栽培小麥Brock中抗白粉病相關基因TaRPP13-1B的克隆及功能分析

劉曉穎 張 馳 王雪晴 楊晨曉 王光鈺 卞云迪 方 芳 王 穎 王振英,*

栽培小麥Brock中抗白粉病相關基因的克隆及功能分析

劉曉穎1張 馳1王雪晴1楊晨曉1王光鈺1卞云迪1方 芳2王 穎2王振英1,*

1天津師范大學生命科學學院 / 天津市動植物抗性重點實驗室, 天津 300387;2天津市寶坻區(qū)林業(yè)發(fā)展服務中心, 天津 301899

白粉病是小麥生產(chǎn)中的主要病害之一, 發(fā)掘抗病基因并實現(xiàn)抗病基因轉(zhuǎn)育是提高作物抗病性的最經(jīng)濟有效的方法。本研究克隆了一個位于小麥染色體1B上、具有典型CC、NBS和LRR結(jié)構(gòu)域的基因。接種白粉菌后,基因在抗病小麥Brock和BJ-1中表達量雖然出現(xiàn)上下調(diào)波動, 但平均表達水平一直高于感病小麥品種京411。采用病毒誘導的基因沉默和轉(zhuǎn)基因過表達技術進行功能分析, 發(fā)現(xiàn)抑制目標基因表達, 抗病小麥品種Brock對白粉菌的抗性顯著降低; 過表達的轉(zhuǎn)基因小麥津強5號對白粉菌抗性明顯提高。說明基因參與小麥抗白粉病的防御反應過程。該研究為小麥抗病品種的選育提供了有價值的備選基因。

小麥; NBS-LRR類基因;; 抗白粉病

目前小麥中已克隆的抗白粉病基因中多數(shù)是NBS-LRR (nucleotide binding site leucine rich repeat, NBS-LRR)類基因, 其中又以CNL (coiled-coil NBS-LRR, CNL)類基因居多[1], 如、、、、、、及其等位基因, 攜帶這些抗性基因的小麥品種田間抗性良好, CNL類基因在小麥白粉病防治上發(fā)揮了重要作用[2-6]。(recognition of, RPP)首先在擬南芥抗霜霉病反應中被鑒定到, 具有典型的CNL結(jié)構(gòu)域, 它通過識別效應蛋白ATR13, 從而誘發(fā)抗病反應[7]。研究發(fā)現(xiàn),基因具有多態(tài)性, 其LRR結(jié)構(gòu)域的多態(tài)性影響了不同生態(tài)型擬南芥對不同病原小種的特異性識別[8-9]。Rentel等[10]、Ramachandran等[11]發(fā)現(xiàn), 霜霉病效應蛋白ATR13能夠抑制ATR13/RPP13復合體誘發(fā)超敏反應。目前, 小麥中已經(jīng)鑒定到多個同源基因, 這些基因在基因序列上都存在較大差異, 且基因功能涉及小麥生長的多個方面。例如,同源基因在小麥抗白粉病[12-14]、小麥抗銹病[15]和小麥面粉顏色方面均發(fā)揮作用[16]。在其他植物的研究中發(fā)現(xiàn),同源基因在柑橘抗白色念珠菌感染[17]、姜黃抗莖腐病[18]、番茄抗黃葉卷曲病毒[19]、葡萄抗白粉病[20]、花生抗黃曲霉病[21]和百合的雜種株高優(yōu)勢[22]也發(fā)揮作用?；蛟诘挚拐婢⒓毦⒉《厩秩竞椭参锷L發(fā)育等多個方面發(fā)揮重要作用。

