甘蔗PIN-LIKES基因家族的鑒定與表達分析

潘潔明 田紹銳 梁艷蘭 朱宇林 周定港 闕友雄 凌 輝,* 黃 寧,*

甘蔗PIN-LIKES基因家族的鑒定與表達分析

潘潔明1田紹銳3梁艷蘭2朱宇林1周定港4闕友雄2凌 輝1,*黃 寧1,*

1玉林師范學(xué)院農(nóng)學(xué)院, 廣西玉林 537000;2福建農(nóng)林大學(xué) / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 福建福州 350002;3西南大學(xué)植物保護學(xué)院, 重慶 400700;4湖南科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/ 經(jīng)濟作物遺傳改良與綜合利用湖南省重點實驗室, 湖南湘潭 411201

PILS (PIN-LIKES)是一類新發(fā)現(xiàn)的生長素輸出載體, 協(xié)助生長素的極性運輸。本研究立足甘蔗割手密基因組和栽培品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 利用生物信息學(xué)分析技術(shù), 分別在割手密和栽培品種中鑒定到11個PILS (PIN-LIKES,)基因和4個PILS(spp. hybridPIN-LIKES,)基因。結(jié)果表明, 11個SsPILS基因家族成員分布于6條染色體上, 基因內(nèi)含子數(shù)量介于5～11個。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn), 割手密PILS與水稻PILS有較高同源性, 歸屬于3個不同的系統(tǒng)發(fā)育分支。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示,的同源基因在受高粱花葉病毒和黑穗病菌脅迫甘蔗栽培種中差異表達。通過RT-PCR擴增技術(shù), 克隆獲得基因序列(NCBI accession number: OM258732)。該基因全長cDNA為1332 bp, 包含一個1233 bp的完整開放閱讀框, 編碼410個氨基酸, 理論等電點(pI)為6.17, 不穩(wěn)定系數(shù)為39.31, 平均疏水性值為0.689, 預(yù)測ScPILS1c為穩(wěn)定酸性疏水蛋白。其編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋(48.54%)和無規(guī)則卷曲(35.37%), 這與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相符。qRT-PCR表達分析揭示,基因在甘蔗中的表達具有組織特異性, 在蔗髓中表達量最低、皮中的表達量最高, 同時該基因的表達受H2O2及黑穗病菌的顯著性誘導(dǎo)。亞細胞定位表明,基因的編碼蛋白主要定位于細胞膜。以上結(jié)果為深入研究甘蔗PIN-LIKES基因的結(jié)構(gòu)和功能積累了基礎(chǔ)資料。

甘蔗; PILS; 生物信息學(xué); 實時熒光定量PCR; 基因家族

生長素(auxin)是最早被科學(xué)家達爾文(Darwin)父子發(fā)現(xiàn)的一種植物激素[1-2], 該激素參與調(diào)控植物生長發(fā)育[3-6]、植物逆境響應(yīng)[7-9]等。研究表明生長素突出的特征是極性運輸, 并通過極性運輸產(chǎn)生濃度梯度, 實現(xiàn)在植物體內(nèi)的差異分布[10-12]。生長素極性運輸?shù)恼{(diào)控包括輸入載體(Influx carrier)和輸出載體(Efflux carrier)[13]。PIN (PIN-FORMED)是典型的生長素輸出載體, 在細胞膜上的極性分布, 是決定生長素極性運輸方向的關(guān)鍵[14-18]。

