利用CRISPR/Cas9探究水稻OsPIN5c基因功能

楊曉祎 王慧慧 張艷雯 侯典云 張紅曉 康國章 胥華偉,*

利用CRISPR/Cas9探究水稻基因功能

楊曉祎1王慧慧1張艷雯1侯典云1張紅曉1康國章2胥華偉1,*

1河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南洛陽 471000;2河南農(nóng)業(yè)大學(xué)省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室, 河南鄭州 450046

生長素極性運輸在植物生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用, 生長素輸出載體蛋白(PIN-FORMED, PIN)是控制生長素極性運輸?shù)年P(guān)鍵蛋白。雖然部分水稻基因功能已有報道, 但水稻的生物學(xué)功能仍有待研究。本研究在第1外顯子處設(shè)計靶點并構(gòu)建CRISPR/Cas9載體, 通過轉(zhuǎn)化粳稻品種日本晴獲得24株轉(zhuǎn)基因植株, PCR產(chǎn)物直接測序分析表明其中15株發(fā)生突變, 突變率為62.5%, 突變類型為雙等位突變; 進一步從T1代突變體中篩選獲得3種不同的純合突變體, 將其命名為、和。序列比對分析表明, 這3種類型的突變均造成移碼突變和蛋白翻譯提前終止, 由原來的398個氨基酸分別縮短為109、106和250個氨基酸; 跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域分析表明, 3種突變體中OsPIN5c蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)完全消失; 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測表明3種突變體中OsPIN5c蛋白螺旋結(jié)構(gòu)明顯減少。突變體的苗高、根長和不定根數(shù)均顯著低于野生型植株。組織特異性表達表明主要在根中表達。突變體根中和表達量提高; 生長素合成關(guān)鍵基因、、和的表達量也顯著提高。突變體根的向重性受到部分抑制。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得純合突變體并探討了基因功能, 為利用基因進行作物遺傳改良提供了潛在的基因資源。

; CRISPR/Cas9; 基因功能; 水稻

生長素是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素, 參與調(diào)控幾乎所有生長發(fā)育過程中的細胞分裂和伸長過程[1]。不同組織部位中生長素的含量和分布與生長素極性運輸密切相關(guān)[2], 而PIN-FORMED (PIN)蛋白是調(diào)控生長素極性運輸?shù)闹匾鞍准易錥3]。水稻(L.)是重要的糧食作物[4], 深入研究基因的功能, 可為調(diào)控水稻株型、提高品質(zhì)及產(chǎn)量等提供潛在的基因資源。

生長素主要在地上部幼嫩組織如葉原基及幼葉中合成[5-6], 然后通過生長素極性運輸系統(tǒng)向下運輸?shù)匠墒炱鞴倩蚪M織中發(fā)揮作用, 其中至少包括生長素輸入載體AUXIN RESISTANT/LIKE RESISTANT (AUX1/LAX)和生長素輸入/輸入載體多重抗藥性/磷酸糖蛋白家族MDR/PGP/ABCB (multidrug resistance-like/P-glycoproteins)以及PIN蛋白家族[7], 其中PIN基因家族在極性運輸中起著關(guān)鍵作用[3]。最早對基因的研究來源于雙子葉模式植物擬南芥()[8]。擬南芥中共有8個基因,基因家族的每個成員的表達模式均不大相同[8]?；蛟跀M南芥的生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用, 如缺失使植物出現(xiàn)異常的針狀花序[9], 缺失會使根向重性喪失[10-11], 缺失會使下胚軸向性生長受到抑制等[12]。與擬南芥相似, 水稻也是多基因家族, 水稻中有12個基因, 分別為4個()、1個、3個()、1個、1個和2個(), 其中、和為單子葉植物特有的基因[13-14]。不同基因的組織表達特異性不同[13-14]。的4個基因在根、莖、根莖結(jié)合部均能檢測到表達, 但以根中表達量最高[15]。其中和共同參與調(diào)控根系的發(fā)育, 影響水稻的株高、分蘗角度等重要農(nóng)藝性狀;和則共同參與調(diào)控稻穗的正常發(fā)育[15]。主要在根和根莖結(jié)合部表達[13]。過表達會使植株矮化、分蘗數(shù)增多等[16];也通過介導(dǎo)生長素的分布參與調(diào)控根系的向性反應(yīng)[17]和鋁脅迫[18-19]。定位于質(zhì)膜上, 主要在維管組織中表達, 參與調(diào)控水稻的抗旱性, 敲除會影響水稻根系的正常發(fā)育[20]。主要在葉鞘、莖、葉、根(主要是成熟區(qū)和伸長區(qū))中表達, 通過介導(dǎo)生長素的穩(wěn)態(tài)、運輸及分布從而改變植株的構(gòu)型和產(chǎn)量; 過表達會使水稻株高、穗長、結(jié)實率等重要農(nóng)藝性狀參數(shù)等降低, 而敲除則反之[21]。定位于質(zhì)膜, 主要在根莖結(jié)合部的維管組織和分蘗芽中表達, 參與調(diào)控水稻的分蘗數(shù)以及產(chǎn)量等[22]。綜上,基因在調(diào)控水稻生長發(fā)育中發(fā)揮著重要作用, 因此深入研究基因功能對發(fā)掘優(yōu)質(zhì)基因進行水稻遺傳改良具有重要意義。

