正相–高效液相色譜法測(cè)定菜籽油中菜籽多酚Canolol的研究

李昕陽，李貴友?，楊 微，楊 軍

（四川省糧油中心監(jiān)測(cè)站，四川 成都 610041）

大宗商品油料中，油菜籽產(chǎn)品中的多酚類化合物含量顯著高于其他相應(yīng)的油料作物種子[1]，油菜籽和菜籽粕中的酚酸總量是豆粕中的5倍，是其他油料作物中的10～30倍[2]。油菜籽中的多酚分為酚酸和單寧，酚酸又包括游離酚酸和酯化酚酸，其中游離酚酸占總酚的9%～16%，芥子酸是主要游離酚酸，占游離酚酸總量的70%～85%[1,3]。Koski[4]等報(bào)道：油菜籽中天然存在的芥子酸在高溫高壓下脫酸轉(zhuǎn)化而成另外一種多酚，即2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚（2，6-dimethoxv-4-vinylphenol，vinylsyringol）。Wakamatsu[5]等在 2005 年從加拿大低芥酸油菜籽中提取出該物質(zhì)，經(jīng)分離提純后鑒定確認(rèn)，結(jié)果顯示該化合物的分子質(zhì)量為180，結(jié)構(gòu)為C10H12O3，并命名為Canolol。與芥子酸及其他常見抗氧化物如生育酚和抗壞血酸及其衍生物相比，Canolol具有更優(yōu)越的抗氧化活性及抗誘變、抗癌、抗病原微生物，抑菌等生理活性，因此具有重要的醫(yī)藥和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-7]。

我國(guó)是油菜籽生產(chǎn)和消費(fèi)大國(guó)，產(chǎn)量位居世界前列，每年提供優(yōu)質(zhì)食用油約 520萬 t，約占國(guó)產(chǎn)油料作物產(chǎn)油量的50%，是我國(guó)第一大油料作物[8]。其中濃香型壓榨菜籽油已占菜籽油三分之一的市場(chǎng)份額，在四川地區(qū)需求穩(wěn)定，價(jià)格和利潤(rùn)總體較高，這種以濃郁風(fēng)味為特點(diǎn)的壓榨濃香型菜籽油，是在高溫高壓下壓榨出油，沒有經(jīng)過精煉的菜籽油。已有研究表明[4,9-10]未經(jīng)精煉的植物油中酚類化合物顯著高于經(jīng)過精煉的植物油，而四川的濃香型壓榨菜籽油中的 Canolol含量更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他類型菜籽油的多酚含量。為促進(jìn)實(shí)現(xiàn)四川地區(qū)菜籽油整體價(jià)值的提升，加大影響力，為全產(chǎn)業(yè)鏈綜合經(jīng)濟(jì)效益的提升提供強(qiáng)力技術(shù)體系支撐，從而促進(jìn)油菜產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展，因此研究開發(fā)準(zhǔn)確高效地檢測(cè)菜籽油中菜籽多酚 Canolol含量的測(cè)定方法具有非常重要的應(yīng)用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

許多分析技術(shù)已被報(bào)道用于鑒定和定量多酚化合物，報(bào)道最常見的技術(shù)有薄層色譜法、氣液色譜法、氣相色譜–質(zhì)譜法和毛細(xì)管電泳法，此外，高效液相色譜（HPLC）是應(yīng)用最廣泛的定量方法之一[11-12]。紙色譜，薄層色譜法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，但能分離的多酚組分不多且定量不準(zhǔn)確，因此較少使用；GC法靈敏度高、分離成分多，但一般用于分離弱極性、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性高的有機(jī)化合物；植物多酚是強(qiáng)極性、不易揮發(fā)且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機(jī)物，故HPLC法在多酚的分離純化上應(yīng)用較多[13]。Khattab[14]等采用高效液相色譜–二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定了油菜籽中包括芥酸衍生物在內(nèi)的總酚含量。對(duì)10種加拿大西部油菜籽，6種其他商品油菜籽及其對(duì)應(yīng)的菜籽餅粕進(jìn)行了分析。采用水–甲醇–o–磷酸溶液梯度洗脫分離多酚化合物，流速為0.8 mL/min。芥子堿（SP）和芥子酸（SA）的檢出限和定量限分別為 0.20～0.40 μg/mL和0.50～0.80 μg/mL，回收率均超過98.0%。油菜提取物中總酚、SP和 SA含量分別為9.16～16.13 mg/g、6.39～12.28 mg/g 和 0.11～0.59 mg/g，品種間差異顯著。Wakamatsu[5]等從加拿大低芥酸油菜籽Canola中提取出Canolol，采用薄層色譜法結(jié)合高效液相色譜法進(jìn)行分離提純，用高分辨率的大氣壓力化學(xué)電離質(zhì)譜（APCI）以及液質(zhì)聯(lián)用（LC/MS）進(jìn)行鑒定確認(rèn)，結(jié)果顯示該化合物的分子質(zhì)量為180，結(jié)構(gòu)為C10H12O3。并得出當(dāng)甲醇用量為 70%時(shí)，可最大限度地提取油菜籽中的酚類化合物。