在擬南芥()中, 存在8個PIN蛋白[19-21]和7個PILS (PIN-LIKES)蛋白[13]。PILS蛋白家族在空間結(jié)構(gòu)上與PIN家族相似, 但序列相似度僅有10%～18%[22]。Barbez等[13]構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹表明, 7個擬南芥PILS蛋白包含3個亞組: AtPILS1/AtPILS3/AtPILS4、AtPILS5/AtPILS7和AtPILS2/ AtPILS6。水稻中包括7個PILS蛋白, 其中OsPILS7a/ OsPILS7b/OsPILS1與AtPILS1/AtPILS3/AtPILS4為一個亞組, OsPILS5與AtPILS5/AtPILS7為一個亞組, OsPILS2/OsPILS6a/OsPILS6b 與 AtPILS2/AtPILS6為一個亞組[23]。前人研究顯示, PILS具有生長素載體結(jié)構(gòu)域Mem_trans (PF03547)[24], 參與調(diào)節(jié)細胞內(nèi)生長素的穩(wěn)態(tài), 并能引起生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)速率的變化, 進而調(diào)控細胞的差異生長[25]。Feraru等[25]和Beziat等[26]研究發(fā)現(xiàn), PILS2、PILS3、PILS5和PILS6蛋白可以調(diào)控細胞內(nèi)生長素的結(jié)合速率, 進而影響生長素核信號的傳導(dǎo)。Barbez等[13]和Feraru等[22]報道, 在煙草細胞中誘導(dǎo)PILS2的表達能夠增加生長素的積累, 而PILS2、PILS5雙突變的原生質(zhì)體則呈現(xiàn)明顯的生長素輸出量[13,22]。

甘蔗在全球多地區(qū)廣泛種植, 是我國最重要的糖料作物和生物能源作物[27-31]。據(jù)報道, 我國約90%的食糖來自甘蔗[32-33]。甘蔗可作為新能源的原料應(yīng)用前景廣闊[34-36]。Lalman等[37]報道全球40%的燃料乙醇來源于甘蔗。甘蔗是保證全球食糖安全和新能源材料的重要作物, 對甘蔗基因的深入研究可以更好地了解生長素在甘蔗生長發(fā)育及逆境響應(yīng)過程中的調(diào)控機制, 有助于滿足甘蔗的種植需求。迄今, 在甘蔗中尚未見關(guān)于PILS基因的相關(guān)報道。本研究立足甘蔗割手密()基因組數(shù)據(jù)[38]和不同脅迫下甘蔗栽培品種()轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 基于已報道的擬南芥PILS基因家族的序列及結(jié)構(gòu)特征, 對甘蔗割手密及栽培品種PILS基因家族進行鑒定, 克隆和生物信息學(xué)分析, 檢測甘蔗栽培品種PILS基因家族成員在不同生物脅迫下的表達模式, 以期為深入探討甘蔗PIN-LIKES基因家族成員的結(jié)構(gòu)和功能積累基礎(chǔ)資料, 并為甘蔗抗逆分子育種提供潛在的基因資源。

1 材料與方法

1.1 甘蔗割手密PILS基因家族鑒定及分析

以擬南芥PILS基因家族序列為原始序列, 在甘蔗割手密基因組的蛋白序列中進行blast比對, 選擇相似性大于65%的序列通過Pfam (http://pfam.xfam. org/)進行結(jié)構(gòu)域分析, 篩選其中具有Mem_trans結(jié)構(gòu)域的序列為甘蔗割手密PILS基因家族成員。根據(jù)甘蔗割手密基因組注釋信息, 通過TBtools軟件[39]中的Quick run MCScanX wrapper工具對SsPILS基因家族成員的染色體分布及基因家族成員間的共線性進行分析。

1.2 甘蔗栽培品種PILS基因家族的鑒定及在生物脅迫下的表達分析

以擬南芥和甘蔗割手密PILS基因家族成員的氨基酸序列為原始序列, 分別使用blastp和Pfam工具, 在受高粱花葉病毒[40]和黑穗病菌脅迫下的甘蔗栽培品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[41]中進行同源比對和結(jié)構(gòu)域分析,篩選其中具有Mem_trans結(jié)構(gòu)域的序列為甘蔗栽培種PILS基因家族成員, 并對篩選到的序列進行表達模式分析。通過DNAMAN對甘蔗割手密及甘蔗栽培品種PILS基因家族成員進行多序列比對。

