雙水相分離技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)純化的研究進(jìn)展

趙悅彤，尤一，馬小來，段小群*

桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院（桂林 541000）

雙水相分離技術(shù)，是利用聚合物之間或聚合物與鹽之間的不相容性造成的兩水相間物質(zhì)分配系數(shù)差異，而實(shí)現(xiàn)的分離技術(shù)。因其操作簡單、價(jià)格低廉、無污染、易放大等優(yōu)勢，已被廣泛被應(yīng)用于各種生物物質(zhì)分離應(yīng)用中。不同雙水相體系組成可以分離許多不同物質(zhì)，因材料科學(xué)和液體處理等方面的最新研究進(jìn)展，可以給研究人員提供更多思路?；诖?，對雙水相體系的歷史和成相原理及在蛋白純化工藝中的應(yīng)用進(jìn)行概述。

1 介紹

當(dāng)2種不相容的聚合物、1種聚合物和1種鹽在水基溶劑中超過閾值濃度導(dǎo)致液-液分離時(shí)，形成雙水相系統(tǒng)（ATPS），這一現(xiàn)象早在1896年就由荷蘭微生物學(xué)家馬提努斯·拜耶林克發(fā)現(xiàn)。20世紀(jì)50年代，人們開始利用ATPS分離生物物質(zhì)，因各種物質(zhì)在ATPS各區(qū)域（上相、下相、界面）的分配存在不同優(yōu)先性，可利用這一原則分離蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)胞和細(xì)胞碎片[2]*。

雙水相的優(yōu)勢在于蛋白在雙水相體系中不會失活或變性，因?yàn)槠渌终即蟊壤曳蛛x過程溫和，尤其適合用于熱敏蛋白。同時(shí)做到分離、純化兩步驟一步完成。設(shè)備要求低，操作簡單易于放大，可實(shí)現(xiàn)工業(yè)連續(xù)自動操作。但雙水相分離效率不高且易乳化。相組成中的鹽類如硫酸銨含量過高會導(dǎo)致蛋白析出，影響后續(xù)分離。分離后的蛋白質(zhì)溶液含有高分子聚合物和鹽類，需將其去除。

2 雙水相分離技術(shù)應(yīng)用

ATPS被廣泛應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域，除了分離純化蛋白[3]*外，還可用于分離和回收抗體[4]*、病毒樣顆粒[5]*、抗生素[6]*、DNA[7]*、細(xì)胞、胞外小泡[8]*和激素[9]*。ATPS在微流體[10]*、細(xì)胞工程、生物打印和環(huán)境保護(hù)的應(yīng)用方面使用率也逐漸增多。

2.1 傳統(tǒng)雙水相系統(tǒng)

傳統(tǒng)的液-液萃取技術(shù)通常不適用于酶的純化，因?yàn)橛袡C(jī)物的存在會造成酶活性損失[11]*。超濾技術(shù)和硫酸銨沉淀技術(shù)用于蛋白質(zhì)純化的效率比較低，而另一些蛋白純化技術(shù)則程序復(fù)雜而收率偏低[12]*，例如親和色譜、離子交換色譜、疏水色譜柱都是步驟繁瑣、成本昂貴和低收率的純化技術(shù)。而ATPS技術(shù)用于蛋白質(zhì)純化則廉價(jià)而易操作[13]*，也不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)失活。

Ramakrishnan等[14]*采用傳統(tǒng)的聚合物-鹽（PEG/磷酸鹽）ATPS從乳酸細(xì)菌屎腸球菌中提取細(xì)胞內(nèi)脂肪酶，結(jié)合超濾后活性回收率為82.09%，純化系數(shù)為5.99%。王瑩等[15]*采用PEG4000/硫酸銨雙水相體系分離萃取香菇柄水提液中的多糖與蛋白質(zhì)，結(jié)果顯示，在最佳提取條件下，蛋白質(zhì)萃取率達(dá)81.57%。另外Saravana等[16]*使用單步聚乙二醇/檸檬酸三鈉兩相系統(tǒng)中從南美白乳桿菌廢物中提取和純化增殖蛋白。在最佳條件下，最大分配系數(shù)和蛋白質(zhì)收率分別為2.79%和92.37%。

2.2 親和雙水相系統(tǒng)

親和雙水相是在雙水相中引入親和配基利用親和配基與目標(biāo)產(chǎn)物之間的特異性親和作用，有效改善目標(biāo)產(chǎn)物在雙水相中的選擇性分配，從而大幅提高分離過程的效率和分離產(chǎn)品純度的提取方法[17]*。

