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    穇子多酚的分離純化及其抗氧化能力研究

    2023-02-10 10:25:10黃月向海芹王雙輝龔意輝陳致印
    食品工業(yè) 2023年1期
    關鍵詞:提液大孔清除率

    黃月 ,向海芹,王雙輝,龔意輝,陳致印*

    1. 湖南人文科技學院農業(yè)與生物技術學院(婁底 417000);2. 海南大學食品科學與工程學院(???570228)

    穇子為一年生禾本科穇屬草本植物,又名龍爪稷、雞爪谷、龍爪粟等,廣泛分布于熱帶地區(qū),我國長江以南及西藏、安徽、河南、湖南、廣西等地均有種植[1-2]*。穇子的種子為球形,表面具有一層難以去除的種皮,其棕色穇子皮含有較高的多酚類物質(其中苯甲酸衍生物約占85%),使穇子具有抗糖尿病、抗動脈粥樣硬化及抗腫瘤等諸多功能[3-7]*。多酚是具有苯環(huán)并結合多個羥基化學結構的化合物總稱,常以酚酸類、黃酮類、單寧類和花色苷類化合物形式存在,具有很強的抗氧化作用,是一類值得開發(fā)的天然抗氧化劑[8-9]。

    穇子多酚作為穇子的重要功能成分,許多研究表明[10-13]*,穇子多酚具有較強的體外抗氧化能力和抗菌活性,可有效延緩花生油的氧化作用和龍眼的采后生理活動,對金黃色葡萄球菌等食源性微生物具有抗菌作用。穇子多酚的提取是其應用的前提,王雙輝等[10]*采用超聲波輔助雙水相法提取穇子多酚,得率是3.191 5 mg/g。王樂等[14]*發(fā)現穇子多酚共有11種酚類物質且不同溶劑提取的組分不盡相同。然而,關于穇子多酚純化方面的研究鮮有報道。大孔樹脂作為一種天然的聚合物吸附劑,具有較高的孔隙率、良好的穩(wěn)定性、較好的選擇性等特點,常被用于天然活性成分的分離純化。

    試驗以穇子為原料,采用乙醇輔助生物酶法提取穇子多酚,并用A-21型大孔樹脂對粗提液進行純化,以抗壞血酸為陽性對照,測定穇子多酚粗提液、穇子多酚純化組分抗氧化能力大小,為進一步探究穇子多酚的生物活性提供基礎。

    1 材料與儀器

    1.1 試驗材料與試劑

    穇子(湖南省新化縣湖南隆慶農業(yè)開發(fā)有限公司);抗壞血酸標準品(HPLC>98%)、沒食子酸標準品(HPLC>98%):北京索萊寶科技有限公司;果膠酶(30 000 U/g)、纖維素酶(50 U/mg)、乙醇(分析純)、大孔樹脂(A-21)、無水三氯化鐵(AR)、石油醚(60~90 ℃,分析純)、無水碳酸鈉(AR)、二水合磷酸二氫鈉(AR)、無水磷酸氫二鈉(AR)、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵(AR)、三氯乙酸(AR):上海麥克林生化科技有限公司;福林-酚試劑(SL9010)、水楊酸、三羥甲基氨基甲烷、鄰苯三酚:北京酷來博科技有限公司;1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):奧默生物技術(上海)有限公司;氯化氫、過氧化氫、硫酸(均為分析純,湖南匯虹試劑有限公司)。

    1.2 試驗儀器與設備

    電子天平(FA2004型,上海良平儀器儀表有限公司);紫外分光光度計(754型,上海舜宇恒平科學儀器有限公司);超聲波清洗器(KQ5200DB型,昆山市超聲儀器有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(101型,北京中興偉業(yè)儀器有限公司);真空干燥箱(DZF-6050型,鞏義市予華儀器有限責任公司);數顯恒溫水浴鍋(HH-8型,江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司);旋轉蒸發(fā)器(RE-52C型,鞏義市予華儀器有限責任公司);循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ型,鞏義市予華儀器有限責任公司);離心機(TD5Z型,湖南凱達科學儀器有限公司);萬能高速粉碎機(DE-500 g,浙江紅景天工貿有限公司)。