1.3 生物信息學(xué)分析

1.3.1 甘蔗割手密PILS基因家族的生物信息學(xué)分析 使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)對SsPILS基因家族成員進行氨基酸個數(shù)、分子量、等電點和不穩(wěn)定系數(shù)分析。使用CELLO v.2.5 (http:// cello.life.nctu.edu.tw/)對SsPILS基因家族成員進行亞細胞定位預(yù)測。使用MEGA7.0對甘蔗割手密、擬南芥[13]、水稻 ()[23]中的PILS的氨基酸序列進行比對(MAFFT), 并通過PhyloSuite v1.2.1[42]進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建, 建樹模型為LG+G4, 步長為1000。根據(jù)SsPILS氨基酸序列信息, 分別通過MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)和SEA (https://meme-suite.org/meme/tools/sea), 進行保守基序查找及功能分析?；诟收岣钍置芑蚪M序列及注釋信息, 通過TBtools[39]中的Gene Structure View對SsPILS的基因結(jié)構(gòu)進行分析和展示。

1.3.2基因的生物信息學(xué)分析 利用ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)在線工具對的開放閱讀框(open reading frame, ORF)和蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測; 分別使用在線工具SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/ smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)、TMHMM (https:// services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)、ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)、PRABI- GERLAND (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html)、SWISS- MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)和ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)對編碼蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)、一級、二級、三級結(jié)構(gòu)和疏水性/親水性進行預(yù)測。

1.4 ScPILS1c基因的克隆與表達分析

1.4.1 植物材料及處理 本研究中基因克隆及定量分析所用的植物材料均為甘蔗栽培品種ROC22。參考Ling等[43]的報道, 選擇5株長勢一致健康的ROC22植株進行不同組織的取樣, 取樣組織分別為皮、葉片、芽和蔗髓。同時選擇ROC22的健康植株, 用水將其沖洗后砍成單芽莖段。分別對其進行以下處理: (1) 將單芽莖段種植在經(jīng)過滅菌處理的基質(zhì)中待甘蔗苗長出4～6片葉子時, 選取長勢相近的甘蔗苗用于組培苗的培養(yǎng)。組培苗生根后, 將其移出溫室并水培7 d, 挑選長勢一致的組培苗分別在其葉片噴施無菌水及500 mmol L-1過氧化氫(H2O2), 每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù), 6 h取樣。(2) 參考Que等[41]報道的甘蔗接種黑穗病菌的方法, 對單芽莖段進行水培, 待蔗芽長至1.0～2.0 cm時, 分別接種黑穗病菌和無菌水, 每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù), 7 d取樣。用錫箔紙包裹取樣樣品, 放入液氮處理, 然后在-80℃條件下保存。

1.4.2 總RNA提取和cDNA合成 采用TRIzol法[44]提取甘蔗總RNA后, 使用DNaseI對RNA樣品進行處理, 同時使用PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect for Real Time)合成cDNA。

1.4.3基因的克隆 根據(jù)同時在受高粱花葉病毒[40]和黑穗病菌脅迫下的[41]甘蔗栽培品種轉(zhuǎn)錄組中均差異表達的基因序列, 設(shè)計克隆引物PILS1c-F/R (表1), 參考黃寧等[44]報道的方法進行PCR擴增, PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后連接至pMD19-T載體, 并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表1 本研究所用引物

1.4.4基因的組織特異性表達分析及其受H2O2和黑穗病菌脅迫后的表達模式 采用qRT-PCR技術(shù), 以q-PILS1c-F/R (表1)為引物, 檢測基因在甘蔗不同組織中的表達情況, 并檢測基因在甘蔗受過氧化氫(H2O2)脅迫和黑穗病菌脅迫后的表達情況。本試驗采用內(nèi)參基因和組合對基因表達量數(shù)據(jù)進行校正[45],和引物見表1。PCR反應(yīng)體系參考黃寧等[44]報道的方法。每種樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。利用在ABI PRISM7500 real-time PCR system軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行初步分析后, 導(dǎo)出數(shù)據(jù)文件, 按照2-ΔΔCt算法進行結(jié)果分析[46]。