蔣志國等[18]*利用金屬螯合雙水相親和分配技術(shù)萃取木瓜蛋白酶。在PEG/PEG-IDA-Cu2+*/Na2SO4雙水相體系中，最優(yōu)條件下木瓜蛋白酶的酶活性回收率可達(dá)90%左右，蛋白分配比達(dá)5.11。Liu等[19]*構(gòu)建一種由混合膠束組成的新型親和力ATPMS，結(jié)果表明基于親和力的HM-EO/TX-Cu（II）體系具有較高的分配性能，有望有效分離組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。

2.3 離子液體雙水相系統(tǒng)

2002年Dupont等[20]*在合成離子液體1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4mim][BF4]）時(shí)發(fā)現(xiàn)KCl和（[C4mim][BF4]）之間存在鹽析效應(yīng)，有學(xué)者對這種鹽析效應(yīng)做了進(jìn)一步研究，并提出“離子液體雙水相”這一新概念，由此開始離子液體雙水相體系的研究。離子液體雙水相是基于高聚物雙水相發(fā)展而來的一種高效溫和萃取分離體系，用親水性的離子液體（ILs）與無機(jī)鹽的水溶液進(jìn)行混合，形成互不相溶的兩相。離子液體可以替代一些有毒揮發(fā)性有機(jī)化合物且陰陽離子之間的可調(diào)節(jié)性、良好的熱穩(wěn)定和化學(xué)穩(wěn)定性使得離子液體雙水相得到更多的應(yīng)用[21-22]*。

施婭楠等[23]*采用[C4mim]Br/K2HPO4雙水相抽提技術(shù)從辣木葉蛋白中分離凝乳酶，最佳萃取條件下木葉凝乳酶的酶活性回收率達(dá)85.5%，純化因子達(dá)1.49。與已報(bào)道用的鹽析法相比分離效果好且步驟簡單，降低酶活性損失。李夢瑤等[24]*基于[C4mim]Cl/K2HPO4雙水相體系，萃取分離番茄中5種抗氧化酶（CAT、POD、SOD、AAO、PPO）。建立的新方法比已報(bào)道的采用緩沖溶法提取的5種抗氧化酶活性高、穩(wěn)定性好，且萃取時(shí)間由原來的30 min縮短至20 min。

2.4 雙水相逆流色譜

固體分離介質(zhì)可能引起酶不可逆吸附、失活和變性等問題。雙水相體系逆流色譜技術(shù)結(jié)合逆流色譜的快速高效、制備量大及雙水相體系簡單溫和、無污染的特點(diǎn)避免這些問題的發(fā)生，因此在蛋白質(zhì)的分離方面有很好的應(yīng)用潛力[25]*。

Wade等[26]*使用高濃度磷酸鉀和聚乙二醇雙相水性兩相系統(tǒng)聯(lián)用逆流色譜（CCC）裝置，直接在ATPS中提取初始粗植物提取物并只在下相注入使之能高度選擇性地分配黑芥子酶復(fù)合體，然后在螺旋圓盤CCC上進(jìn)行短層析。最佳結(jié)果和從其他植物蛋白中分離出的黑芥子酶相比純化倍數(shù)提高60倍。

2.5 雙水相與其他方法的聯(lián)用

雙水相又可以與其他方法聯(lián)用達(dá)到更好的純化效果和工作效率，如超聲輔助雙水相[27]*、超聲高效、節(jié)能常用于生物活性物質(zhì)提取[28]*。超聲波有富集效應(yīng)，可縮短有機(jī)相和水相的相分離時(shí)間，且隨超聲時(shí)間增加溫度升高可以提高物質(zhì)溶解度。微波輔助雙水相法的優(yōu)勢是微波可以穿透式加熱，利用熱效應(yīng)促進(jìn)蛋白溶出，縮短提取時(shí)間，有研究顯示使用微波輔助雙水相應(yīng)用于提取酚類[29]*、多糖等，也能應(yīng)用于蛋白的純化工作。超聲輔助離子液體雙水相法則利用了離子液體良好的溶解能力和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。反萃取后的離子液體水溶液還可以作為提取溶劑循環(huán)使用，降低成本[30]*。

3 結(jié)語與展望

ATPS已實(shí)現(xiàn)簡單、經(jīng)濟(jì)高效的目標(biāo)。利用形成ATPS的聚合物的低界面張力、分配效應(yīng)和高度的生物相容性等特性來達(dá)到分離目的。溫和易放大的優(yōu)勢使更多人使用這種純化方法，不過影響成相的因素也有很多，如pH、溫度、聚合物或鹽濃度、目的蛋白特性等會給實(shí)驗(yàn)探索造成困難。不過雙水相帶來的優(yōu)勢遠(yuǎn)超于其劣勢。雙水相還被用于金屬離子分離、環(huán)境修復(fù)、冶金應(yīng)用等方面，希望日后雙水相的更多特性可以被探索，以便研究人員應(yīng)用于新的領(lǐng)域。