前期工作中, 課題組配制了京411的抗病近等基因系BJ-1, 對白粉菌侵染早期(12 hpi)感病小麥京411及其抗病近等基因系BJ-1應答基因轉(zhuǎn)錄組比較分析中發(fā)現(xiàn), 位于1B染色體的在小麥抗病近等基因系BJ-1中表達量上調(diào), NCBI/Blast比對分析發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的NBS- LRR類基因結(jié)構(gòu), 為基因家族的同源基因[13,24], 命名為。本研究克隆了這個潛在的抗性基因, 并對其在不同抗、感小麥中的序列組成進行了比較; 分析了在白粉菌脅迫下的表達模式, 通過降低和過表達基因表達水平, 探究該基因在小麥抵抗白粉菌侵染過程中的貢獻, 為小麥抗病品種的選育提供了新的備選基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

Brock是一個抗白粉病小麥品種, 從英國引進, 在苗期和成株期均高抗小麥白粉病。京411是我國北方種植的農(nóng)藝性狀優(yōu)良的小麥品種, 但易感白粉病。本實驗室于2012年, 以Brock為抗病基因供體, 京411為輪回親本, 通過連續(xù)回交6次, 創(chuàng)制了京411抗病近等基因系BJ-1。BJ-1的產(chǎn)量、生長周期、株高、分蘗等特性與輪回親本京411一致, 它的抗病等級為1級。而抗病基因供體親本Brock為0級。BJ-1農(nóng)藝性狀上偏京411, 抗白粉病特性偏Brock[23]。抗白粉病小麥品種Brock, 感白粉病小麥品種京411和抗病近等基因系BJ-1用于小麥全長cDNA的克隆及白粉菌誘導表達分析。感病春麥品種津強5號用于過表達載體的轉(zhuǎn)化。白粉菌菌株E09 (f. sp.E09,E09)用于苗期抗病性鑒定, 由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 TaRPP13-1B全長cDNA的克隆

根據(jù)的序列信息設計引物, 用Primer premier 5.0設計引物TaRPP13-1B-F和TaRPP13-1B-R。將感病小麥品種京411、抗病近等基因系BJ-1和抗病小麥品種Brock培養(yǎng)至第1片葉子完全展開后, 采用抖拂法將白粉菌(E09)接種于小麥葉片12 h后, 取葉片用RNAiso Plus (TaKaRa,中國大連)分別提取總RNA, M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物, 中國大連)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以3個小麥品種(系)的cDNA為模板, 擴增目的基因。PCR反應體系25 μL, cDNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、5× GXL緩沖液5 μL、dNTP混合物2 μL、PrimeSTAR GXL DNA聚合酶0.5 μL、雙蒸水10.5 μL。反應程序為: 94℃ 5 min; 98℃ 10 s, 55℃ 15 s, 68℃ 3 min, 35個循環(huán); 68℃ 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收。按照DNA A-Tailing試劑盒方法加A尾(寶生物, 中國大連), 連接pGEM-T Easy載體(Promega, 美國)并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 挑取LB Amp+(氨芐青霉素, ampicilline)篩選培養(yǎng)基上的陽性克隆, 經(jīng)PCR和酶切鑒定后送蘇州金唯智生物科技有限公司測序。

3'和5'RACE片段的擴增按SMART RACE cDNA擴增試劑盒(Clontech, 美國)的說明書進行。根據(jù)已經(jīng)掌握的部分序列, 用Primer 5.0設計特異引物RPP13-1B-GSP1F和RPP13-1B- GSP2F分別進行3'RACE反應的第1和第2輪PCR; 設計特異引物RPP13-1B-5RACE-1R和RPP13-1B- 5RACE-2R分別進行5'RACE反應的第1和第2輪PCR。將3'和5'RACE第2輪PCR擴增的片段分別克隆至pGEM-T Easy載體, 經(jīng)測序驗證后, 將3'RACE、5'RACE及部分序列進行拼接, 得到拼接后的全長cDNA序列。根據(jù)拼接的全長cDNA序列設計引物-ORF-F/R擴增的全長cDNA, 將擴增產(chǎn)物連接至pGEM-T載體并經(jīng)測序驗證。本研究所用引物序列見表1。

