輕度認(rèn)知障礙患者血漿中差異表達(dá)microRNA生物信息學(xué)分析

劉艷 于明 徐宇浩

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

輕度認(rèn)知障礙(MCI)是介于正常老化和癡呆之間的臨界狀態(tài)〔1〕。研究表明60歲以上的成年人中MCI患病率為6.7%～25.2%，其患病率的增加與年齡的增長及低教育水平高度相關(guān)，以男性更為常見〔2〕。據(jù)估計(jì)，每年有10%～ 15%的MCI患者會(huì)發(fā)展為阿爾茨海默病(AD)〔3〕。若及早發(fā)現(xiàn)和識(shí)別MCI階段，并對(duì)其進(jìn)行積極有效的干預(yù)治療，可改善患者的認(rèn)知功能，延緩MCI向AD轉(zhuǎn)化。因此，探索MCI早期診斷及預(yù)測疾病進(jìn)展的生物標(biāo)志物一直是研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。

microRNAs是調(diào)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能的關(guān)鍵因子〔4〕。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，生物液體中的microRNA水平分析已經(jīng)成為一種可行的生物標(biāo)志物診斷方法。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析和篩選MCI患者血漿中關(guān)鍵的microRNAs，并對(duì)關(guān)鍵microRNA的靶基因進(jìn)行富集分析。

1 材料與方法

1.1基因芯片數(shù)據(jù)來源 在NCBI(National center for biotechnology information)公共數(shù)據(jù)平臺(tái)的GEO(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數(shù)據(jù)庫搜索框中以“(mild cognitive impairment)AND microRNA”為檢索詞，選擇物種為人類(Homo sapiens)，下載GSE90828基因芯片數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE90828)。該數(shù)據(jù)集是基于GPL22741平臺(tái)采用(Human PCR panels Ⅰ+Ⅱ，V2)miRCURY LNATMmicroRNA芯片(丹麥Exiqon公司)檢測的53例血漿標(biāo)本，包含來自日本23例MCI患者和30例認(rèn)知功能正常的老年人的血漿標(biāo)本。MCI組樣本來源于11例男性和12例女性，平均年齡(72.78±6.80)歲；正常對(duì)照組樣本來源于12例男性和18例女性，平均年齡(70.40±4.51)歲。

1.2差異表達(dá)microRNA的篩選和數(shù)據(jù)處理 利用GEO2R在線分析工具(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)對(duì)GSE90828數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異表達(dá)microRNA分析和篩選，利用Benjamini-Hochberg方法減少錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。設(shè)定差異表達(dá)microRNA過濾條件為校正后的P值<0.05且|差異倍數(shù)(logFC)|≥1.0，其中l(wèi)ogFC≥1.0為上調(diào)、logFC≤-1.0為下調(diào)。運(yùn)用R(3.6.3版本)語言程序包繪制火山圖和差異表達(dá)microRNA熱圖。

1.3差異表達(dá)microRNA的靶基因預(yù)測 采用TargetScan7.2(http：//www.targetscan.org/vert_72/)在線預(yù)測工具預(yù)測差異表達(dá)microRNA的靶基因〔5〕，即通過尋找與microRNA種子序列相匹配的保守的8mer、7mer和6mer位點(diǎn)來預(yù)測microRNA的生物學(xué)靶點(diǎn)，選擇物種為人，并以Cumulative weighted context++ score<-0.4篩選靶基因，該分值越小則靶基因的置信度越高〔6〕。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析 STRING11.0(https：//string-db.org)是一個(gè)常用的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作關(guān)系的數(shù)據(jù)庫，共存儲(chǔ)5 090個(gè)物種和2 460萬種蛋白質(zhì)，擁有非常廣泛和多樣的基準(zhǔn)數(shù)據(jù)來源〔7〕。通過對(duì)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的可靠性評(píng)分，以判定相互作用可靠性的大小。STRING將低可靠性、中等可靠性、高可靠性和最高可靠性的分值分別設(shè)置為0.15、0.40、0.70、0.90。本研究中構(gòu)建編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的篩選條件為中等可靠性的閾值(即Confidence score =0.4)，然后利用Cytoscape3.7.2 軟件〔8〕將蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，通過CytoHubba插件，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有節(jié)點(diǎn)進(jìn)行評(píng)分，采用最大集團(tuán)中心度(MCC)算法，篩選前10個(gè)關(guān)鍵基因(Hub Genes)。