如上所述, 雖然部分基因功能已有報道, 但的基因功能仍不明確。隨著CRISPR/ Cas9基因編輯技術(shù)的逐步完善, 近年來利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究基因功能成為一條高效、快速的途徑, CRISPR/Cas9是公認的最簡易高效的基因編輯技術(shù)[23]。通過CRISPR/Cas9技術(shù)突變基因, 獲得突變體, 為研究基因功能奠定基礎(chǔ)。本研究以水稻日本晴(Nipponbare)為材料, 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)獲得純合突變體。7 d突變體幼苗的苗高、根長和不定根數(shù)與野生型無顯著差異, 但14 d幼苗的苗高、根長和不定根數(shù)均顯著低于野生型植株, 表明在調(diào)控水稻株型中發(fā)揮著重要作用。突變體根中和的表達量顯著上調(diào); 生長素合成關(guān)鍵基因和基因的表達也受到顯著誘導(dǎo)。此外,突變體根的向重性受到部分影響。突變體的獲得為進一步發(fā)掘的基因功能及利用創(chuàng)制新的種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2018—2021年在河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院進行。大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞及農(nóng)桿菌() EHA105感受態(tài)細胞由河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院資源植物評價與創(chuàng)新利用實驗室自制。基因編輯載體CRISPR-RICE由中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康研究員提供。限制性內(nèi)切酶I購自NEB (北京)有限公司; T4連接酶及高保真酶PrimeSTAR等購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司; 質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等由OMEGA Bio-Tek公司提供; 引物及測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.2 基因編輯載體的構(gòu)建

通過華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室劉耀光院士團隊開發(fā)的基因編輯工具包CRISPR-GE (http://skl.scau.edu.cn/)進行靶位點的設(shè)計[24]。選擇靠近5'編碼區(qū)的序列作為靶位點, 通過水稻全基因組BLAST比對分析驗證靶位點的特異性。在上下游引物的5'端分別添加接頭序列TGTGT和AAAC, 用于將目的片段連入CRISPR- RICE載體?；蚓庉嬢d體的構(gòu)建參考吳世洋等[25], 通過凍融法將重組CRISPR-OsPIN5c基因編輯載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻粳稻品種日本晴, 獲得抗性植株。

1.3 基因編輯株系的篩選

采用CTAB法提取T0代水稻葉片基因組DNA[26], 通過PCR擴增片段獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株。參考基因組序列, 在靶位點兩側(cè)設(shè)計引物PIN5c-Assay-F和PIN5c-Assay-R, 通過PCR擴增基因組片段并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序, 測序結(jié)果通過CRISPR-GE分析測序結(jié)果的突變類型[27]。為篩選獲得無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變體, 首先以PCR擴增片段的方法進行篩選, 隨后以植株葉片為材料進一步以潮霉素溶液浸泡法進行驗證[28-29]。無轉(zhuǎn)基因成分純合突變體載體構(gòu)建及突變體篩選引物見表1。

1.4 生物信息學(xué)分析

以MEGA7進行蛋白序列比對[30], 比對結(jié)果進一步通過Jalview進行修飾[31]。通過在線網(wǎng)站(TMHMM Server v. 2.0: http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)分析蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域[32]。通過SWISS MODEL網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)[33]。

1.5 ospin5c突變體表型分析

稻種浸種2 d后移入鋪有浸濕濾紙的培養(yǎng)皿中, 30℃暗培養(yǎng)催芽。露白后將稻種轉(zhuǎn)移到96孔板中, 以木村B營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng), 分別在第7天和第14天統(tǒng)計苗高、根長和不定根數(shù)。試驗重復(fù)3次, 以GraphPad Prism 8.0通過單因素方差分析及Tukey’s法多重比較進行數(shù)據(jù)分析及作圖。

1.6 基因表達分析

以野生型日本晴幼苗為材料, 通過qRT-PCR分析的組織表達特異性, 將根中的表達量定為1。以根為材料分析突變對其他基因及基因表達的影響, 以(Os03g0718100)作為內(nèi)參, 以2–ΔΔCT法計算基因的相對表達量, qRT-PCR實驗方法參考吳世洋等[25]。試驗進行至少3次生物學(xué)重復(fù), 每次3個技術(shù)重復(fù)。所用引物見表1。

1.7 ospin5c突變體根向重性分析

根的向重性分析參考Lino等[34]的方法。將0.7%滅菌瓊脂倒入4.5 mL四面透光比色皿(上部內(nèi)徑11 mm × 11 mm, 高度43 mm, Thermo Fisher)冷卻后備用。稻種滅菌后胚朝上將其1/2插入瓊脂中, 置于黑色培養(yǎng)盒中, 培養(yǎng)盒底部及內(nèi)壁鋪上浸濕紙巾, 頂部以保鮮膜封住以保持濕度進行暗培養(yǎng)。根長約1 cm時將其水平放置開始向重性處理, 拍照并統(tǒng)計0、3、6、9、12和24 h的根部彎曲角度。

表1 引物及序列

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA的設(shè)計以及基因編輯表達載體的構(gòu)建

參考基因組(LOC_Os09g32770)序列, 通過在線分析工具包CRISPR-GE在第1外顯子處設(shè)計20 bp的靶位點序列, 靶位點位于CDS的第289～308 bp處(圖1-A)。引物退火形成Oligo二聚體, 與CRISPR-RICE載體進行連接, 通過引物M13-F和PIN5c-CRISPR-R進行陽性克隆的篩選, 結(jié)果表明可以擴增得到一段約290 bp的DNA條帶(圖1-B), 分子量大小與預(yù)期吻合。測序確認獲得重組CRISPR/Cas9載體, 轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞EHA105。

圖1 OsPIN5c gRNA靶位點示意圖及陽性克隆篩選

A:靶位點示意圖; PAM: 前間隔序列鄰近基序; 黑色下畫線表示PAM序列。B: PCR篩選陽性克隆, M: DL2000 DNA marker; 1～12: PCR產(chǎn)物。

A:target site in schematic diagram; PAM: protospacer adjacent motif; black line indicates PAM sequences. B: positive clones by PCR. M: DL2000 DNA marker; 1–12: PCR products.