1.4.5基因編碼蛋白的亞細胞定位分析 以pMD19-T-ScPILS1c質(zhì)粒DNA為模板, 借助亞細胞定位引物YFP-PILS1c-F/R (表1)進行PCR擴增。利用同源重組試劑盒ClonExpress II One Step Cloning Kit (諾唯贊生物科技有限公司, 中國南京), 將基因ORF (不含終止密碼子)連接到亞細胞定位載體pCAMBIA2300-YFP上, 獲得重組質(zhì)粒35S::ScPILS1c::YFP。將重組陽性質(zhì)粒35S::ScPILS1c:: YFP和空載質(zhì)粒35S::YFP分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌GV3101, 液體培養(yǎng)(含50 μg mL-1卡那霉素和50 μg mL-1利福平) 28℃ 下250轉(zhuǎn) min-1振蕩培養(yǎng)48 h, 調(diào)節(jié)菌液濃度(含200 μmol L-1乙酰丁香酮)至0.8 (OD600), 分別將含有35S::ScPILS1c::YFP和35S:: YFP質(zhì)粒的農(nóng)桿菌注射侵染煙草葉片, 48 h后, 于激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8, 德國)下觀察亞細胞定位情況[44]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗割手密PILS基因家族的鑒定及共線性分析

在甘蔗割手密基因組中, 共鑒定獲得11個與擬南芥PILS基因家族成員相似性大于65%且具有Mem_trans結(jié)構(gòu)域的序列。結(jié)果顯示, 11個SsPILS共定位到6條染色體上, 分別為染色體1C、1D、2A、2B、2C、3C (圖1-A)?；蚪M內(nèi)共線性分析結(jié)果顯示, SsPILS基因家族成員間存在2個共線性基因?qū)? 其中和互為復(fù)制基因、和互為復(fù)制基因(圖1-B)。

2.2 甘蔗割手密PILS基因家族生物信息學(xué)分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析和亞細胞定位預(yù)測 本研究對獲得的11個甘蔗割手密PILS基因推導(dǎo)的編碼蛋白的理化性質(zhì)進行分析(表2)發(fā)現(xiàn), 除SsPILS1a氨基酸數(shù)目較大為847外, SsPILS1b～SsPILS7b的氨基酸數(shù)目差別不大, 介于301～436之間, 相對分子量為32.59～89.11 kD。除SsPILS7b蛋白等電點為6.12外, 其余10個SsPILS、蛋白等電點均大于7。Plant-mPloc軟件預(yù)測結(jié)果顯示SsPILS蛋白均定位于質(zhì)膜。

圖1 甘蔗割手密PILS基因家族的染色體分布(A)及共線性分析(B)

紅色連線表示甘蔗割手密PILS基因家族間的共線性, 灰色連線表示割手密所有基因間的共線性。

The red line indicates synteny within PILS and the grey line indicates synteny within all genes ingenome.

表2 甘蔗割手密PILS蛋白的理化性質(zhì)分析及亞細胞定位預(yù)測

2.2.2 系統(tǒng)進化分析 甘蔗割手密、水稻和擬南芥中的PILS聚類成3個系統(tǒng)發(fā)育分支, 其中, SsPILS1a～SsPILS1e分布于分支I, SsPILS5a、SsPILS5b、SsPILS7a和SsPILS7b分布于分支II, SsPILS6a和SsPILS6b分布于分支III。并且甘蔗割手密PILS與水稻OsPILS的進化距離相較于擬南芥AtPILS更近(圖2)。

2.2.3 保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析 通過MEME工具在SsPILSs中進行保守基序查找發(fā)現(xiàn), SsPILSs包含3～5個保守基序, 且N端均具有保守基序motif 3 (圖3-A), 說明SsPILS基因家族基序具有一定保守性。經(jīng)SEA在motif數(shù)據(jù)庫PROSITE fixed-length motifs (PROSITE 2021_04)中比對發(fā)現(xiàn), 除motif 2和motif 5在數(shù)據(jù)庫中未找到比對結(jié)果外, motif 1、motif 3和motif 4分別為N-肉豆蔻?；稽c、酰胺化位點和N-糖基化位點。基因結(jié)構(gòu)分析表明,包含5至11個內(nèi)含子, 其中具有5個內(nèi)含子,、具有11個內(nèi)含子,、具有8個內(nèi)含子。、、具有9個內(nèi)含子,、、具有10個內(nèi)含子。除、、、和具有UTR外, 其他均無UTR (圖3-B)。

圖3 甘蔗割手密PILS基因家族蛋白保守基序(A)和基因結(jié)構(gòu)分析(B)

A圖中, 不同顏色方框表示不同保守基序, 黑線表示氨基酸序列。B圖中, 不同顏色方框表示不同基因結(jié)構(gòu), 黑線表示內(nèi)含子。

Different colored boxes indicate different conserved motifs, and black lines indicate amino acid sequences in Fig. 3-A. Different colored boxes indicate different gene structures, and black lines indicate introns in Fig. 3-B.