表1 本研究的引物及序列

將基因序列提交NCBI GenBank進行Blast比對;利用DNAMAN軟件對序列進行同源性分析, 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。利用cDNA序列的ORF在小麥聯(lián)盟網(wǎng)站(http://202.194.139.32)進行比對, 分析其染色體定位, 預測DNA序列組成。

1.3 TaRPP13-1B基因的表達分析

將小麥京411、Brock和BJ-1幼苗培養(yǎng)至一葉一心期時, 抖拂法接種E09 2、4、8、12、24和48 h后分別提取葉片總RNA, 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以SYBR Green I作為熒光染料, 利用熒光定量PCR法(quantitative real time PCR, qRT-PCR) (ABI 7500 FAST, 美國)分析白粉菌侵染后基因在苗期京411、Brock和BJ-1中的表達水平。用2–DDCT法[25]計算白粉菌侵染過程中目標基因的相對表達量變化。具體步驟按照FastStart Universal SYBR Green Master (Roche, 美國)試劑說明書進行, PCR體系20 μL, 2× Master Mix (SYBR Green I) 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL。將上述反應體系混合均勻, 進行熒光定量PCR擴增。擴增程序: 50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s, 58℃ 30 s, 40個循環(huán)。以作為內(nèi)參, 每個反應重復5次, 實驗重復3次。

1.4 利用病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技術分析TaRPP13-1B的功能

根據(jù)的測序結(jié)果, 在基因的非保守區(qū)設計引物RPP13-1B-V-F/R, 擴增帶有I接頭的基因片段。BSMVγ:載體經(jīng)I酶切、去磷酸化后, 與沉默基因片段連接, PCR驗證后獲得基因沉默載體BSMVγ:。BSMVα和BSMVγ經(jīng)I酶切, BSMVβ經(jīng)I酶切后, 體外轉(zhuǎn)錄成BSMV病毒, 將病毒摩擦接種于抗病小麥Brock葉片表面沉默目標基因。以GKP buffer組、BSMV:組和BSMV:組為對照組。待BSMV:對照組小麥第三葉白化, 選取少量小麥葉片提取總RNA, 利用qRT-PCR法分析目標基因的沉默效率, 具體步驟同1.3。在已接種病毒的Brock葉片表面接種白粉菌, 接種白粉菌48 h、72 h和7 d后, 利用考馬斯亮藍染色, 在顯微鏡下觀察白粉菌孢子萌發(fā)狀況[26], 照相記錄接菌7 d后葉片表面的白粉菌生長狀態(tài)。明確基因功能。每組統(tǒng)計5片葉子, 每片葉子統(tǒng)計100個白粉菌孢子, 實驗重復3次。

1.5 利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法進行TaRPP13- 1B功能鑒定

以連接有序列的T載體為模板, 擴增獲得帶有E II和II酶切位點和接頭序列的的全長, 利用無縫克隆試劑(全式金, 中國北京)將連接至pCAMBIA1301的相應酶切位點。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至大腸桿菌DH5α, PCR驗證后, 最終獲得包含全長, 啟動子為35S的過表達載體35S:。利用本實驗室改良的農(nóng)桿菌介導的小麥成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化法[27-28], 將含有35S:的農(nóng)桿菌C58C1轉(zhuǎn)入感病春麥津強5號成熟胚, 收獲T0代種子。利用潮霉素篩選、PCR和RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因小麥株系。以轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301質(zhì)粒的津強5號為對照組。利用潮霉素篩選35S:株系至T1代。將T1代轉(zhuǎn)基因小麥培養(yǎng)至一葉一心期, 在小麥葉片接種白粉菌E09, 逐日觀察葉片表型變化直至第7天, 拍照記錄。逐株調(diào)查材料的侵染類型, 按照病葉分級標準分級記錄, 標準如下。1級: 病斑占葉面積的10%以下; 2級: 病斑占葉面積的10%～25%; 3級: 病斑占葉面積的26%～50%; 4級: 病斑占葉面積的51%～ 80%; 5級: 病斑占葉面積的80%以上[29-30]。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaRPP13-1B基因的克隆