2.2 轉(zhuǎn)基因株系的突變類型分析

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得T0代轉(zhuǎn)化植株, PCR檢測表明外源片段成功整合到水稻基因組(結(jié)果未顯示), 最終共篩選到24株陽性植株。擴增含有靶位點的基因組序列并測序分析突變類型(圖2-A)。結(jié)果表明, 在24株轉(zhuǎn)基因植株中, 共有15株發(fā)生了突變, 突變率為62.5%, 突變類型為雙等位突變。共檢測到2種主要類型的突變, 一種為刪除10個堿基和1個堿基, 一種為刪除2個堿基和插入1個堿基, 且發(fā)生編輯的位置不同(圖2-B)。

將T0代篩選獲得的突變植株繼續(xù)種植收獲種子,通過PCR擴增結(jié)合測序分析從T1代植株中篩選純合突變體。最終獲得刪除1、2和10個堿基的3種不同類型純合突變體, 將其分別命名為、和(圖3)。

Cas9蛋白的存在可能會造成潛在的脫靶效應(yīng), 為排除Cas9的潛在干擾, 進一步通過PCR擴增片段結(jié)合葉片潮霉素浸泡法篩選獲得無轉(zhuǎn)基因成分的突變體。結(jié)果如圖4所示, 從25株純合株系中共篩選到6株無轉(zhuǎn)基因成分的突變體(圖4-A), 潮霉素葉片浸泡實驗進一步確認了PCR結(jié)果的準確性 (圖4-B)。

2.3 OsPIN5c突變蛋白的生物信息學(xué)分析

為確認蛋白水平是否發(fā)生了有效突變, 分析了OsPIN5c突變蛋白在氨基酸序列、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域以及三級結(jié)構(gòu)方面的變化。蛋白序列比對結(jié)果表明, 3種突變都導(dǎo)致移碼突變并使轉(zhuǎn)錄提前終止, 編碼氨基酸數(shù)由野生型的398個縮短為109、106和250個(圖5-A)。以MEGA7比對野生型和突變體OsPIN5c蛋白氨基酸序列, 結(jié)果表明OsPIN5c-2蛋白的前99個氨基酸殘基與野生型一致, 而OsPIN5c-1和OsPIN5c-3蛋白的前101個氨基酸殘基與野生型一致, 剩余氨基酸的相似性都較低(圖5-B)。

PIN蛋白功能與跨膜結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[35]。跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域分析表明, 野生型OsPIN5c蛋白含有7個跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域, 其中前5個位于中央親水環(huán)的上游, 后2個位于中央親水環(huán)的下游(圖6)。雖然蛋白序列比對分析表明OsPIN5c突變蛋白N段有約100個氨基酸殘基和野生型完全一致(圖5), 但跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域分析表明3種突變體中OsPIN5c蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域全部消失(圖6-A)。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明, OsPIN5c突變蛋白的三級結(jié)構(gòu)更加簡單, 與野生型的完全不同, 僅剩下一個較明顯的螺旋結(jié)構(gòu)(圖6-B)。綜上, 一系列分析表明OsPIN5c在核酸及蛋白水平都發(fā)生了突變, 表明基因功能可能受到影響。由于3個突變體中都發(fā)生了有效突變, 后續(xù)主要以和進行表型分析等實驗。

圖2 T0代突變植株的篩選及分析

A: PCR擴增基因組片段; M: DL2000 DNA marker; 1～7: PCR產(chǎn)物。B: 突變類型分析, PAM: 前間隔序列鄰近基序; 黑色下畫線表示PAM序列。

A: PCR amplification ofgenomic fragments; M: DL2000 DNA marker; 1–7: PCR products. B: mutation type analysis. PAM: protospacer adjacent motif; black line indicates PAM sequence.

圖3 T1代純合ospin5c突變體的篩選

PAM:前間隔序列鄰近基序; 黑色下畫線表示PAM序列; 紅色箭頭表示突變位點。

PAM: protospacer adjacent motif; black line indicates PAM sequence; red arrows show the mutation sites.

圖4 無轉(zhuǎn)基因成分植株篩選

A: PCR篩選結(jié)果; M: DL2000 DNA marker; 1～25:PCR擴增結(jié)果; P: 陽性對照(質(zhì)粒); N: 陰性對照(WT)。B: 葉片潮霉素抗性篩選結(jié)果, 1～25:離體葉片潮霉素篩選。

A: PCR screening results; M: DL2000 DNA marker; 1–25:PCR amplification results; P: positive control; N: negative control. B: hygromycin sresistance assay of detached leaves. 1–25: hygromycin sresistance assay ofdetached leaves.

(圖5)

A: 靶位點氨基酸變化; PAM: 前間隔序列鄰近基序; 下畫線對應(yīng)的氨基酸表示突變氨基酸; 星號表示翻譯的終止。B: 突變蛋白比對分析。

A: amino acid change of the target sites; PAM: protospacer adjacent motif; underlined amino acids indicate mutant amino acids; asterisk indicates the end of translation. B: blast analysis of the mutant proteins.