2.3 甘蔗栽培品種PILS基因家族的鑒定及在生物脅迫下的表達分析

在受高粱花葉病毒和黑穗病菌脅迫下的甘蔗栽培品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中, 一共篩選獲得4條基因, 經(jīng)多序列比對后發(fā)現(xiàn), 4個基因序列之間的同源性大于95%, 因此將它們分別命名為、、和。利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對篩選到的甘蔗栽培種PILS基因家族成員進行表達模式分析發(fā)現(xiàn), 與對照相比, 受高粱花葉病毒脅迫后在甘蔗栽培品種中的表達量變化不大(圖4-A), 但在黑穗病菌脅迫下的甘蔗栽培品種中沒有檢測到表達(圖4-B)。此外, 受高粱花葉病毒脅迫后, 除被誘導(dǎo)表達、被抑制表達外, 其他基因表達量變化不大(圖4-A)。受黑穗病菌脅迫后的24 h、48 h和120 h 3個時間點, 易感黑穗病品種ROC22和抗黑穗病品種YC71-374中,和基因的表達量和表達模式相差不大。同時, 在ROC22中,在受黑穗病菌脅迫后的24 h、48 h和120 h, 表達量基本不變, 但在YC05- 179受侵染120 h時, 該基因被誘導(dǎo)表達(圖4-B)。綜上所述,在受高粱花葉病毒和黑穗病菌脅迫后的甘蔗中均差異表達, 且均被誘導(dǎo)表達。

圖4 ScPILS基因在不同脅迫下的表達

A: 高粱花葉病毒脅迫; B: 黑穗病菌脅迫。

A:infection; B:infection.

2.4 ScPILS1c基因的克隆與序列分析

本研究克隆獲得的基因與基因的相似性為96.45%, 其cDNA全長為1332 bp, 應(yīng)用ORF Finder對其序列進行分析, 結(jié)果顯示其包含一條1233 bp的完整開放閱讀框, 編碼410個氨基酸(圖5-A)。SMART和TMHMM分析結(jié)果顯示, ScPILS1c蛋白具有Mem_trans保守結(jié)構(gòu)域(圖5-B), 并包含10個跨膜結(jié)構(gòu)(圖5-C)。應(yīng)用在線工具ProtParam對編碼的蛋白的一級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示ScPILS1c分子量為43.86 kD, 分子式為C2011H3213N497O558S18。根據(jù)預(yù)測結(jié)果計算得出的不穩(wěn)定性指數(shù)(II) 為39.31, 等電點為6.17。由此推測ScPILS1c蛋白質(zhì)為一個酸性穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示, ScPILS1c主要由α螺旋(48.51%)、無規(guī)則卷曲(35.37%)和延伸鏈(16.10%) 三部分組成。三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明, ScPILS1c的建模模板為5aymA, 其與模板疊合后, 覆蓋度為0.94, RMSD值為1.36, 建模結(jié)果可信度高(圖5-D)。三維結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示, ScPILS1c蛋白以α螺旋為主, 其次是無規(guī)則卷曲與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果相同(圖5-E)。

應(yīng)用ProtScale在線工具對PILS進行疏水性/親水性預(yù)測(圖6)發(fā)現(xiàn), 在基因的編碼氨基酸序列中, 大部分殘基為疏水性, 第257位具有最高分值(3300), 疏水性最強; 第226位具有最低分值(-2589), 親水性最強。根據(jù)蛋白的平均疏水性(grand average of hydropathicity, GRAVY)值進行預(yù)測, 該蛋白的GRAVY值為0.689, 為疏水性蛋白。

