清潤一號方對慢傳輸型便秘大鼠的作用及機制

秦婷婷 車瑾 曹蔚 韓慧敏 劉揚 程慧妤 夏俊 徐洋

(武漢市第三醫(yī)院腫瘤科，湖北 武漢 430060)

慢性傳輸型便秘(STC)定義為結(jié)腸蠕動和糞便頻率降低，通常伴有腹脹，是一種常見的胃腸道疾病，其不僅嚴重影響生活質(zhì)量，而且給患者造成了一定的經(jīng)濟負擔〔1，2〕。近年來，STC患病率不斷增加，但其發(fā)病機制仍不清楚，使其成為臨床治療的難題。目前，用于治療STC的藥物是瀉藥和催化藥物，刺激性瀉藥的使用效果顯著，但不良反應(yīng)明顯，并且容易形成藥物依賴性〔3〕。中醫(yī)藥治療具有安全性高，療效顯著的優(yōu)勢。貼敷療法是中醫(yī)藥治療的一種，是將中藥磨成細粉或做成膏劑，貼敷于穴位或者患處的治療方式。研究表明〔4，5〕，穴位貼敷療法可使中藥通過穴位皮膚吸收，刺激穴位調(diào)節(jié)臟腑氣血，達到治療作用。臨床研究〔6〕發(fā)現(xiàn)，清潤一號方敷貼可緩解STC患者的便秘情況，本研究通過建立STC大鼠模型，探討清潤一號方中藥敷貼方劑對STC大鼠的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔SD成年雄大鼠15只，體重(200±10)g，動物來源于三峽大學，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(鄂)2017-0012，使用許可證，：SYXK(鄂)2018-0104。室內(nèi)溫度18～27℃，濕度45%～65%，正常喂食水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后開始造模。

1.2藥物 清潤一號方〔6〕：50 g大黃(批號：20181201)，20 g玄明(批號：20181201)，20 g茴香(批號：20181001)，10 g澤瀉(批號：20190404)，10 g玄參(批號：20190301)，10 g黃芪(批號：20180401)均購自湖北天濟中藥飲片有限公司；60 g醫(yī)用凡士林隔水加熱溶解成液狀，按1∶2的終比例依次加入中藥精細粉，混勻成膏狀，冷卻后備用。準備相應(yīng)大小穴位貼，大小為3 cm×4 cm，其中給藥區(qū)直徑約1.5 cm。取調(diào)制好的膏劑5 g，涂于穴位貼中，制成直徑1.5 cm，厚約0.5 cm的藥膏。

1.3試劑與儀器 主要試劑：大鼠血管活性腸肽(VIP)、神經(jīng)降壓素(NT)、胃動素(MTL)、P物質(zhì)(SP)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(Bioswamp，中國)；TritonX-100(北京索萊寶科技有限公司，中國)；甲醛，二甲苯，無水乙醇，30% H2O2，粉末活性炭(分析純，國藥集團化學試劑有限公司，中國)。主要儀器：酶標儀(Ladsystems，芬蘭)，離心機(湖南平凡科技有限公司，中國)，顯微鏡(Leica公司，德國)；冷凍切片機(湖北徠克醫(yī)療儀器有限公司，中國)。

1.4STC大鼠模型的構(gòu)建及鑒定 造模組均每日給予洛哌丁胺混懸液10 ml(2 mg/kg，分別于每日9∶00，17∶00給藥，每次5 ml)灌胃，共7 d。大鼠攝食量明顯減少，糞便排出數(shù)量及質(zhì)量顯著降低，即建模成功。

1.5實驗分組及處理 將15只SD大鼠分為對照組、模型組和中藥貼敷組各5只。模型組：每日給予洛哌丁胺混懸液10 ml(2 mg/kg，分別于每日9∶00，17∶00)灌胃，共7 d。中藥貼敷組：造模成功后貼敷中藥，給藥前1 d給大鼠腹部脫毛，面積約為5 cm×5 cm，酒精棉球消毒后在腹壁貼穴位敷貼，每貼內(nèi)約含生藥5 g，每24 h更換1次，共3 d。造模成功后，自貼敷給藥第1天起，每日記錄糞便數(shù)量(粒)和質(zhì)量(干重和濕重)。

1.6糞便數(shù)量及含水率檢測 記錄給藥后所有大鼠的首次排便時間，收集大鼠糞便，記錄排便數(shù)量，測定糞便干、濕重，計算糞便含水率(%)=糞便濕重-糞便干重/糞便濕重×100%。

1.7活性炭推進實驗檢測腸道傳輸功能 用活性炭10 g加蒸餾水100 ml制成10%炭末混懸液，所有大鼠用10 ml 10%活性炭混懸液灌胃，并于2 h后頸椎脫臼處死，立即剖腹摘除從幽門至直腸末端的全部腸道，進行指標觀察及測算。將摘除的全部腸道置于托盤中，在松弛狀態(tài)下測量腸道的全長及活性炭混懸液在腸道內(nèi)推進的長度，并計算活性炭混懸液推進長度與腸道全長的百分比。炭末推進百分率(%)=炭末前端與幽門的距離/腸道全長×100%。