圖6 OsPIN5c突變蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域及三級結(jié)構(gòu)分析

A: 跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域分析; B: 三級結(jié)構(gòu)分析。

A: transmembrane helices (TMH) analysis; B: tertiary structure analysis.

2.4 ospin5c突變體表型分析

7 d幼苗的表型分析表明,突變體與野生型植株在苗高、根長和不定根數(shù)上沒有顯著差異(圖7-A), 但隨著培養(yǎng)時間的延長, 突變體的生長受到明顯影響。培養(yǎng)至第14天時,突變體的苗高比野生型降低約14%, 根長降低約18%, 不定根數(shù)降低了11%～15% (圖7-B), 表明參與調(diào)控水稻幼苗的生長發(fā)育。

2.5 ospin5c突變體基因表達分析

組織特異性表達分析表明,主要在水稻根部表達, 其次是莖和葉鞘, 而在葉片和根莖結(jié)合部的表達量很低(圖8-A), 故提取14 d野生型和突變體根總RNA, 通過qRT-PCR檢測基因和生長素合成關(guān)鍵基因基因家族的表達情況。結(jié)果表明,突變顯著誘導(dǎo)了和及生長素合成關(guān)鍵基因、、和的表達(圖8-B)。

2.6 ospin5c突變體根向重性分析

幼苗期表型(圖7)和基因表達分析(圖8)表明,突變體中生長素穩(wěn)態(tài)很可能受到影響, 而生長素的穩(wěn)態(tài)又與根的向重性密切相關(guān)[36]。進一步檢測突變對根向重性的影響, 結(jié)果表明, 水平放置3 h時, 雖然突變體根的彎曲角度小于野生型植株, 但未達到顯著性差異; 處理6 h和9 h時僅有突變體根向重性受到顯著抑制, 處理12 h和24 h時2種突變體根的向重性彎曲角度與野生型的差異逐漸增大, 顯著小于野生型植株(圖9), 說明的突變部分影響了根的向重性。

圖7 幼苗期ospin5c突變體表型

A: 7 d突變體表型分析。B: 14 d突變體表型分析(≥ 15)。**表示< 0.01水平差異。

A: phenotypic analysis of 7-day-oldmutants. B: phenotypic analysis of 14-day-oldmutants (≥ 15). **:< 0.01.

圖8 基因表達分析

A:組織特異性表達分析。B:和表達分析; *表示< 0.05水平差異, **表示< 0.01水平差異, ***表示< 0.001水平差異。

A: tissue-specific analysis of. B: the relative expression levels ofandgenes. *:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001.

圖9 野生型(WT)和ospin5c突變體根向重性分析

A: 重力刺激后野生型(WT)和突變體表型, 0～24 h表示重力刺激處理時間。B: 重力刺激后野生型(WT)和突變體根彎曲角度統(tǒng)計分析(≥ 12); *表示< 0.05水平差異, **表示< 0.01水平差異。

A: the phenotypes of WT andmutants after gravity stimulus; 0–24 h indicate time after gravity stimulus. B: statistical analysis of root reorientation angle in WT andmutants after gravity stimulus (≥ 12). *:< 0.05; **:< 0.01.

3 討論

近年來, CRISPR/Cas9技術(shù)在植物基因功能研究以及遺傳改良等方面得到廣泛應(yīng)用。如Zhang等[37]通過CRISPR/Cas9技術(shù)編輯小麥基因提高了小麥(L.)的氮素利用效率及田間產(chǎn)量, Zhang等[38]通過CRISPR/Cas9技術(shù)降低稻米直鏈淀粉含量, Wang等[39]通過CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制香味玉米(L.), Zhang等[40]在異源六倍體高羊茅()中實現(xiàn)基因編輯等。此外, CRISPR/Cas9技術(shù)也在大豆(L.)、花生(L.)以及油菜(L.)等作物中得到廣泛應(yīng)用[41-43]。同時, 基因編輯技術(shù)也發(fā)展迅速, 如華南農(nóng)業(yè)大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室劉耀光院士團隊開發(fā)的多基因編輯系統(tǒng)為研究者提供便利的基因編輯方法[44], 中國科學(xué)院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康院士團隊開發(fā)的高效片段靶向敲入和替換技術(shù),其靶向敲入效率可達50%, 極大地方便植物研究及育種工作[45]; 上海師范大學(xué)張輝課題組開發(fā)出高效的堿基編輯系統(tǒng), 在水稻中的編輯效率幾乎達到100%[46]; 隨后在雙子葉植物中也開發(fā)出一套高效的植物腺嘌呤單堿基編輯器, 其效率達到71.4%[47]。這些基因編輯系統(tǒng)的開發(fā)為進一步研究基因功能進行遺傳改良奠定了基礎(chǔ)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可造成不同形式的突變類型, 如堿基的插入、缺失或替換[48-50]。本實驗中基因的突變類型主要是少數(shù)堿基的缺失, 在篩選獲得的3種純合突變中, 缺失堿基均導(dǎo)致移碼突變及轉(zhuǎn)錄提前終止。氨基酸序列比對、蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域以及三級結(jié)構(gòu)分析表明OsPIN5c蛋白均發(fā)生不同程度的變化。選擇不同的位點進行編輯也可能會獲得基因表達水平不同的株系, 為研究基因功能奠定基礎(chǔ)。通常, 利用CRISPR/Cas9對基因進行編輯時, 其T0株系代大多數(shù)為雙等位突變、純合突變或者雜合突變[51]。本研究最終獲得3種不同突變類型的純合突變體。