2.5 甘蔗栽培品種PILS1c基因的表達分析和亞細胞定位

2.5.1基因的組織特異性表達分析 組織特異性的qRT-PCR分析顯示, 甘蔗基因在皮、葉片、芽和蔗髓中組成型表達, 且在芽中表達量最低, 其次為蔗髓, 在葉片和皮中表達量較高(圖7)。

2.5.2基因受H2O2和黑穗病菌脅迫后的表達模式分析 qRT-PCR表達分析中, 受H2O2脅迫后,基因表達量相對于對照組上調(diào)表達, 且顯著高于對照組(圖8-A); 受黑穗病菌脅迫7 d后,基因的表達量相對于對照組上調(diào)表達, 并且在受黑穗病菌脅迫后顯著高于對照組(圖8-B)。據(jù)此推測,基因受H2O2及黑穗病菌顯著誘導(dǎo)表達。

圖5 ScPILS1c蛋白生物信息學(xué)分析

A:基因的開放讀碼框及其所編碼蛋白; B: ScPILS1c蛋白的保守結(jié)構(gòu)域; C: ScPILS1c蛋白的跨膜結(jié)構(gòu); D: ScPILS1c三級結(jié)構(gòu)模型與5aymA比對; E: ScPILS1c三級結(jié)構(gòu)模型, 紅色為跨膜結(jié)構(gòu)域。

A: the open reading frame ofgene and its encoded protein; B: the conserved domain of ScPILS1c protein; C: the transmembrane helices of ScPILS1c protein; D: the comparison of third structure model of ScPILS1c with 5aymA; E: the third structure model of ScPILS1c, and red color indicates transmembrane domain.

圖6 ScPILS1c蛋白氨基酸疏水性/親水性預(yù)測

圖7 ScPILS1c基因在不同組織中的表達

柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

Different lowercase letters above the bars indicate significant difference at the 0.05 probability level.

2.5.3基因編碼蛋白的亞細胞定位分析 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將35S:ScPILS1c:YFP導(dǎo)入本氏煙葉片下表皮內(nèi)細胞內(nèi), 進行瞬時表達分析, 并借助激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的亞細胞定位情況。由圖9可知, 在注射空載35S: YFP的本氏煙葉片中, YFP黃色熒光比較均勻的分布在細胞邊緣, 細胞內(nèi)也有明亮的熒光點。而35S:ScPILS1c:YFP的本氏煙葉片, 在細胞膜上有不連續(xù)的黃色熒光點, 細胞內(nèi)有空泡狀的熒光點, 細胞質(zhì)中有網(wǎng)格狀熒光, 說明定位可能和細胞膜系統(tǒng)相關(guān)。該結(jié)果與亞細胞定位預(yù)測的結(jié)果一致。

3 討論

生長素是植物體內(nèi)的重要激素, 受到研究者的高度關(guān)注, 生長素的極性運輸參與調(diào)控植物的形態(tài)建成、向性反應(yīng)、導(dǎo)管結(jié)構(gòu)和器官結(jié)構(gòu)等多個方面[47-48]。與此同時, 生長素在植物逆境響應(yīng)中的作用也有不少報道[7-9]。生長素輸出載體蛋白PIN家族和PILS家族[2, 49]參與和調(diào)控植物發(fā)育的各個階段, 是決定生長素極性運輸方向的關(guān)鍵。越來越多的研究表明,基因能夠通過調(diào)節(jié)生長素的穩(wěn)態(tài), 影響生長素信號傳導(dǎo)[22], 但是其研究多集中于植物生長發(fā)育, 響應(yīng)生物及非生物脅迫的報道較少。如: BR(brassinosteroids)信號通過影響的轉(zhuǎn)錄以及翻譯, 使基因的表達受到抑制[50], PILS蛋白的數(shù)量減少, 從而誘導(dǎo)生長素信號傳導(dǎo)[25]。、和共同控制內(nèi)側(cè)生長素信號的消耗, 從而誘導(dǎo)頂端彎鉤的伸展[51]。植物色素B依賴光信號通路直接調(diào)節(jié)基因的活性, 抑制核生長素信號傳導(dǎo)并控制植物生長[26]。以上研究結(jié)果表明,基因可以通過調(diào)節(jié)生長素的消耗、積累和極性運輸調(diào)控植物器官的形成和發(fā)育, 在植物生長發(fā)育中具有關(guān)鍵的作用[23]。