根據(jù)序列設計一對特異引物TaRPP13-1B-F/R, 在京411、Brock和BJ-1中擴增得到基因的cDNA序列。為確認該序列是否為全長, 進一步利用RACE技術擴增了該基因的5'和3'非編碼區(qū)。最后克隆得到基因的cDNA全長3232 bp, 包含2934 bp的ORF以及104 bp和194 bp的5'和3'非編碼區(qū)。感病小麥品種京411和抗病近等基因系BJ-1中的基因序列與Brock相同。在小麥聯(lián)盟網(wǎng)站分別進行Blast分析, 推測該基因位于1B染色體; DNA序列長3453 bp, 由2個外顯子(1～933 bp和1453～3453 bp)和1個內(nèi)含子組成(934～1452 bp) (圖1-A)。進一步的氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn), 該基因編碼蛋白具有CC、NB-ARC和LRR結(jié)構(gòu)域, 也是一個典型的CNL類型蛋白(圖1-B)。蛋白質(zhì)的同源比對及進化樹分析發(fā)現(xiàn), 其氨基酸序列與二穗短柄草(XP_010237386.1), 烏拉爾圖小麥(EMS68464.1)和玉米(XP_00864940.1)中RPP13的同源性較高, 分別為93%、79%和66% (圖1-C)。根據(jù)染色體定位信息, 將其命名為。

圖1 TaRPP13-1B基因的結(jié)構(gòu)域分析

A:的基因結(jié)構(gòu); B: TaRPP13-1B蛋白的結(jié)構(gòu)域; C: 不同植物中RPP13蛋白的進化樹。

A: predictive schematic forsequence; B: predictive domain schematic for coding TaRPP13-1B protein; C: the phylogenetic tree of diverse RPP13-like proteins family.

將與的基因序列在IWGSC和小麥聯(lián)盟網(wǎng)站進行Blast比對發(fā)現(xiàn),和基因分別定位于染色體1B和7D, 這與最初的參考基因序列預期一致。這兩個基因均與基因家族具有較高同源性, 具有典型CNL結(jié)構(gòu)域, 但二者的氨基酸序列一致性僅有23.2% (圖2), 由此我們認為這兩個基因在小麥抵抗白粉菌侵染過程中的作用有待進一步深入研究。

2.2 TaRPP13-1B基因的表達分析

在抗病小麥品種Brock中, 除白粉菌侵染4 hpi,基因表達短暫下調(diào),基因表達水平一直高于抗病近等基因系BJ-1和感病小麥品種京411; BJ-1中的本底表達量與京411持平, 2 hpi時表達量逐漸上調(diào), 4 hpi達到高峰, 之后逐漸下降; 京411中基因表達模式與BJ-1一致, 但整體表達量低于抗病近等基因系BJ-1。雖然表達量遠低于BJ-1, 但表達高峰同樣出現(xiàn)在4 hpi; 之后, 表達量開始下降?？傊? 抗病材料中雖然部分接菌時間段內(nèi)(4 hpi)基因的表達出現(xiàn)下調(diào), 但基因的表達水平一直高于感病品種(圖3)。故推測基因參與小麥對白粉菌的抗性反應。

