超聲波-微波耦合提取黃粉蟲蛋白的工藝

遲曉君，吳凡，張大鵬，孫文君，周家楊，秦洋*

1. 山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院（濟南 250100）；2. 山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院林業(yè)工程學(xué)院（濟南 250100）；3. 青島吉茂源農(nóng)業(yè)科技有限公司（青島 266000）

黃粉蟲（Tenebrio molitorL）又名黃粉甲，俗稱面包蟲，隸屬昆蟲綱（Insect）、鞘翅目（Coleopter）、擬步甲科（Tenebrionide）、粉甲屬（Tenebrionini）[1]*。黃粉蟲原產(chǎn)于南美洲，其營養(yǎng)成分豐富，營養(yǎng)含量居各類活體動物蛋白飼料之首，被譽為“蛋白質(zhì)飼料寶庫”“動物的營養(yǎng)寶庫”[1]*。黃粉蟲粗蛋白含量可達60%以上，氨基酸種類齊全（共18種），包含人體所需的18種必需氨基酸及組氨酸[2-3]*，其必需氨基酸含量占氨基酸總量的39.14%，基本滿足FAO/WHO建議的優(yōu)良蛋白質(zhì)必需氨基酸應(yīng)占氨基酸總量40%的標準[4]*。黃粉蟲在20世紀50年代由前蘇聯(lián)傳入我國[5]*。國內(nèi)專家學(xué)者于1963年開始對黃粉蟲進行研究與描述，為其分類鑒定提供依據(jù)[6]*。在我國，黃粉蟲的應(yīng)用主要作為活體蛋白飼料[7]*，初步轉(zhuǎn)型向著精深加工和開發(fā)高新技術(shù)系列產(chǎn)品的方向發(fā)展[8]*。

蛋白質(zhì)資源短缺成為當今世界存在的四大危機之一[9]*。根據(jù)權(quán)威公布的數(shù)據(jù)，世界上缺乏蛋白質(zhì)的人口約占全球總?cè)丝诘?/5[10]*。昆蟲作為地球上最大的尚未被徹底開發(fā)的生物資源寶庫，受到人類青睞。根據(jù)營養(yǎng)學(xué)家分析報告，大多數(shù)可食用昆蟲種類的蛋白質(zhì)含量很高，纖維少，微量元素的種類和含量豐富，易于吸收，尤其是促進人體生長發(fā)育的必需氨基酸的含量最多[11-12]*，營養(yǎng)價值極高，且所含脂肪酸多為軟脂酸和不飽和脂肪酸[13]*，消化性能好，極富有開發(fā)潛力[14]*。隨著全球蛋白資源危機日趨嚴峻，對于新型蛋白質(zhì)資源的需求十分迫切[15]*。黃粉蟲作為一種亟待開發(fā)的“未來食物”，極其適合深度加工成為補充蛋白質(zhì)的特殊醫(yī)用食品蛋白質(zhì)組件[16]*，其中豐富的動物蛋白相比于植物蛋白更有利于人體吸收利用，相比于乳清蛋白造價成本更低[17]*，黃粉蟲蛋白質(zhì)的綠色高效提取技術(shù)亟待研究[18]*。

超聲波-微波耦合提取技術(shù)作為一種高效、綠色的提取方法[19]*，綜合超聲波提取和微波提取兩種方法的熱效應(yīng)、空化效應(yīng)、機械效應(yīng)、電效應(yīng)、磁效應(yīng)及化學(xué)效應(yīng)的優(yōu)勢，極大縮短物質(zhì)提取時間，提高提取效率，因此被廣泛應(yīng)用在生理活性物質(zhì)提取方面[20]*。物料粉碎時會增加細胞的破壁率，使物料中的活性成分直接暴露出來，不再需要通過細胞壁或細胞膜才能提取，粉碎程度對蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)的提取率有著重要影響，將物料粉碎之后采用超聲波-微波耦合提取技術(shù)處理黃粉蟲，可極大程度地提高蛋白質(zhì)提取率[21]*。因此，試驗依托超聲波-微波耦合技術(shù)實現(xiàn)黃粉蟲的精深加工，為黃粉蟲精深加工及黃粉蟲蛋白粉產(chǎn)品的推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲（河北省保定市順平縣宏基蟲業(yè)）；磷酸氫二鈉、一水合檸檬酸、鹽酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、氫氧化鈉、95%乙醇、無水碳酸鈉（分析純，濟寧宏偉化工有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

ZYJ-709全自動液壓榨油機（十八油坊）；WZJ-6J振動式藥物超微粉碎機（濟南倍力粉技術(shù)工程有限公司）；XO-SM200超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)（南京先歐儀器制造有限公司）；TGL-20M醫(yī)用離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；LGJ-25E冷凍干燥機（四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展有限公司）；BCE224-1CCN電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；-40 ℃速凍冰柜（廣州傲雪制冷設(shè)備有限公司）；KH-6HMTN型微波干燥設(shè)備（山東科弘微波能有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃粉蟲蛋白質(zhì)提取工藝