1.5差異表達(dá)microRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵microRNA篩選 Cytoscape3.7.2 軟件構(gòu)建差異表達(dá)microRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，使差異表達(dá)microRNA與靶基因的相互作用進(jìn)行可視化，從而篩選相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵microRNA。差異表達(dá)microRNA靶基因的篩選閾值為cumulative weighted context++ score<-0.4。利用CytoNCA插件度量網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的中心度(Centrality)值，選擇點(diǎn)度中心性(DC)參數(shù)，刪去DC值<2的節(jié)點(diǎn)，進(jìn)而得到核心網(wǎng)絡(luò)，依據(jù)DC值大小進(jìn)行排序，篩選核心網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵 microRNA。

1.6關(guān)鍵microRNA靶基因的基因本體論(GO)富集分析及京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 GO富集分析能夠?qū)Ω魑锓N基因和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行規(guī)范性描述，按照生物過程、分子功能和細(xì)胞組成對(duì)基因進(jìn)行注釋和分類。KEGG是1個(gè)整合了基因組、化學(xué)、健康、系統(tǒng)4大類信息的綜合數(shù)據(jù)庫，通過強(qiáng)大的圖形功能直觀可視化地展現(xiàn)信號(hào)途徑及各分子間的關(guān)系。使用R語言對(duì)關(guān)鍵microRNA 的靶基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路分析。其中GO富集分析以q值Cutoff(校正后的P值臨界值)<0.05為篩選條件且顯示前10個(gè)GO富集分析條目；KEGG富集分析以q值Cutoff<0.05 為篩選條件且顯示前30個(gè)通路信息。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1血漿差異表達(dá)microRNA篩選 基于MCI組與正常對(duì)照組的logFC表達(dá)和校正后的P值篩選差異表達(dá)的microRNA。與正常對(duì)照組相比，MCI組血漿中存在14個(gè)顯著下調(diào)microRNAs。顯著下調(diào) microRNAs的具體表達(dá)情況，見表1、圖1、圖2。

表1 MCI組患者血漿中顯著下調(diào)的microRNAs

灰點(diǎn)表示下調(diào)的 microRNAs，黑點(diǎn)表示無差異的microRNAs

2.2靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及關(guān)鍵基因的篩選 利用STRING 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)圖涵蓋節(jié)點(diǎn)蛋白1 022個(gè)、邊3 301條，平均節(jié)點(diǎn)值為6.46，見圖3。利用CytoHubba插件，篩選出前10個(gè)關(guān)鍵基因，分別為泛素結(jié)合酶(UB)E2D1、轉(zhuǎn)錄延伸因(TCE)B1、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白(RBBP)6、泛素蛋白連接酶E3α2(UBR2)、UBE2W、錨蛋白重復(fù)序列與SOCS盒蛋白(ASB)6、Cbl原癌基因(CBL)B、環(huán)指蛋白(RNF)7、F盒蛋白(FBX)O10和葡萄糖胺(GLMN)，它們是蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因。

2.3差異表達(dá)microRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵microRNA的篩選 構(gòu)建差異表達(dá)microRNA-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖4。利用CytoNCA插件篩選網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵microRNA，DC值居于前4位的microRNAs分別為hsa-miR-27b、hsa-miR-146a、hsa-miR-23a 和has-miR-93*，是調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵microRNAs。

2.4關(guān)鍵microRNA靶基因的GO富集分析 hsa-miR-27b主要參與了神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)控、軸突生成、化學(xué)突觸傳遞、跨突觸信號(hào)的調(diào)節(jié)及額葉發(fā)育等生物學(xué)過程；hsa-miR-146a主要參與了信號(hào)釋放、糖蛋白代謝、高爾基囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)及囊泡定位等生物學(xué)過程；hsa-miR-23a主要參與了胚胎器官發(fā)育、泌尿生殖系統(tǒng)、蛋白激酶活性的激活及間充質(zhì)細(xì)胞分化等生物學(xué)過程；hsa-miR-93*主要參與了神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)控、腺體發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)及糖蛋白代謝等生物學(xué)過程，見圖5。

藍(lán)色代表正常對(duì)照組樣本，紅色代表MCI組樣本

圓圈代表蛋白質(zhì)，直線代表蛋白質(zhì)間的相互作用；蛋白質(zhì)中的螺旋表示該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)已知，圓圈內(nèi)為空表示該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)未知