目前國(guó)內(nèi)的文獻(xiàn)報(bào)道[3,10,15-17]基本僅限于對(duì)菜籽多酚的提取、分離純化和活性評(píng)價(jià)的綜述，檢測(cè)方法有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) LS/T 6119—2017《糧油檢驗(yàn) 植物油中多酚的測(cè)定分光光度法》[18]，該標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定的多酚總量，樣品提取需要經(jīng)過繁瑣的固相萃取凈化，分析周期長(zhǎng)并且消耗的試劑較多，不利于環(huán)境保護(hù)。而國(guó)外對(duì)于測(cè)定菜籽多酚的文獻(xiàn)報(bào)道大多為油菜籽和菜籽粕，樣品提取過程繁瑣，如甲醇氨水處理菜籽粕[19]，甲醇回流提取菜籽和菜籽粕[11]，硅膠柱層析分離提取物[5,7]，固相萃取凈化提取物[4]等，采用反相色譜柱分離測(cè)定，同樣存在上述問題。本文側(cè)重于研究測(cè)定Canolol的方法，旨在挖掘四川地區(qū)濃香型菜籽油的價(jià)值，體現(xiàn)其區(qū)別于其他菜籽油的優(yōu)點(diǎn)，因此提出測(cè)定Canolol這一特征物質(zhì)。本文采用正相–高效液相色譜法（NP-HPLC）測(cè)定菜籽油中菜籽多酚Canolol含量的方法，該方法可直接溶解樣品上機(jī)，簡(jiǎn)單易操作，溶劑使用少，檢測(cè)周期短，準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菜籽多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.2 mg/mL：四川普西奧標(biāo)物科技有限公司；正己烷，色譜純：Kewell科威；異丙醇，色譜純：上海安譜公司；甲醇，色譜純：MREDA。

稱取10 mg（精確至0.01 mg）2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚（CAS：28343-22-8，純度大于99.0%）于50 mL容量瓶中，用正己烷溶解、定容，混勻。于2～8 ℃保存，有效期1個(gè)月。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀（Thermo UltiMate 3000 UHPLC），配熒光檢測(cè)器：賽默飛世爾科技公司；二醇基硅膠柱（Athena Diol，長(zhǎng)250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑 5 μm）、0.45 μm微孔濾膜：上海安譜公司；萬分之一分析天平（型號(hào)ME204，精度0.000 1 g）：梅特勒公司；25 mL棕色容量瓶、50 mL容量瓶：天玻公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試樣溶液的制備

稱取(0.25±0.1) g（精確至1 mg）試樣于25 mL棕色容量瓶中，先加入一定量的正己烷溶解試樣，再用正己烷稀釋到刻度，混勻。如果溶液不清澈，用0.45 μm微孔濾膜過濾，避光保存，并在當(dāng)天完成分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

將 1.1中配制好的菜籽多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成一系列梯度濃度：200、500、1 000、1 500、2 000 ng/mL，臨用前現(xiàn)配。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：二醇基硅膠柱（長(zhǎng) 250 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒徑5 μm）；檢測(cè)儀器為熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)：298 nm；發(fā)射波長(zhǎng)：325 nm；流動(dòng)相：正己烷+異丙醇=96+4，v/v；流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃。

1.4 數(shù)據(jù)分析

在儀器的最佳條件下，分別取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和試樣溶液上機(jī)測(cè)定。以保留時(shí)間定性，色譜峰面積多點(diǎn)校正定量，外標(biāo)法計(jì)算試樣中菜籽多酚Canolol的含量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用變色龍軟件（Chromeleon software，Version 7.2 SR4）和Excel進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器分析條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)器和波長(zhǎng)的選擇

熒光檢測(cè)器靈敏度非常高，其檢出限可達(dá)到10–9g/mL，同時(shí)具有選擇性好的優(yōu)勢(shì)。本文采用熒光檢測(cè)器作為檢測(cè)器。文獻(xiàn)[5]報(bào)道菜籽多酚的結(jié)構(gòu)為2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚，紫外光譜表明該化合物具有苯甲酸特征，最大吸收峰在275 nm，同時(shí)還表現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，本文采用的激發(fā)波長(zhǎng)為298 nm，發(fā)射波長(zhǎng)325 nm，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見2.2，結(jié)果表明在此條件下檢測(cè)菜籽多酚具有較高信噪比。

