biāo)準(zhǔn)：0分：前肢是伸展?fàn)顟B(tài)(無(wú)神經(jīng)功能損傷)；1分：對(duì)側(cè)腕、肘屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分：前肢抵抗對(duì)側(cè)推力的能力水平下降；3分：對(duì)側(cè)轉(zhuǎn)圈。

1.5小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力考察 干預(yù)結(jié)束7 d后，隨機(jī)從每組中取6只實(shí)驗(yàn)小鼠，采用Morris水迷宮檢測(cè)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行檢測(cè)。其中前5 d進(jìn)行平臺(tái)訓(xùn)練：平臺(tái)高30 cm、直徑12 cm，然后放于迷宮的其中1個(gè)象限中，放入的水下深入為水下1 cm處；然后將小鼠分別放于4個(gè)方向，分5次進(jìn)行3 min的探索直至找到平臺(tái)，以小鼠到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間作為逃避潛伏期；若小鼠在2 min內(nèi)沒(méi)有找到平臺(tái)，則被引導(dǎo)至平臺(tái)停留15 min。從第6天開(kāi)始為空間搜索階段：將平臺(tái)進(jìn)行移除，把小鼠放入水迷宮中，同樣的方法進(jìn)行2 min的測(cè)試，以穿過(guò)平臺(tái)位置的次數(shù)作為穿臺(tái)指數(shù)。利用MT-200 Morris自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠的實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行記錄，以此來(lái)分析逃避潛伏期和穿臺(tái)指數(shù)。

1.6小鼠腦組織梗死情況觀察 干預(yù)結(jié)束后，隨機(jī)從每組中另取4只實(shí)驗(yàn)小鼠斷頭處死，取出腦組織，放入4℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)中進(jìn)行5 min冷卻處理，然后進(jìn)行切片，厚度為2 mm。然后將切片浸入2%的TTC溶液中(35℃恒溫，30 min)，用4℃的PBS進(jìn)行2次清洗，隨后進(jìn)行10%甲醛溶液固定，掃描拍照。紅色部位是正常的腦組織，白色部位是梗死區(qū)域的腦組織。采用Image J軟件統(tǒng)計(jì)測(cè)量切片腦組織梗死面積，梗死面積比為梗死面積占同側(cè)缺血腦組織總面積的百分比。

1.7海馬區(qū)腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況觀察 干預(yù)后，隨機(jī)從每組中另取10只實(shí)驗(yàn)小鼠斷頭處死，取實(shí)驗(yàn)小鼠海馬區(qū)腦組織，進(jìn)行4%多聚甲醛固定，石蠟包埋處理后進(jìn)行切片處理(厚度為4 μm)，之后進(jìn)行脫蠟，染色，脫水，透明，封片。采用TUNEL染色法對(duì)腦組織細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色，鏡下觀察時(shí)隨機(jī)選取5個(gè)視野(×400)，凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.8RT-qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá) 依據(jù)Trizol法提取各組樣本的總RNA，使用引物如下：B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2：上游引物：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′，下游：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-9：上游引物：5′-CTTCGTTTCTGCGAACTAACAGG-3′，下游：5′-GCACCACTGGGGTAAGGTTT-3′;Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)：上游引物：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′，下游：5′-CCAG CCCATGATGGTTCTGAT-3′，β-actin：上游引物：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACT-3′，下游：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。反應(yīng)條件：75℃預(yù)變性，2 min，進(jìn)入以下循環(huán)90℃變性，5 min；60℃退火，60 s；72℃延伸，30 s；共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCT表示。獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.9免疫組化檢測(cè)Nrf2和血紅素加氧酶(HO)-1 表達(dá) 組織切片進(jìn)行脫蠟至水，然后再PBS溶液中進(jìn)行修復(fù)，室溫下3%的過(guò)氧化氫浸泡，封閉，然后進(jìn)行一抗4℃孵育過(guò)夜，第2天用PBS清洗3次，加入二抗，室溫孵育30 min，PBS清洗3次。加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)孵育5 min，去離子水終止反應(yīng)，然后用蘇木素復(fù)染5 min，清洗后進(jìn)行不同濃度梯度的乙醇脫水2 h，中性樹(shù)膠封片，最后用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)，每個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。