對于基因功能的研究以前多采用反義RNA或RNA干涉的方法使基因沉默, 但由于反義RNA及RNA干涉一般使用較長的目的片段, 故有可能造成非特異沉默。因此對于核苷酸序列相似性高的基因家族來說, 對其功能的研究可能有限制[15]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)所使用的靶序列更短, 可以精確地對基因進行定點編輯, 這為多基因家族的功能研究提供了有效的技術(shù)手段。與擬南芥的氨基酸序列相似性較高[13-14], 暗示其功能可能與擬南芥類似。在擬南芥中蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 很可能主要介導(dǎo)生長素從細胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔生長素的轉(zhuǎn)運, 從而調(diào)控不同亞細胞結(jié)構(gòu)間生長素的平衡;突變抑制側(cè)根形成, 且突變體主根與下胚軸發(fā)育遲緩; 過表達則導(dǎo)致擬南芥胚胎發(fā)育異常, 葉片呈窄長型, 且擬南芥中游離態(tài)生長素含量略有降低[52]。OsPIN5b蛋白也定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 在水稻生長發(fā)育中起著重要作用[21], 但目前基因功能未有報道。

本研究通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點突變, 獲得3種不同類型的純合突變體 (圖3); 蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果顯示野生型OsPIN5c蛋白長度大于OsPIN5c突變蛋白(圖5); 突變蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域消失, 三級結(jié)構(gòu)也相對更簡單(圖6), 說明OsPIN5c蛋白功能可能受到影響。表型分析表明, 7 d突變體幼苗表型與野生型沒有顯著差異, 而培養(yǎng)至14 d時,突變體的苗高、根長和不定根數(shù)都要顯著低于野生型植株(圖7), 說明參與調(diào)控水稻幼苗株型。組織特異性表達分析表明,主要在水稻根、莖和葉鞘中表達(圖8-A),功能缺失導(dǎo)致突變體苗高、根長、不定根數(shù)受到影響(圖7)?；虮磉_分析表明,突變體中基因(和)和基因(、、和)表達提高, 說明突變體中生長素的運輸及穩(wěn)態(tài)很可能受到影響。在根、莖、葉等組織中均有表達, 而在根中主要在根尖部位表達[13], 很可能與植物根的發(fā)育有關(guān)。研究表明和確實共同參與調(diào)控水稻根系的發(fā)育[15]。是否與共同參與調(diào)控水稻根系發(fā)育仍有待研究。利用RNA干涉技術(shù)敲除基因?qū)е赂头痔Y等增多, 而過表達則同樣導(dǎo)致根系發(fā)育受阻[21]。與過表達植株中生長素合成關(guān)鍵基因、和的表達量提高類似[21],突變體中這3個基因也受到誘導(dǎo)表達, 故突變體根系發(fā)育異常很可能也與表達量提高有關(guān), 但其潛在聯(lián)系還需進一步實驗驗證。

向重性反應(yīng)一般由重力感應(yīng)、信號傳導(dǎo)以及不對稱生長反應(yīng)3個連續(xù)的步驟組成[53], 根的向重性與生長素濃度及分布密切相關(guān)。已有的研究表明,基因在植物根的向重性反應(yīng)中起著重要作用, 如擬南芥中和參與調(diào)控根的向重性。主要在向重性反應(yīng)發(fā)生彎曲的根尖伸長區(qū)表達[54], 參與根的向重性反應(yīng)[10-11]。AtPIN3定位于根尖小柱細胞的下側(cè), 可能介導(dǎo)根尖生長素的分布從而引起不對稱生長[2,55],的缺失也降低了根的向重性反應(yīng), 同時也抑制了下胚軸以及根的生長[12,56-57]。水稻也在根的向重性反應(yīng)中起著重要作用[58],的表達受到重力刺激的強烈誘導(dǎo), 很可能也參與調(diào)控根的向重性[59], 但是否參與調(diào)控根的向重性尚不明確。本研究中,突變引起根中基因和基因表達的變化(圖8), 很可能擾亂了生長素的穩(wěn)態(tài),進而可能影響根的向重性。向重性試驗表明,突變體根的向重性確實受到部分影響, 向重性處理12 h和24 h后, 突變體根的彎曲角度明顯小于野生型植株(圖9), 表明基因直接或間接參與調(diào)控根的向重性, 但其潛在的調(diào)控機制仍有待研究。

本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù), 首次成功獲得3種不同類型的純合突變體, 并對基因功能進行了初步探索。的突變影響了水稻幼苗地上部和地下部的發(fā)育, 同時其他幾個基因以及生長素合成關(guān)鍵基因的表達量提高, 這些可能共同組成一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響植株的生長發(fā)育。同時,突變體根的向重性受到部分抑制。純合突變體的獲得, 不僅為深入研究基因功能提供了材料, 也為進一步通過雜交獲得的雙突及多突等突變體奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù), 首次對水稻生長素輸出載體基因進行定點突變, 成功獲得3種類型的無轉(zhuǎn)基因成分的純合突變體。突變影響了水稻幼苗的正常生長發(fā)育、和基因表達以及根的向重性反應(yīng)。

[1] Benkova E, Michniewicz M, Sauer M, Teichmann T, Seifertova D, Jurgens G, Friml J. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation., 2003, 115: 591–602.

[2] Friml J. Auxin transport—shaping the plant., 2003, 6: 7–12.