2.1.2 色譜分析條件的優(yōu)化

本文采用正相色譜的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，正相液相色譜以非極性或弱極性溶劑為流動(dòng)相，溶質(zhì)與流動(dòng)相的相互作用較弱，通常是在飽和烷烴（如正庚烷、正己烷）中加入一種極性較大的溶劑（如異丙醚、異丙醇等）作為極性調(diào)節(jié)劑構(gòu)成的混合溶劑，可以保持溶劑的低黏度，以降低柱壓和提高柱效，以及提高選擇性，改善分離。國(guó)標(biāo)GB/T 26635—2011《動(dòng)植物油脂生育酚及生育三烯酚含量測(cè)定高效液相色譜法》[20]也采用正相液相色譜分離和檢測(cè)生育酚及生育三烯酚含量，其流動(dòng)相為正庚烷和四氫呋喃，正庚烷價(jià)格較高，四氫呋喃毒性較大，因此本文采用的流動(dòng)相為正己烷和異丙醇。

考慮到待測(cè)菜籽油中含有各種酚酸、生育酚和生育三烯酚，按實(shí)驗(yàn)方法1.3改變流動(dòng)相正己烷和異丙醇的比例，對(duì)生育酚、生育三烯酚和Canolol進(jìn)行分離實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1～2，樣品測(cè)定譜圖見圖3。從圖1～3可以看出：在熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)298 nm，發(fā)射波長(zhǎng)325 nm的條件下，生育酚、生育三烯酚和 Canolol均有響應(yīng)，菜籽油基質(zhì)對(duì)生育酚、生育三烯酚和 Canolol的測(cè)定均沒有干擾；在流動(dòng)相正己烷+異丙醇=98+2，v/v的條件下，Canolol與δ-生育酚的色譜峰重合；在流動(dòng)相正己烷+異丙醇=96+4，v/v的條件下，Canolol與生育酚及生育三烯酚的色譜峰完全分離。因此本文采用流動(dòng)相條件為正己烷+異丙醇=96+4，v/v。

圖1 流動(dòng)相：正己烷+異丙醇=98+2，v/v的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of the volume ratio 98:2 of hexane to isopropanol as the mobile phase

圖2 流動(dòng)相：正己烷+異丙醇=96+4，v/v的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the volume ratio 96:4 of hexane to isopropanol as the mobile phase

圖3 壓榨濃香型菜籽油色譜圖Fig. 3 HPLC chromatogram of pressed rapeseed oil

2.2 方法的線性范圍和檢出限

按照實(shí)驗(yàn)方法1.3，在相同的色譜條件下測(cè)定其峰面積，以濃度x（ng/mL）為橫坐標(biāo)，色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明：菜籽多酚在濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r為0.999 5。按照3倍信噪比計(jì)算得到的檢出限為15 ng/mL，說明本文方法對(duì)菜籽多酚具有較高的檢測(cè)靈敏度。

圖4 菜籽多酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig. 4 Standard working curve of Canolol

2.3 方法回收率和精密度測(cè)定

按實(shí)驗(yàn)方法 1.3在樣品中添加三個(gè)不同濃度水平的菜籽多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用同樣的色譜檢測(cè)條件重復(fù)測(cè)定7次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，表1表明本文方法的加標(biāo)回收率在96%～110%之間，精密度在1.5%～2.9%之間。

表1 方法回收率和精密度測(cè)定Table1 The recovery rate and precision of the method

2.4 樣品測(cè)定

按照實(shí)驗(yàn)方法，我們同時(shí)測(cè)定了一級(jí)菜籽油、浸出菜籽油、壓榨濃香型菜籽油、大豆油、花生油、玉米油中Canolol的含量，結(jié)果見表2，其中壓榨濃香型菜籽油為成都市農(nóng)林科學(xué)院收集全國(guó)不同地區(qū)不同品種的油菜籽采用壓榨工藝生產(chǎn)的菜籽油，共計(jì)90個(gè)樣品，濃香型菜籽油測(cè)定譜圖見圖3。結(jié)果表明：一級(jí)菜籽油、浸出菜籽油、大豆油、花生油、玉米油中菜籽多酚 Canolol含量為未檢出，濃香型菜籽油菜籽多酚 Canolol含量在190～2 246 mg/kg之間，不同地區(qū)的不同品種的油菜籽生產(chǎn)的菜籽油的菜籽多酚含量差異很大，本方法適用于多種植物油的測(cè)定。

表2 樣品測(cè)定Table 2 Sample determination

3 結(jié)論

本文采用正相-高效液相色譜法（NP-HPLC）測(cè)定菜籽油中菜籽多酚 Canolol的含量。方法的線性相關(guān)系數(shù)為0.999，加標(biāo)回收率在96%～ 110%之間；儀器檢出限為15 ng/mL，精密度優(yōu)于3%。該方法具有操作簡(jiǎn)便、分析時(shí)間短、準(zhǔn)確度高、環(huán)境污染少的特點(diǎn)，本方法的建立對(duì)挖掘濃香型菜籽油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和油菜籽品種育種的優(yōu)選提供技術(shù)支撐，對(duì)促進(jìn)實(shí)現(xiàn)四川地區(qū)油菜籽產(chǎn)業(yè)整體價(jià)值的提升，加大濃香型菜籽油影響力具有重要意義。