圖8 ScPILS1c基因在不同脅迫下的表達

A: H2O2脅迫; B: 黑穗病菌脅迫。柱上不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

A: H2O2stress; B:stress. Different lowercase letters above the bars indicate significant difference at the 0.05 probability level.

圖9 甘蔗ScPILS1c在本氏煙下表皮細胞中的亞細胞定位

目前, PILS的研究主要集中在擬南芥和水稻中[23,52],在甘蔗中未見PILS研究的相關(guān)報道。本研究在甘蔗割手密基因組中共鑒定到11個基因, 對比前人研究發(fā)現(xiàn), 不同作物中基因所編碼氨基酸的理化性質(zhì)相差不大, 比如本研究中甘蔗割手密PILS氨基酸長度除SsPILS1a氨基酸數(shù)目為847外, 其他多數(shù)在301～436之間, 內(nèi)含子在5～11個之間; 而大豆的19個PILS氨基酸長度在259～445之間, 內(nèi)含子在1～11個之間[53]; 水稻的7個PILS氨基酸長度在414～1280之間, 內(nèi)含子在1～10個之間[23]。我們推測,基因所編碼蛋白質(zhì)在植物中保守性高。根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn), 擬南芥的AtPILS蛋白、大豆的GmPILS蛋白均定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[53], 而本研究中的ScPILS1c蛋白定位于細胞膜及細胞內(nèi)膜系統(tǒng)這與前人的研究結(jié)果不同, 推測ScPILS1c與擬南芥中AtPILS蛋白和大豆中GmPILS蛋白具有不同的細胞定位, 可能行使不同的分子功能, 參與不同的生物學(xué)進程。甘蔗基因?qū)儆赑ILS基因家族第I亞組, 在各組織中均表達, 但在蔗髓中表達量最低, 皮中的表達量最高。而擬南芥主要在莖中表達, 在葉和花部的表達量很低[22]。由此可見, 不同植物中基因的組織特異表達模式是不同的。

前人研究表明, 生長素信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因[54]和[55]能夠積極響應(yīng)生物脅迫。過表達柑橘轉(zhuǎn)基因植株中游離生長素含量減少, 受柑橘黃單胞菌侵染后, 游離生長素含量減少速度加快, 對柑橘黃單胞抗性增強[54]。木薯基因沉默植株對細菌性萎蔫病菌更加感病[55]。基因作為生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因, 也可能參與植物對生物脅迫的響應(yīng)過程。本研究通過qRT- PCR技術(shù)分析基因受黑穗病菌脅迫后的表達情況發(fā)現(xiàn), 受黑穗病菌脅迫后,基因顯著上調(diào)表達, 結(jié)合[54]和[55]的相關(guān)報道可以推測作為生長素輸出載體可能通過調(diào)節(jié)生長素的運輸, 使甘蔗體內(nèi)或某些組織中生長素含量減少, 以此增強甘蔗對生物脅迫的抗性。植物在受到各種脅迫后, 體內(nèi)H2O2含量增加, 并作為信號分子參與植物抗逆反應(yīng), 外源施加H2O2可模擬受脅迫后的植物內(nèi)環(huán)境, 這被廣泛用于植物基因功能抗逆方面的研究[44,56-60]。煙草基因[56]、甘蔗栽培種基因[44]、玉米基因[57]、小麥基因[58]、棉花和基因[59]、甘薯基因[60]在H2O2脅迫下顯著誘導(dǎo)表達; 甘藍型油菜基因[61]、甘蔗基因[62]、小麥基因[63]受H2O2脅迫后下調(diào)表達。在本研究中, 受H2O2脅迫后,基因顯著上調(diào)表達。綜上所述,基因的表達受H2O2、高粱花葉病毒以及黑穗病菌脅迫等逆境條件的調(diào)控, 推測該基因通過調(diào)控生長素信號傳導(dǎo)通路在甘蔗抗逆境方面發(fā)揮一定的作用。