[3] Petrasek J, Mravec J, Bouchard R, Blakeslee J J, Abas M, Seifertova D, Wisniewska J, Tadile Z, Kubes M, Covanova M, Dhonukshe P, Skupa P, Benkova E, Perry L, Krecek P, Lee O R, Fink G R, Geisler M, Murphy A S, Luschnig C, Zazimalova E, Friml J. PIN proteins perform a rate-limiting function in cellular auxin efflux., 2006, 312: 914–918.

[4] Karki S, Rizal G, Quick W P. Improvement of photosynthesis in rice (L.) by inserting the C4pathway.(New York), 2013, 6: 1–8.

[5] Woodward A W. Auxin: regulation, action, and interaction., 2005, 95: 707–735.

[6] Zhao Y. Auxin biosynthesis and its role in plant development., 2010, 61: 49–64.

[7] Michiewicz M, Brewer P B, Friml J. Polar auxin transport and asymmetric auxin distribution., 2007, 5: e0108.

[8] Krecek P, Skupa P, Libus J, Naramoto S, Tejos R, Friml J, Zazimalova E. The PIN-FORMED (PIN) protein family of auxin transporters., 2009, 10: 249.

[9] Okada K, Ueda J, Komaki M K, Bell C J, Shimura Y. Requirement of the auxin polar transport system in early stages offloral bud formation., 1991, 3: 677–684.

[10] Luschnig C, Gaxiola R A, Grisafi P, Fink G R. EIR1, a root-specific protein involved in auxin transport, is required for gravitropism in., 1998, 12: 2175–2187.

[11] Muller A, Guan C, Galweiler L, Tanzler P, Huijser P, Marchant A, Parry G, Bennett M, Wisman E, Palme K.defines a locus offor root gravitropism control., 1998, 17: 6903–6911.

[12] Friml J, Wisniewska J, Benkova E, Mendgen K, Palme K. Lateral relocation of auxin efflux regulator PIN3 mediates tropism in., 2002, 415: 806–809.

[13] Wang J, Hu H, Wang G, Li J, Chen J, Wu P. Expression ofgenes in rice (L.): tissue specificity and regulation by hormones., 2009, 2: 823–831.

[14] Miyashita Y, Takasugi T, Ito Y. Identification and expression analysis ofgenes in rice., 2010, 178: 424–428.

[15] Li Y, Zhu J, Wu L, Shao Y, Wu Y, Mao C. Functional divergence ofparalogous genes in rice., 2019, 60: 2720–2732.

[16] Chen Y, Fan X, Song W, Zhang Y, Xu G. Over-expression ofleads to increased tiller numbers, angle and shorter plant height through suppression of., 2012, 10: 139–149.

[17] Inahashi H, Shelley I J, Yamauchi T, Nishiuchi S, Takahashi-nosaka M, Matsunami M, Ogawa A, Noda Y, Inukai Y., which encodes a member of the auxin efflux carrier proteins, is involved in root elongation growth and lateral root formation patterns via the regulation of auxin distribution in rice., 2018, 164: 216–225.

[18] Wu D, Shen H, Yokawa K, Baluska F. Overexpressingenhances aluminium internalization by elevating vesicular trafficking in rice root apex., 2015, 66: 6791–6801.

[19] Wu D, Shen H, Yokawa K, Baluska F. Alleviation of aluminium-induced cell rigidity by overexpression ofin rice roots., 2014, 65: 5305–5315.

[20] Zhang Q, Li J, Zhang W, Yan S, Wang R, Zhao J, Li Y, Qi Z, Sun Z, Zhu Z. The putative auxin efflux carrieris involved in the drought stress response and drought tolerance., 2012, 72: 805–816.

[21] Lu G, Coneva V, Casaretto J A, Ying S, Mahmood K, Liu F, Nambara E, Bi Y M, Rothstein S J.modulates rice () plant architecture and yield by changing auxin homeostasis, transport and distribution., 2015, 83: 913–925.

[22] Hou M, Luo F, Wu D, Zhang X, Lou M, Shen D, Yan M, Mao C, Fan X, Xu G, Zhang Y. OsPIN9, an auxin efflux carrier, is required for the regulation of rice tiller bud outgrowth by ammonium., 2021, 229: 935–949.

[23] 單奇?zhèn)? 高彩霞. 植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進展. 遺傳, 2015, 37: 953–973.

Dan Q W, Gao C X. Research progress of genome editing and derivative technologies in plants.(Beijing), 2015, 37: 953–973 (in Chinese with English abstract).

[24] Liu W, Xie X, Ma X, Li J, Chen J, Liu Y G. DSDecode: a web-based tool for decoding of sequencing chromatograms for genotyping of targeted mutations., 2015, 8: 1431–1433.

[25] 吳世洋, 楊曉祎, 張艷雯, 侯典云, 胥華偉. 利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建水稻突變體. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2021, 54: 3805–3817.

Wu S Y, Yang X Y, Zhang Y W, Hou D Y, Xu H W. Generation ofmutants in rice by CRISPR/Cas9 genome editing technology., 2021, 54: 3805–3817 (in Chinese with English abstract).

[26] Xin Z, Chen J. A high throughput DNA extraction method with high yield and quality., 2012, 8: 26.

[27] Ma X, Chen L, Zhu Q, Chen Y, Liu Y. Rapid decoding of sequence-specific nuclease-induced heterozygous and biallelic mutations by direct sequencing of PCR products., 2015, 8: 1285–1287.