    1.3 試驗方法

    1.3.1 穇子多酚的粗提

    新鮮穇子粉碎過0.425 mm孔徑(40目)篩后脫脂,取脫脂穇子粉末于錐形瓶中,按料液比1∶10(g/mL)加入酶液(酶濃度1%,W纖維素酶∶W果膠酶=7∶3),在60 ℃恒溫水浴酶解2 h,后用4 000 r/min離心15 min,得第1份上清液,用適量的70%乙醇溶液洗滌濾渣,在同樣條件下離心得第2份上清液,將2次上清液合并后于45 ℃旋蒸,去除有機溶劑后得粗提液[15]*。

    1.3.2 穇子多酚的純化

    大孔樹脂預處理:將大孔樹脂置于燒杯中,加入無水乙醇蓋過大孔樹脂,攪拌排出氣泡,靜置24 h后用蒸餾水潤洗至無乙醇味即可,剩余大孔樹脂浸泡在無水乙醇中,在4~9 ℃冰箱中保存,備用[16]*。

    參照曹雪文[17]*的方法,稍作修改。稱取20.0 g預處理好的大孔樹脂濕法裝柱,連續(xù)加入去離子水,使大孔樹脂在柱內均勻充分緊實,將25 mL穇子多酚粗提液緩慢加入層析柱中,控制流速1 滴/s,收集流出液并測定其多酚濃度,用50 mL去離子水、乙醇(質量分數20%~95%)進行梯度洗脫,同樣控制流速在1 滴/s,用試管定量收集洗脫液,每管5 mL,共收集50管,待測,繪制洗脫曲線。

    1.3.3 多酚含量的測定

    參照王樂等[14]*的方法,稍加修改。分別取1 mL水和沒食子酸標準液(10,20,30,40和50 μg/mL)于具塞試管,加入1 mL福林酚試劑,搖勻靜置5 min,加入4 mL質量分數10%的碳酸鈉溶液,于25 ℃水浴加熱反應1 h后,在波長760 nm處測定吸光度,以吸光度為縱坐標,沒食子酸濃度為橫坐標,繪制沒食子酸標準曲線圖。

    取1 mL待測樣品液于具塞試管中,加入1 mL福林酚試劑,后續(xù)同上。

    1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

    在楊立鳳等[18]*的方法上進行一定調整。精密稱取10 mg DPPH,用乙醇溶液溶解,定容到50 mL,制成質量濃度0.2 mg/mL的工作液,于4 ℃避光保存。分別吸取2 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于具塞試管中,加入2 mL DPPH溶液,渦旋振蕩搖勻,避光反應30 min后,在517 nm處測定吸光度,所有試驗重復3次,下同。清除率計算如式(1)所示。

    式中:A1為樣品測定的吸光度;A2為無水乙醇代替樣品的吸光度。

    1.3.5 羥基自由基(·OH)清除能力的測定

    在閆旭宇等[19]*的方法上稍作修改。分別精確移取2 mL穇子多酚粗提溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于試管中,加入濃度同樣為6 mmol/L的FeSO4溶液、水楊酸和過氧化氫溶液,各2 mL,于37 ℃水浴加熱反應20 min后,在波長510 nm處測定吸光度A1。根據式(2)計算清除率。

    式中:A1為樣品測定的吸光度;A2為蒸餾水代替過氧化氫溶液的吸光度;A3為蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

    1.3.6 超氧根(O2-*)清除能力的測定

    參照Chen等[20]*的方法,稍加修改。分別取0.2 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于試管中,加入5.7 mL Tris-HCl緩沖液(0.05 mol/L,pH 8.20)和0.1 mL鄰苯三酚溶液(6 mmol/L),混勻后在室溫反應6 min,加入0.1 mol/L的HCl溶液終止反應,在320 nm處測定吸光度A1。清除率計算同式(1)。