4 結(jié)論

本研究在甘蔗割手密和栽培品種中分別鑒定獲得11個和4個基因。11個甘蔗割手密基因, 分布于6條染色體, 各自含有5～11個內(nèi)含子。系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn), 相對于擬南芥, 割手密與水稻親緣關(guān)系更近, 歸屬于3個不同系統(tǒng)發(fā)育分支。同時,的同源基因基因在高粱花葉病毒及甘蔗黑穗病菌脅迫下的轉(zhuǎn)錄組中均差異表達。從甘蔗栽培品種中克隆獲得了基因的cDNA序列, 其全長為1332 bp, 包含一個1233 bp的完整開放閱讀框, 編碼410個氨基酸, 為穩(wěn)定酸性疏水蛋白。二級結(jié)構(gòu)主要包括α-螺旋和無規(guī)則卷曲。qRT-PCR表達分析揭示,基因的表達具有組織特異性, 且在蔗髓中表達量最低, 皮中的表達量最高。此外, 該基因的表達受H2O2及黑穗病菌的顯著誘導(dǎo)。亞細胞定位分析表明,基因主要定位于細胞膜。以上結(jié)果可為甘蔗基因在逆境脅迫響應(yīng)機制中的功能和作用機制解析提供參考。

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Identification and expression analysis of PIN-LIKES gene family in sugarcane

PAN Jie-Ming1, TIAN Shao-Rui3, LIANG Yan-Lan2, ZHU Yu-Lin1, ZHOU Ding-Gang4, QUE You-Xiong2, LING Hui1,*, and HUANG Ning1,*

1College of Agriculture, Yulin Normal University, Yulin 537000, Guangxi, China;2Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;3College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400700, China;4College of Life Science, Hunan University of Science and Technology/ Key Laboratory of Economic Crops Genetic Improvement and Integrated Utilization, Xiangtan 411201, Hunan, China

PILS (PIN-LIKES) is a newly reported auxin efflux carrier, which is involved in the polar transport of auxin. In this study, bioinformatics analysis indicated that 11 SsPILS genes and 4 ScPILS genes were identified from thegenomic and the sugarcane cultivars transcriptomic data. 11 SsPILS gene family members were located at 6 chromosomes, and had 5–11 introns, respectively. Phylogenetic tree analysis showed that these PILS fromwas clustered into 3 different branches and had highly homologous with PILS from. The transcriptomic data revealed that,, the ortholog of, was differentially expressed in the sugarcane cultivars underandstress.(NCBI accession number: OM258732), cloned by RT-PCR, had 1332 bp in length, containing a 1233 bp complete open reading frame and encoding 410 amino acids residues. The isoelectric point, instability coefficient, and average hydrophobicity value of ScPILS1c were 6.17, 39.31, and 0.689, respectively. The ScPILS1cwas predicted as a stable acid hydrophobicity protein. The secondary structure of ScPILS1c protein was mainly composed of α-helix (48.54%) and random coils (35.37%) and was highly consistent with the prediction of tertiary structure. The qRT-PCR demonstrated that the relative expression ofwas tissue-specific and the highest expression was observed in epidermis while the lowest in pith.was significantly induced by H2O2treatment andinfection. Transient expression onleaves suggested thatwas localized on cell membrane. This study provides a reference for further research on the structure and function ofgene in sugarcane.

sugarcane;gene; bioinformatics; qRT-PCR; gene family

10.3724/SP.J.1006.2023.24022

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31801424, 32160435)和玉林師范學(xué)院高層次人才啟動項目(G2020ZK03)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31801424, 32160435) and the Scientific Research Foundation of Yulin Normal University (GZ2020ZK03).

黃寧, E-mail: hning2012@126.com; 凌輝, E-mail: linghuich@163.com

E-mail: jiemingpan@163.com

2022-01-17;

2022-05-05;

2022-05-12.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220511.1914.004.html

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