[28] 劉巧泉, 陳秀花, 王興穩(wěn), 彭凌濤, 顧銘洪. 一種快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻中潮霉素抗性的簡易方法. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 2001, 9: 264.

Liu Q Q, Chen X H, Wang X W, Peng L T, Gu M H. A rapid simple method of assaying hygromycin resistance in transgenic rice plants., 2001, 9: 264 (in Chinese with English abstract).

[29] 張洪, 馬駿, 胡國成, 斯華敏, 付亞萍, 戴良英, 孫宗修. 用葉片檢測轉(zhuǎn)基因水稻對潮霉素反應(yīng)的可靠性研究. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2005, 17: 341–345.

Zhang H, Ma J, Hu G C, Si H M, Fu Y P, Dai L Y, Sun Z X. Reliability study on the response ofgene in transgenic rice to hygromycin by leaf assay., 2005, 17: 341–345 (in Chinese with English abstract).

[30] Kumar S, Stecher G, Tamura K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets., 2016, 33: 1870–1874.

[31] Waterhouse A M, Procter J B, Martin D M A, Clamp M, Barton G J. Jalview Version 2: a multiple sequence alignment editor and analysis workbench., 2009, 25: 1189–1191.

[32] Krogh A, Larsson B, von Heijne G, Sonnhammer E L L. Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes., 2001, 305: 567–580.

[33] Madeira F, Park Y M, Lee J, Buso N, Gur T, Madhusoodanan N, Basutkar P, Tivey A R N, Potter S C, Finn R D, Lopez R. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019., 2019, 47: W636–W641.

[34] Iino M, Tarui Y, Uematsu C. Gravitropism of maize and rice coleoptiles: dependence on the stimulation angle., 1996, 19: 1160–1168.

[35] Bennett T, Brochington S F, Rothfels C, Graham S W, Stevenson D, Kutchan T, Rolf M, Thomas P, Wong G K, Leyser O, Glover B J, Harrison C J. Paralogous radiations of PIN proteins with multiple origins of noncanonical PIN structure., 2014, 31: 2042–2060.

[36] Rahman A, Takahashi M, Shibasakei K, Wu S, Inaba T, Tsurumi S, Baskin T I. Gravitropism ofroots requires the polarization of PIN2 toward the root tip in meristematic cortical cells., 2010, 22: 1762–1776.

[37] Zhang J, Zhang H, Li S, Li J, Yan L, Xia L. Increasing yield potential through manipulating of anortholog related to nitrogen use efficiency in wheat by CRISPR/Cas9., 2021, 63: 1649–1663.

[38] Zhang J, Zhang H, Botella J R, Zhu J K. Generation of new glutinous rice by CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of thegene in elite rice varieties., 2018, 60: 369–375.

[39] Wang Y, Liu X, Zheng X, Wang W, Yin X, Liu H, Ma C, Niu X, Zhu J K, Wang F. Creation of aromatic maize by CRISPR/Cas., 2021, 63: 1664–1670.

[40] Zhang L, Wang T, Wang G, Bi A, Wassie M, Xie Y, Cao L, Xu H, Fu J, Chen L, Zhao Y, Hu T. Simultaneous gene editing of three homoeoalleles in self-incompatible allohexaploid grasses., 2021, 63: 1410–1415.

[41] 侯智紅, 吳艷, 程群, 董利東, 蘆思佳, 南海洋, 甘卓然, 劉寶輝. 利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制大豆高油酸突變系. 作物學(xué)報, 2019, 45: 839–847.

Hou Z H, Wu Y, Cheng Q, Dong L D, Lu S J, Nan H Y, Gan Z R, Liu B H. Creation of high oleic acid soybean mutation plants by CRISPR/Cas9., 2019, 45: 839–847 (in Chinese with English abstract).

[42] 張旺, 冼俊霖, 孫超, 王春明, 石麗, 于為常. CRISPR/Cas9編輯花生基因研究. 作物學(xué)報, 2021, 47: 1481–1490.

Zhang W, Xian J L, Sun C, Wang C M, Shi L, Yu W C. Preliminary study of genome editing of peanutgenes by CRISPR/Cas9., 2021, 47: 1481–1490 (in Chinese with English abstract).

[43] 石育欽, 孫夢丹, 陳帆, 成洪濤, 胡學(xué)志, 付麗, 胡瓊, 梅德圣,李超. 通過CRISPR/Cas9技術(shù)突變基因提高甘藍型油菜的抗病性. 作物學(xué)報, 2022, 48: 801–811.

Shi Y Q, Sun M D, Chen F, Cheng H T, Hu X Z, Fu L, Hu Q, Mei D S, Li C. Genome editing ofgene by CRISPR/Cas9 for the improvement of disease resistance inL., 2022, 48: 801–811 (in Chinese with English abstract).

[44] Ma X, Zhang Q, Zhu Q, Liu W, Chen Y, Qiu R, Wang B, Yang Z, Li H, Lin Y, Xie Y, Shen R, Chen S, Wang Z, Chen Y, Guo J, Chen L, Zhao X, Dong Z, Liu Y G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants., 2015, 8: 1274–1284.

[45] Lu Y, Tian Y, Shen R, Yao Q, Wang M, Chen M, Dong J, Zhang T, Li F, Lei M, Zhu J. Targeted, efficient sequence insertion and replacement in rice., 2020, 38: 1402–1407.

[46] Wei C, Wang C, Jia M, Guo H X, Luo P Y, Wang M G, Zhu J K, Zhang H. Efficient generation of homozygous substitutions in rice in one generation utilizing an rABE8e base editor., 2021, 63: 1595–1599.