    1.3.7 Fe3+*還原能力的測定

    參照胡棟寶等[21]*的方法并稍加完善。分別取0.5 mL穇子多酚粗提液、穇子多酚純化組分、VC溶液于具塞試管中,分別加入2.0 mL pH 6.6磷酸緩沖溶液和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液,在50 ℃水浴中加熱20 min,加入2.0 mL 10%三氯乙酸溶液和0.5 mL 0.1%氯化鐵溶液,避光靜置6 min后,在700 nm處測定吸光度。

    1.3.8 ABTS+*自由基清除能力

    參照Shen等[22]*的方法,加以修改。取7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L過硫酸鉀溶液,各100 mL,混勻,避光反應12~16 h得ABTS母液。取ABTS母液,用蒸餾水稀釋,使其在734 nm處吸光度為0.70±0.02,生成ABTS工作液。分別取1 mL穇子多酚粗提取溶液、穇子多酚純化液、VC溶液于試管中,加入4 mL ABTS工作液,避光反應6 min,于734 nm測定其吸光度A1。清除率計算同式(2)。

    1.3.9 數據處理與分析

    試驗數據均采用Excel整理,使用GraphPad prism 6進行繪圖和方差分析,進行Multiple comparisons和t檢驗,分析差異的統(tǒng)計顯著性,P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

    2 結果與分析

    2.1 沒食子酸標準曲線

    根據1.3的方法,繪制沒食子酸標準曲線,見圖1。沒食子酸的回歸方程為y=0.011 62x-0.018 6,R2*=0.997 2,表明其能夠較好地擬合穇子多酚含量的計算。

    圖1 沒食子酸標準曲線

    2.2 柱層析分析

    穇子多酚粗提液洗脫曲線如圖2所示。穇子多酚粗提液經去離子水、乙醇(質量分數20%~95%)梯度洗脫后得到3個組分FMP-1、FMP-2和FMP-3(圖中按出峰順序依次命名),其中:FMP-2的出峰時間雖然較晚,但峰面積大,說明該組分多酚含量較高,純化效果較好;FMP-1和FMP-3這2個組分的出峰所需時間較長,且峰面積小,說明多酚含量低,因此后續(xù)不對其進行分析。同時,經過圖1回歸方程得出,粗提液穇子多酚濃度為113.22 μg/mL,經過柱層析后,純化組分為220.30 μg/mL。

    圖2 穇子多酚柱層析洗脫曲線

    2.3 DPPH自由基清除能力

    穇子多酚粗提液、穇子多酚純化液FMP-2及VC溶液的DPPH自由基清除能力如圖3所示。在20~100 μg/mL濃度范圍內,三者的清除效果均在70%~72%之間,并與濃度呈正相關。VC溶液的DPPH自由基清除效果優(yōu)于穇子多酚純化液FMP-2及粗提液,且隨著濃度的增加,穇子多酚FMP-2的清除率逐漸上升,并接近于VC溶液,不存在顯著性差異,但與粗提液之間在各濃度都存在顯著差異(P<0.05)。這與胡會剛等[23]*研究發(fā)現菠蘿皮渣多酚經純化后的DPPH抗氧化活性明顯提高相一致,這可能是由于較高純度的FMP-2結構比粗提物更容易與DPPH自由基匹配。

    圖3 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對DPPH自由基的清除效果

    2.4 羥基自由基(·OH)清除能力

    穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對·OH自由基清除能力如圖4所示。濃度在20~100 mg/mL時,隨著濃度的上升,穇子多酚純化液FMP-2和粗提液清除·OH自由基的效率明顯上升,且兩者之間存在顯著差異(P<0.05),穇子多酚純化組分FMP-2與VC溶液的清除效果相當,都明顯高于粗提液,該結果與穇子多酚抗氧化活性的研究[10-11]*結論基本一致。這可能是由于FMP-2和VC轉移氫給自由基的效率相差不大,而粗提液含有較多雜質成分,導致其清除效果不如FMP-2和VC。