1.8Cajal間質(zhì)細胞(ICC)形態(tài)學觀察 將所有腸道置于冰凍切片機中，用OCT包埋劑包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色。每張切片染色陽性區(qū)域隨機選擇5個高倍鏡視野(×200)觀察，并選擇結(jié)腸區(qū)域環(huán)肌層在400倍光學顯微鏡下數(shù)陽性細胞個數(shù)，以每個高倍鏡視野下陽性細胞個數(shù)的平均值做統(tǒng)計學分析。

1.9ELISA檢測血清VIP、NT、MTL和SP的含量 給藥結(jié)束后，從大鼠腹腔抽取5 ml血液，37℃靜置30 min，待血液凝結(jié)后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，放置-80℃冰箱保存，采用ELISA分別檢測VIP、NT、MTL和SP含量，嚴格按照說明書上操作。

1.10統(tǒng)計學處理 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗，使用Graph Pad Prism5軟件進行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié) 果

2.1清潤一號方對STC大鼠糞便數(shù)量及含水率的影響 與對照組比較，模型組在第5天起糞便數(shù)量和含水率明顯減少(P<0.05)。提示便秘模型構(gòu)建成功。與模型組相比，清潤一號方組進行敷貼治療第8天起，糞便含水率顯著增加，第9天起糞便數(shù)量顯著增加(P<0.05)。見表1、表2。

表1 各組糞便數(shù)量的變化粒)

表2 各組糞便含水率的變化

2.2清潤一號方對STC大鼠結(jié)腸傳輸功能的影響 與對照組〔(97.37±0.60)%〕相比，模型組活性炭推進率〔(92.83±0.15)%〕顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，清潤一號方組活性炭推進率〔(96.67±0.40)%〕顯著升高(P<0.05)。

2.3清潤一號方對STC大鼠結(jié)腸ICC的影響 大鼠結(jié)腸ICC形態(tài)觀察和陽性細胞數(shù)量變化：每張切片在400倍顯微鏡下觀察，并計算陽性細胞個數(shù)，各組免疫組化結(jié)果表明，模型組ICC陽性細胞數(shù)〔(2.56±1.81)個〕較對照組〔(13.67±2.00)個〕明顯減少，清潤一號方組〔(6.78±1.86)個〕較模型組陽性細胞數(shù)顯著增加(均P<0.05)。見圖1。

2.4清潤一號方對STC大鼠VIP、NT、MTL和SP的影響 與對照組比較，其余兩組血清中VIP、NT、MTL和SP含量均顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，清潤一號方組血清中VIP、NT、MTL和SP含量均顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 清潤一號方對血清中VIP、NT、MTL和SP含量的影響

3 討 論

便秘會嚴重降低患者的生活質(zhì)量，并給患者及其家人帶來經(jīng)濟負擔〔7，8〕。人們已經(jīng)注意到STC對患者健康的影響，但仍需要進一步的研究以了解其發(fā)病機制并找到有效的治療方法〔9，10〕。有臨床研究發(fā)現(xiàn)〔11，12〕，中藥穴位敷貼對便秘有較好的改善作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)清潤一號方組處理后，大鼠癥狀較模型組得到明顯緩解，主要表現(xiàn)為糞便數(shù)量及含水量增多，結(jié)腸運輸功能有所提高。

消化道同心臟，具有自然起搏器〔13〕，其收縮活動可受起搏器的慢波控制〔14〕。疊加在慢波電位上的動作電位可引起消化道平滑肌的收縮。ICC位于胃腸道的神經(jīng)末梢與平滑肌細胞之間，具有產(chǎn)生電慢波，參與胃腸興奮傳遞，調(diào)控胃腸平滑肌運動的自主節(jié)律性功能。因此，ICC已被認為是胃腸運動的起搏器細胞，同時也被認為是神經(jīng)傳遞的介質(zhì)〔15〕。ICC的減少和功能障礙可能導致結(jié)腸中慢波活動的減少，并阻斷腸神經(jīng)系統(tǒng)與平滑肌細胞之間的信息傳遞，延遲起搏器細胞與平滑肌細胞之間的電興奮性傳遞，并導致平滑肌收縮力降低，結(jié)腸運動障礙和糞便轉(zhuǎn)運延遲〔16〕。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常者相比，STC患者結(jié)腸中的ICC密度顯著降低〔17，18〕。因此可通過使用藥物改善ICC功能來治療STC。本研究結(jié)果說明，清潤一號方對大鼠便秘的改善作用可能與ICC的調(diào)控有關(guān)。

有研究表明，神經(jīng)遞質(zhì)的改變與STC的發(fā)病機制有關(guān)〔19〕，且ICC作為神經(jīng)遞質(zhì)的靶向細胞，對一些神經(jīng)遞質(zhì)具有反應(yīng)性〔15，20〕。神經(jīng)遞質(zhì)包括興奮性遞質(zhì)和抑制性遞質(zhì)，SP、MTL和NT具有促進胃腸運動的能力〔21，22〕，VIP主要參與調(diào)解腸平滑肌和血管平滑肌舒張，增強胃腸道黏膜的分泌作用〔20〕。本研究結(jié)果提示，清潤一號方可能是通過調(diào)控大鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平達到促進腸道蠕動、緩解便秘的功效。

綜上，清潤一號方在治療慢傳輸型便秘方面具有較好的效果，其作用機制可能與調(diào)控ICC-腸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)促進腸道蠕動有關(guān)。