[47] Niu Q, Wu S, Xie H, Wu Q, Liu P, Xu Y, Lang Z. Efficient A.T to G.C base conversions in dicots using adenine base editors expressed under the tomato EF1alpha promoter., 2021, doi: 10.1111/pbi.13736.

[48] Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi J J, Qiu J, Gao C. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system., 2013, 31: 686–688.

[49] Li J, Norville J E, Aach J, McCormack M, Zhang D, Bush J, Church G M, Sheen J. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing via guide RNA/Cas9., 2013, 31: 688–691.

[50] Xie K, Yang Y. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system., 2013, 6: 1975–1983.

[51] 馬興亮, 劉耀光. 植物CRISPR/Cas9基因組編輯系統(tǒng)與突變分析. 遺傳, 2016, 38: 118–125.

Ma X L, Liu Y G. CRISPR/Cas9-based genome editing systems and the analysis of targeted genome mutations in plants.(Beijing), 2016, 38: 118–125 (in Chinese with English abstract).

[52] Mravec J, Skupa P, Baill Y A, Hoyerova K, Krecek P, Bielach A, Petrasek J, Zhang J, Gaykova V, Stierhof Y D, Dobrev P I, Schwarzerova K, Rolcik J, Seifertova D, Luschnig C, Benkova E, Zazimalova E, Geisler M, Friml J. Subcellular homeostasis of phytohormone auxin is mediated by the ER-localized PIN5 transporter., 2009, 459: 1136–1140.

[53] Fukaki H, Fujisawa H, Tasaka M. How do plant shoots bend up? The initial step to elucidate the molecular mechanisms of shoot gravitropism using., 1996, 109: 129–137.

[54] Chen R, Hilson P, Sedbrook J, Rosen E, Caspar T, Masson P H. Thegene encodes a component of the polar-auxin-transport efflux carrier., 1998, 95: 15112–15117.

[55] Grunewald W, Friml J. The march of the PINs: developmental plasticity by dynamic polar targeting in plant cells., 2010, 29: 2700–2714.

[56] Harrison B R, Masson P H. ARL2, ARG1 and PIN3 define a gravity signal transduction pathway in root statocytes., 2008, 53: 380–392.

[57] Keuskamp D H, Pollmann S, Voesenek L A, Peeters A J, Pierik R. Auxin transport through PIN-FORMED 3 (PIN3) controls shade avoidance and fitness during competition., 2010, 107: 22740–22744.

[58] Wang L, Guo M, Li Y, Ruan W, Mo X, Wu Z, Sturrock C J, Yu H, Lu C, Peng J, Mao C., encoding OsPIN2, is involved in root system architecture in rice., 2018, 69: 385–397.

[59] Farooq M, Jan R, Kim K. Gravistimulation effects onamino acid profile, growth pattern and expression ofgenes., 2020, 10: 17303.

Function analysis ofgene by CRISPR/Cas9

YANG Xiao-Yi1, WANG Hui-Hui1, ZHANG Yan-Wen1, HOU Dian-Yun1, ZHANG Hong-Xiao1, KANG Guo-Zhang2, and XU Hua-Wei1,*

1College of Agriculture, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, Henan, China;2National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, Henan, China

Polar auxin transport (PAT) plays a key role in plant growth and development, and auxin efflux carriers PIN-FORMED (PIN) are the crucial proteins controlling PAT. Although the functions of somegenes have been reported, the function ofgene is still unclear. In this study, the target site was designed at the first exon ofand the recombinant CRISPR/Cas9 vector ofwas constructed. Twenty-four independent transgenic rice lines were obtained by transformation using Nipponbare (L.ssp.) as the materials. PCR product sequencing indicated that 15 lines were identified as mutants and the corresponding mutation rate was 62.5%, the mutation type were biallelic heterozygous mutations. Three independenthomozygous mutants were further obtained in T1generation lines and named as,, and, respectively. Sequence alignment analysis showed that the three types of mutations resulted in frame-shift mutation and premature translation termination, which were shortened from 398 amino acid (aa) in wild-type (WT) plants to 109 aa, 106 aa and 250 aa, respectively. Transmembrane helices (TMH) indicated that the TMH of these three mutation proteins were disappeared totally. Protein structure demonstrated that the helix of three mutation proteins were obviously reduced than the native OsPIN5c protein. Phenotype structure indicated that, compared to the WT, the shoot height, root length and adventitious root number were significantly decreased inmutants at seedling stage. Tissue-specific analysis showed thatwas highly expressed in roots, andgenes (and),genes (,,, and) were up-regulated significantly inmutants. The gravitropism response ofmutants was partially inhibited. In conclusion, threehomozygous mutants were obtained via CRISPR/Cas9 technology and the function ofwas investigated in this study, providing the potential gene resources for crop genetic improvement by usinggene.

; CRISPR/cas9; gene function; rice

10.3724/SP.J.1006.2023.22002

本研究由河南省自然科學(xué)基金項目(182300410012, 202300410151, 202300410340)和小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室開放課題項目(SKL2021KF03)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Henan Province (182300410012, 202300410151, 202300410340) and the Open Research Fund of National Key Laboratory of Wheat and Maize Crop Science (SKL2021KF03).

胥華偉, E-mail: xhwcyn@163.com

E-mail: 1961827259@qq.com

2022-01-13;

2022-06-07;

2022-07-08.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220707.1446.012.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)