    圖4 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對·OH自由基清除能力

    2.5 超氧根(O2-*)清除能力

    超氧根清除率如圖5所示。穇子多酚純化液FMP-2隨著濃度的上升,其清除超氧根(O2-*)的效率相差不大,基本恒定在80%左右,與VC效果相當,而粗提液隨著濃度的上升,清除效率大幅上升,濃度由20 mg/mL上升到100 mg/mL時,清除率從20%多陡增至60%以上。這可能是由于粗提液中含有其他成分,對超氧根清除率存在影響。

    圖5 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對超氧根(O2-*)的清除效果

    2.6 Fe3+*還原能力

    FRAP鐵離子還原法常用于測定物質的總抗氧化活性,其原理是測定物質將Fe3+*還原成Fe2+*的能力,以此來反映物質的抗氧化活性[24]*。由圖6可知,穇子多酚粗提液、穇子多酚純化液FMP-2及VC溶液對Fe3+*還原能力都與濃度呈正相關。溶液濃度從20 μg/mL上升至100 μg/mL時,穇子多酚純化液FMP-2的吸光度增大最多,從0.400增大到1.017,而粗提液的吸光度增長不大,VC也呈現階段性增長,且三者之間兩兩都具有顯著性差異(P<0.05),可能的原因是穇子多酚經純化后去除了大部分雜質,對鐵離子的清除作用明顯增強,而粗提液中雜質太多,對Fe3+*還原存在一定影響,導致還原能力并無大幅變化。

    圖6 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對Fe3+*的還原能力

    2.7 ABTS自由基清除能力

    ABTS自由基的苯并噻唑結構具有兩親性,故ABTS自由基的消除可通過轉移氫或轉移電子實現[25]*。穇子多酚粗提液、穇子多酚純化液FMP-2及VC溶液對ABTS自由基的清除能力如圖7所示。濃度在80%以下時,VC對ABTS自由基的清除率不足4%,遠低于穇子多酚的清除率。穇子多酚粗提液在不同濃度下對ABTS自由基的清除率都在80%以上,且變化不大,但與穇子多酚純化液FMP-2之間存在顯著差異(P<0.05)。穇子多酚純化液FMP-2隨著濃度的上升,其清除率也成倍增加,從6%增加到50%以上。穇子多酚粗提液遠高于穇子多酚純化液,可能是粗提液中還有其他成分,更容易與ABTS自由基結合[25]*。特別注意的是,VC濃度80 μg/mL時,其清除率不到2%,濃度100 μg/mL時,清除率升至99.88%,這可能是由于低濃度的VC溶液對ABTS自由基的清除效果極其微弱,而到一定濃度時就會表現出較強的清除效果[26]*。

    圖7 穇子多酚粗提液、純化液及VC溶液對ABTS自由基的效果

    3 結論

    以乙醇輔助生物酶法提取穇子多酚,采用A-21型大孔樹脂對多酚粗提液進行純化,純化后穇子多酚含量由113.22 μg/mL提升至220.30 μg/mL,王雙輝等[10]*采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取穇子多酚,得率為3.191 5 mg/g。王樂等[14]*采用酸性乙醇浸提法提取穇子多酚,得率為118.91 mg/mL。試驗多酚得率比這2個結果都低,這可能是由于提取方法不同所導致。

    經過純化后的穇子多酚純化液,對DPPH自由基清除能力、羥基自由基(·OH)清除能力、超氧根(O2-*)清除能力、Fe3+*還原能力較粗提液有明顯的提升。這可能是由于粗提液經純化后,去除大部分雜質所導致。對于穇子多酚純化液的純度、組分、結構及性質,需通過進一步研究分析,才能闡述其作用機理。

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