1.10Western印跡檢測(cè)堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、突觸后密度蛋白(PSD)95和突觸小泡蛋白(SYP)表達(dá) 分別收集各組樣本，用總蛋白提取試劑盒提取每組中的總蛋白，二喹啉甲醛(BCA)蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白含量。制備蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，加含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封閉液室溫條件下封閉2 h。加入一抗在4℃條件下封閉過(guò)夜。次日用緩沖液清洗PVDF膜3次，然后加入二抗，室溫孵育1 h后，加入顯色液曝光顯影。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，作圖工具采用Graphpad5.01軟件。

2 結(jié) 果

2.1小鼠神經(jīng)功能評(píng)分 與假手術(shù)組(0分)相比，模型組神經(jīng)功能評(píng)分〔(2.6±0.75)分〕明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組神經(jīng)功能評(píng)分〔(0.8±0.12)分〕明顯降低(P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組神經(jīng)功能評(píng)分〔(1.8±0.37)分〕明顯低于模型組，明顯高于電針組(P<0.05)。

2.2小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在平臺(tái)訓(xùn)練階段，隨著訓(xùn)練時(shí)間的推移和次數(shù)的增加，模型組、電針組、電針+Nrf2 inhibitors組逃避潛伏期逐漸縮減(均P<0.01)；與假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期在各時(shí)間點(diǎn)均顯著變長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組相比，電針組逃避潛伏期在各時(shí)間點(diǎn)均顯著變短；電針+Nrf2 inhibitors組逃避潛伏期較模型組明顯縮短，較電針組明顯延長(zhǎng)(P<0.05)。在空間搜索階段，與假手術(shù)組相比，模型組穿臺(tái)指數(shù)顯著降低；與模型組相比，電針組穿臺(tái)指數(shù)顯著升高，電針+Nrf2 inhibitors組穿臺(tái)指數(shù)明顯高于模型組，明顯低于電針組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組逃避潛伏期和穿臺(tái)指數(shù)比較

2.3電針對(duì)小鼠腦組織梗死的影響 假手術(shù)組腦組織呈紅色，無(wú)白色區(qū)域，表明無(wú)梗死現(xiàn)象發(fā)生；與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中的白色梗死區(qū)域明顯變大，梗死面積比顯著上升；與模型組相比，電針組腦組織的白色梗死區(qū)域面積明顯縮小，梗死面積比顯著降低；電針+Nrf2 inhibitors組白色梗死區(qū)域面積介于模型組和電針組之間，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1、表2。

2.4電針對(duì)小鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 假手術(shù)組未見(jiàn)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，與假手術(shù)組相比，模型組的腦組織切片中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，電針組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組腦組織切片中TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組，明顯高于電針組(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖1 各組腦組織的TTC染色(×10)

表2 各組腦組織梗死面積比、細(xì)胞凋亡率結(jié)果及Bax、Caspase-9、Bcl-2的mRNA表達(dá)量比較

圖2 各組腦組織(TUNEL染色，×400)

2.5Bax、Caspase-9、Bcl-2 mRNA表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組Bax和Caspase-9 mRNA表達(dá)明顯升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，電針組Bax和Caspase-9 mRNA表達(dá)明顯降低，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組中Bcl-2、Bax和Caspase-9 mRNA表達(dá)水平介于模型組和電針組之間，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.6免疫組化檢測(cè)Nrf2和HO-1表達(dá) 與假手術(shù)組相比，模型組中Nrf2和HO-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，電針組Nrf2和HO-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯升高(均P<0.05)；電針+Nrf2 inhibitors組中Nrf2和HO-1蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)介于模型組和電針組之間，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)表3，圖3。

2.7bFGF、BDNF、PSD95 和 SYP 蛋白表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果 與假手術(shù)組相比，模型組腦組織中bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達(dá)水平均明顯下調(diào)(P<0.05)；電針組中上述蛋白的表達(dá)水平較模型組均明顯上調(diào)；電針+Nrf2 inhibitors組中bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達(dá)水平介于模型組和電針組之間，組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表3。

表3 各組Nrf2和HO-1陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)量、bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達(dá)比較