圖2 TaRPP13-1B和TaRPP13-3的同源性分析

2.3 瞬時沉默TaRPP13-1B基因能夠顯著降低小麥對白粉菌的抗性

2.3.1基因沉默小麥的表型分析 由于基因在抗病小麥品種Brock中表達水平較高, 在VIGS實驗中以Brock為沉默對象。待Brock的第二片葉展開, 接種重組病毒。繼續(xù)培養(yǎng)至第三片葉展開, 進行表型觀察, 結(jié)果如圖4-A所示。BSMV:對照組中小麥Brock葉片白化, 說明沉默體系有效; 利用熒光定量qRT-PCR檢測各組材料中的基因的表達量, 從圖4-C可以看出, BSMV:實驗組中目標基因表達量低于另外兩個對照組, 說明瞬時沉默基因表達成功。接種白粉菌7 d后, 觀察BSMV:實驗組、BSMV:對照組以及GKP-buffer對照組的葉片表面白粉菌生長狀態(tài)(圖4-B)。接種白粉菌7 d后, BSMV:實驗組植株的葉片上已經(jīng)出現(xiàn)大量白色菌斑, 2個對照組葉片上也出現(xiàn)菌斑, 但數(shù)量少于實驗組。這些結(jié)果說明降低抗病小麥Brock中基因表達, 能夠增加白粉菌成功侵染效率, 小麥葉片的抗病力下降。

2.3.2基因沉默小麥葉片孢子生長情況分析 進一步觀察接種白粉菌孢子不同時間點的孢子萌發(fā)狀況。接種白粉菌孢子48 h后, 對照組葉片上的白粉菌孢子多數(shù)無法侵入, 為畸形附著胞(圖5-A, B), 而BSMV:實驗組葉片上則開始出現(xiàn)附著胞(圖5-C); 接種白粉菌72 h后, 對照組中可以發(fā)現(xiàn)少量附著胞, 但仍以纖細型或分瓣型的畸形附著胞為主(圖5-D, E), BSMV:實驗組葉片上開始出現(xiàn)少量次級菌絲(圖5-F), 實驗組葉片上白粉菌孢子生長速度明顯快于對照組, 在接菌早期就侵染成功; 接種白粉菌7 d后, 對照組和實驗組葉片上均發(fā)育出分生孢子, 但實驗組小麥葉片表面的孢子數(shù)量更多(圖5-G～I)。這些結(jié)果說明降低抗病小麥Brock中基因表達后, 小麥葉片上白粉菌孢子萌發(fā)速度加快, 分生孢子數(shù)量增多, 小麥的抗病力下降。

圖3 TaRPP13-1B基因的白粉菌誘導表達分析

Jing 411: 感病小麥品種京411; BJ-1: 京411抗病近等基因系; Brock: 抗病小麥品種; Student’s測驗,*:< 0.05;**:< 0.01。

Jing 411: wheat susceptible variety; BJ-1: near isogenic line; Brock: wheat resistant variety; Student’s-test,*:< 0.05;**:< 0.01.

2.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法鑒定TaRPP13-1B基因的功能

2.4.1 感病小麥津強5號的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定 利用農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法將重組載體轉(zhuǎn)入津強5號小麥成熟胚, 并對該基因的T0代植株進行轉(zhuǎn)基因鑒定, 獲得11株T0代植株(圖6)。培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因苗至T1代, 利用qRT-PCR檢測目標基因表達, 發(fā)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)基因小麥中的目標基因表達量顯著高于對照組, 平均為對照組的3.74倍, 最高的達到對照組的5倍(T1-1～T1-4號轉(zhuǎn)基因植株), 最低約為對照組的2.6倍(T1-2和T1-3號轉(zhuǎn)基因植株) (圖7)。說明成功轉(zhuǎn)入津強5號小麥并穩(wěn)定遺傳,實現(xiàn)目標基因在受體中表達。