紅色表示 microRNA；綠色表示基因

A：hsa-miR-27b,B：hsa-miR-146a,C：hsa-miR-23a,D：hsa-miR-93*;橫坐標(biāo)為基因比例，圓圈越大表示富集在該GO上的基因數(shù)目越多；縱坐標(biāo)為各分子參與的生物學(xué)過程

2.5關(guān)鍵microRNA靶基因的KEGG通路分析 hsa-miR-27b的靶基因主要參與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、人鼠肉瘤(Ras)信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向、蛋白聚糖及調(diào)節(jié)干細(xì)胞多能性等信號(hào)通路，hsa-miR-146a的靶基因主要參與1型單純皰疹病毒感染、卟啉與葉綠素代謝及軸突導(dǎo)向等信號(hào)通路，hsa-miR-23a的靶基因主要參與糖胺聚糖的生物合成、軸突導(dǎo)向及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等信號(hào)通路，hsa-miR-93*的靶基因主要參與Wnt信號(hào)通路、表皮生長因子受體(EGFR)抑制劑的耐藥性、Hippo信號(hào)通路及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白激酶(mTOR)等信號(hào)通路，見圖6。

A：hsa-miR-27b，B：hsa-miR-146a，C：hsa-miR-23a，D：hsa-miR-93*；橫坐標(biāo)為富集在每個(gè)通路上基因的數(shù)目，顏色越紅表示基因在該通路上富集程度越高；縱坐標(biāo)為各通路名稱

3 討 論

MCI作為認(rèn)知障礙的早期階段，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能的輕度減退，但日常生活能力不受影響且尚未達(dá)到癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)。Petersen等〔9〕將MCI分為遺忘型MCI(aMCI)和非遺忘型MCI(naMCI)兩種類型，并且指出aMCI最易向AD轉(zhuǎn)化。而AD是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病〔10〕，其發(fā)病機(jī)制主要有β-樣淀粉蛋白(Aβ)瀑布學(xué)說、Tau蛋白學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白障礙學(xué)說及線粒體功能障礙等，但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚〔11〕。然而，目前尚沒有一種藥物被批準(zhǔn)用于治療MCI，同時(shí)針對(duì)AD發(fā)病機(jī)制不同靶點(diǎn)的藥物開發(fā)仍處于試驗(yàn)階段。

研究已證實(shí)突觸可塑性在AD的早期發(fā)展中起著核心作用〔12〕，因此本研究推測hsa-miR-27b可能通過調(diào)節(jié)突觸傳遞過程成為MCI的潛在治療靶點(diǎn)。另外，單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量與認(rèn)知功能密切相關(guān)〔13〕，而hsa-miR-93*與神經(jīng)遞質(zhì)水平的調(diào)節(jié)有關(guān)，提示hsa-miR-93*可能通過調(diào)節(jié)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平，參與MCI向AD的轉(zhuǎn)化過程。本研究結(jié)果顯示，這些關(guān)鍵microRNA的靶基因主要參與Ras、MAPK、ErbB、TGF-β、Wnt、Hippo和mTOR等信號(hào)通路。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)是由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、血管緊張素及相應(yīng)受體構(gòu)成，如抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶或阻斷血管緊張素受體可以改善腦血流灌注不足，減少血腦屏障的損傷和神經(jīng)認(rèn)知功能的減退，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔14，15〕。研究發(fā)現(xiàn)MAPK通路可能參與了AD中Tau蛋白的過度磷酸化及淀粉樣前體蛋白(APP)的生成過程〔16〕。自噬在神經(jīng)退行性疾病中起著重要作用，其中mTOR是自噬過程的主要調(diào)節(jié)因子，受饑餓、生長因子和細(xì)胞應(yīng)激源的調(diào)控〔17〕；mTOR可通過抑制自噬過程導(dǎo)致Aβ斑塊在腦內(nèi)積累，進(jìn)而促進(jìn)Tau蛋白磷酸化和mTOR的激活過程〔18〕。因此，本研究篩選出的關(guān)鍵 microRNAs，可通過調(diào)節(jié)這些上述信號(hào)通路參與MCI向AD的進(jìn)展過程。若抑制或增強(qiáng)以上信號(hào)通路中某些關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，可能有助于改善認(rèn)知功能，從而延緩MCI向AD的轉(zhuǎn)化。

綜上，MCI患者血漿中存在14個(gè)顯著下調(diào)的 microRNAs，其中有4個(gè)為關(guān)鍵microRNAs，可能成為MCI新的診斷性生物標(biāo)志物。