圖3 Nrf2和HO-1海馬區(qū)腦組織中的表達(dá)變化(免疫組化，×400)

1～4：假手術(shù)組、模型組、電針組、電針+Nrf2 inhibitors組

3 討 論

電針是近些年來(lái)在傳統(tǒng)針灸技術(shù)基礎(chǔ)上通過(guò)改革創(chuàng)新而發(fā)展起來(lái)的一種治療技術(shù)，利用結(jié)合電刺激方式被廣泛地應(yīng)用于臨床治療中，尤其是在缺氧缺血性腦損傷及神經(jīng)損傷恢復(fù)等方面引起廣泛關(guān)注〔8〕。劉波等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，電針?lè)òl(fā)揮腦保護(hù)效應(yīng)可能是通過(guò)減少自由基和抑制大腦皮質(zhì)內(nèi)凋亡誘導(dǎo)因子，進(jìn)而對(duì)受損的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行改善和修復(fù)。然而，目前關(guān)于電針治療腦缺氧缺血的具體作用機(jī)制尚不十分清楚〔10〕。本研究結(jié)果證明，電針可對(duì)HIBI小鼠的神經(jīng)功能損傷具有改善效果。

研究表明，當(dāng)小鼠腦組織發(fā)生缺氧缺血損傷時(shí)，神經(jīng)細(xì)胞由于會(huì)產(chǎn)生活性氧和自由基等，最終將會(huì)使神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡〔11〕。其中Bcl-2、Caspase-9及Bax是與細(xì)胞凋亡息息相關(guān)的基因，通過(guò)激活Caspase-9和Bax可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2可以抑制細(xì)胞凋亡〔12〕。馬競(jìng)等〔13〕通過(guò)構(gòu)建HIBI小鼠模型指出，黨參多糖可以通過(guò)調(diào)控Bax和Bcl-2等細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)抑制HIBI所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果表明，電針可以降低HIBI小鼠腦組織的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

Nrf2信號(hào)通路在抗氧化還原、氧化應(yīng)激等方面具有非常重要的作用〔14〕，Nrf2是在細(xì)胞進(jìn)行氧化應(yīng)激過(guò)程中的關(guān)鍵因子，通常情況下Nrf2與Keap1在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，此時(shí)是未激活狀態(tài)；當(dāng)受到刺激被激活時(shí)，Keap1-Nrf2結(jié)合體變得不穩(wěn)定，Keap1發(fā)生降解，Nrf2被釋放出來(lái)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)下游GST、HO-1或NQO1等一系列啟動(dòng)保護(hù)性蛋白基因的表達(dá)〔15〕。Gao等〔16〕發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)Nrf2/HO-1通路進(jìn)行調(diào)控，可以減輕HIBI模型大鼠的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，提示Nrf2/HO-1通路的神經(jīng)保護(hù)作用潛力。研究表明，電針可以促進(jìn)Nrf2和ARE的表達(dá)，從而啟動(dòng)細(xì)胞氧化應(yīng)激機(jī)制〔17〕。本研究結(jié)果可能與HIBI模型小鼠抗氧化還原、氧化應(yīng)激有著密切關(guān)系。神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)中樞和外周神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育分化具有促進(jìn)作用，維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能，加快神經(jīng)功能損傷后的修復(fù)〔18〕。bFGF和BDNF是神經(jīng)生長(zhǎng)因子家族的一種，能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、分化，促進(jìn)缺氧缺血性腦損傷修復(fù)〔19〕，PSD95和SYP也是突觸后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和整合的關(guān)鍵物質(zhì)，與HIBI也密切相關(guān)〔20〕。Sheng等〔21〕指出，BDNF-TrkB途徑可以通過(guò)穩(wěn)定離子穩(wěn)態(tài)、抑制興奮性遞質(zhì)釋放和減弱中斷的神經(jīng)元傳遞來(lái)保護(hù)神經(jīng)元，對(duì)HIBI具有神經(jīng)可塑性；鄔春久等〔22〕則表明，上調(diào)PSD95蛋白表達(dá)對(duì)HIBI具有改善作用。本研究表明電針可以促進(jìn)HIBI模型小鼠的神經(jīng)可塑性，進(jìn)一步發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。