2.4.2T1代轉(zhuǎn)基因植株的抗病性鑒定 為了進一步驗證該基因的抗白粉病特性, 分別選取了4個過表達的T1代轉(zhuǎn)基因株系(T1-4、T1-6、T1-8和T1-11)培養(yǎng)至一葉一心期, 利用E09侵染轉(zhuǎn)基因小麥及其對照組, 觀察葉片表型。接種白粉菌48 h和72 h時, 野生型和轉(zhuǎn)基因小麥葉片表面的白粉菌孢子的生長情況相近, 無顯著差別。白粉菌侵染7 d后, 野生型和轉(zhuǎn)基因小麥葉片表面都出現(xiàn)白色菌落, 但轉(zhuǎn)基因小麥葉片表面菌落少于野生型(圖8-A)。為了進一步確定轉(zhuǎn)基因小麥對白粉病的抗病程度, 利用ImageJ對轉(zhuǎn)基因小麥及其對照組葉片病斑面積進行統(tǒng)計分析, 結(jié)果如圖8-B所示, 對照組葉片病斑面積為64.6%, 發(fā)病等級為4級(感病)。4個轉(zhuǎn)基因小麥葉片病斑面積較小, 在10%～25%之間, 發(fā)病等級均為2級。以上結(jié)果說明, 過表達提高了感病小麥津強5號的抗病性,基因是抗白粉病相關基因。

圖4 沉默TaRPP13-1B后小麥抗病性變化

A: Brock接種BSMV病毒后表型; B: 沉默葉片接種白粉菌E09的表型觀察; C: 各實驗組中基因的相對表達量(*:< 0.05)。

A: phenotype of Brock leaves inoculated with BSMV; B:-knockdown plants inoculated withE09; C: the relative expression of(*:< 0.05).

(圖5)

LA: 分瓣型畸形附著胞; SA: 纖細型附著胞; AGT: 喙型附著胞; SH: 次生菌絲; BC: 念珠狀分生孢子。

LA: lobed appressoria; SA: slender appressoria; AGT: appressorium germ tube; SH: the secondary hypha; BC: beaded conidia

圖6 TaRPP13-1B T0代轉(zhuǎn)基因小麥的PCR檢測

M: DL2000 marker; 1: 1301對照組; 2: 質(zhì)粒陽性對照; 3～14: T0代轉(zhuǎn)基因植株。

M: DL2000 marker; 1: control; 2: positive control; 3–14: T0transgenic wheat.

圖7 TaRPP13-1B在T1代轉(zhuǎn)基因小麥中的表達量分析

C: 對照組; 1～11: T1-1～T1-11 轉(zhuǎn)基因單株(**:< 0.01)。

C: control; 1–11: T1-1–T1-11: transgenic wheat (**:< 0.01).

3 討論

植物中克隆了大量的CNL類抗病基因。是Yahiaoui等[31]利用圖位克隆法克隆得到第1個抗白粉病基因, 包含典型的CNL結(jié)構(gòu)域。Brunner等[32-33]將及其等位基因轉(zhuǎn)化感病六倍體小麥, 所有轉(zhuǎn)基因小麥均表現(xiàn)出田間抗白粉菌特性。也是一個典型的CNL抗病基因。目前, 通過國家和省級品種審定攜帶基因小麥新品種有30多個,基因是中國小麥白粉病抗性育種利用的重要抗源[3,34-35]。[36-39]、[40]和(及其等位基因)[41-43]也都是CNL抗白粉病基因, 攜帶這些抗性基因的小麥品種均表現(xiàn)出良好的田間抗性。這些已有研究結(jié)果說明CNL類基因在小麥白粉病防治上發(fā)揮了重要作用。

前期研究中, 我們對感病小麥京411及其抗病近等基因系BJ-1的染菌前后的轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)了位于染色體1B的同源基因,該基因在白粉菌侵染后表達量上調(diào), 且在抗病材料上調(diào)明顯[24]。本研究以為基礎, 結(jié)合RACE技術, 克隆了Brock、BJ-1和京411中基因cDNA序列, 3個小麥品種中的cDNA序列相同, 它與二穗短柄草(XP_010237386.1)有較高同源性(93%), 與烏拉爾圖小麥(EMS68464.1)有較高同源性(79%)。雖然不同抗性小麥品種中的基因cDNA序列相同, 但目標基因在抗/感小麥品種中的表達量差異顯著, 抗病小麥中表達水平高于感病小麥。所以我們推測可能是不同小麥品種中的啟動子區(qū)或上游調(diào)控基因存在差異, 但仍需進一步研究證明。與基因一樣[13], 它們都屬于基因家族。在IWGSC進行序列比對分析后發(fā)現(xiàn), 二者位于不同的染色體, 序列一致性僅有23.2%。根據(jù)二者基因序列很難預測基因功能之間的聯(lián)系。

圖8 過表達TaRPP13-1B基因提高小麥對白粉菌E09的抗性

A: 轉(zhuǎn)基因小麥在白粉菌E09侵染7 d后的葉片表型; B: 白粉菌E09侵染下的小麥葉片病斑面積(**:< 0.01)。

A: phenotype of transgenic wheat leaves inoculated withE09 for 7 days; B: the lesion area in transgenic wheat leaves (**:< 0.01).

利用VIGS技術沉默基因, 白粉菌侵染實驗表明, 接菌48 h和72 h后, 實驗組葉片上白粉菌生長速度明顯快于對照組, 說明目標基因表達量降低有利于病原菌侵染, 目標基因在病原菌侵染早期發(fā)揮作用。接菌7 d后的實驗組和對照組葉片上都出現(xiàn)肉眼可見的白粉菌孢子, 但對照組葉片上孢子堆較少, 這表明基因表達被抑制后在一定程度上降低了抗病小麥植株的抗性。進一步構(gòu)建過表達基因的轉(zhuǎn)基因小麥, 接種白粉菌7 d, 發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小麥葉片表面白粉菌生長數(shù)量和狀態(tài)明顯慢于野生型津強5號。這些研究結(jié)果進一步確認,基因參與小麥-白粉菌互作過程, 發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié)論

本研究利用RACE技術克隆了小麥。沉默/過表達目標基因后的功能研究表明, 該基因參與小麥對白粉菌侵染的早期抗病防御反應, 在小麥-白粉菌互作過程中發(fā)揮正向作用, 研究結(jié)果為小麥白粉病抗性品種的選育提供備選基因。

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Cloning and functional analysis ofgene related to powdery mildew resistance in wheat cultivar Brock

LIU Xiao-Ying1, ZHANG Chi1, WANG Xue-Qing1, YANG Chen-Xiao1, WANG Guang-Yu1, BIAN Yun-Di1, FANG Fang2, WANG Ying2, and WANG Zhen-Ying1,*

1College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance, Tianjin 300387, China;2Forestry Development Service Center of Baodi District, Tianjin 301899, China

Powdery mildew caused byf. sp.() is a severe wheat disease in China. Cloning and pyramiding of different resistance genes to improve crop disease resistance is one of the most cost-effective methods. In this study,on chromosome 1B, which encodes the CC, NB-ARC, and LRR domains, was isolated from common wheat. The relative expression level ofin Brock and BJ-1 fluctuated afterinoculation, but the average expression levels were always higher than the susceptible wheat Jing 411. The function ofwas elucidated by virus-induced gene silencing (VIGS) and overexpression transgenic technique. Silencing ofresulted in decreased disease resistance in Brock. Overexpression ofimproved disease resistance in the transgenic wheat seedlings of Jinqiang 5 cultivar. The above results demonstrated thatwas involved in the defense response of wheat to powdery mildew, which provided valuable genetic resources for breeding of resistant varieties.

wheat;gene;; powdery mildew resistance

10.3724/SP.J.1006.2023.21003

本研究由國家自然科學基金項目(31071671)和天津市科技支撐項目(18YFZCNC01100, 17JCZDJC34100)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31071671) and the Tianjin Science and Technology Program (18YFZCNC01100, 17JCZDJC34100).

王振英, E-mail: skywangzy@tjnu.edu.cn

E-mail: skylxy@tjnu.edu.cn

2022-01-16;

2022-05-05;

2022-05-25.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220525.1330.002.html

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