參考楊田[22]*的蛋白質(zhì)提取方法[pH 7.0、料液比（脫脂蟲粉∶Na2HPO4-檸檬酸緩沖液）1∶8 g/mL]，并稍加修改。將黃粉蟲經(jīng)過清洗去雜、滅菌等處理后，進行微波干燥，機械壓榨脫脂后超細粉碎，過篩得到一定粒徑的脫脂蟲粉；試驗時稱取一定量的脫脂蟲粉，按照料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0條件，設(shè)置微波提取溫度、提取時間、超聲功率、超聲時間提取黃粉蟲蛋白質(zhì)。提取結(jié)束后，加酸調(diào)節(jié)至一定pH，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min條件下離心10 min取沉淀，冷凍干燥得到黃粉蟲蛋白質(zhì)粉。

1.3.2 原料粒徑的確定

將壓榨脫脂后的黃粉蟲進行超細粉碎，分別粉碎40，60和100 s，過篩確定178，150和74 μm的脫脂蟲粉。在確定的料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、微波提取溫度40 ℃、提取時間15 min、超聲功率300 W、超聲時間3 min條件下提取蛋白質(zhì)，考察原料粒徑對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.3 提取時間的確定

在確定的料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、原料粒徑150 μm、微波提取溫度40 ℃、超聲功率300 W、超聲時間3 min條件下，設(shè)置提取時間5，15，3，45和60 min，提取蛋白質(zhì)，考察時間對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.4 超聲時間的確定

在確定的料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、原料粒徑150 μm、提取時間15 min、微波提取溫度40 ℃、超聲功率300 W條件下，分別設(shè)置1，3，5，7和9 min這5個梯度超聲時間，考察超聲時間對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.5 超聲功率的確定

在確定的料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、原料粒徑150 μm、提取時間15 min、微波提取溫度40 ℃、超聲時間3 min條件下，在超聲功率100，200，300，400和500 W時提取蛋白質(zhì)，考察超聲波功率對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.6 微波提取溫度的確定

在確定的料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、原料粒徑150 μm、提取時間15 min、超聲時間3 min、超聲功率400 W條件下，在提取溫度20，30，40，50和60 ℃時提取蛋白質(zhì)，考察溫度對蛋白質(zhì)提取率的影響。

1.3.7 蛋白質(zhì)含量測定

根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》，采用凱氏定氮法對制得的蛋白粉進行含量測定。蛋白質(zhì)含量按式（1）計算。

式中：X為試樣中蛋白質(zhì)含量，g/100 g；V1為試液消耗的鹽酸標準滴定液，mL；V2為試劑空白消耗的鹽酸標準滴定液，mL；c為鹽酸標準滴定液濃度，mol/L；m為試樣的質(zhì)量，g；V3為吸取消化液體積，mL；F為氮轉(zhuǎn)換系數(shù)，取6.25。

1.3.8 蛋白質(zhì)提取率的測定

采用楊田[22]*的方法進行黃粉蟲蛋白質(zhì)提取率的測定，蛋白質(zhì)提取率按式（2）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel、Origin 2018、SPSS等軟件以進行數(shù)據(jù)分析及圖表處理。試驗數(shù)據(jù)取3次平均值，當P＜0.05時認為平均值之間存在統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 原料粒徑對蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

如圖1所示，在料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、微波提取溫度40 ℃、提取時間15 min、超聲時間3 min、超聲功率300 W條件下，隨著原料粒徑的減小，蛋白質(zhì)的提取率和純度出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，黃粉蟲粉碎粒度150 μm時蛋白質(zhì)的提取率和純度最佳。在粒徑達到74 μm時，提取率和純度下降，分析原因主要有：一是在長時間粉碎過程中，蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，并且在超聲波-微波耦合提取的過程中，超聲波的“聲空化”作用使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生更加嚴重的裂解或重構(gòu)[23]*，如此嚴重的變性使得蛋白質(zhì)的等電點發(fā)生變化，所以提取率和純度降低[24]*；二是隨著原料粒徑的減小，比表面積增大，有助于蛋白質(zhì)的提取，但當原料粒徑減小到一定程度，比表面積增加到一定值，液體的表面張力作用會阻止溶劑進入細胞，導(dǎo)致提取率和純度下降；三是隨著粒徑的減小、比表面積的增大，微粒的毛細作用和納米效應(yīng)阻礙蛋白質(zhì)的溶出；四是粒度越小，比表面積越大，表面所帶電荷越多，微粒之間相互吸附[25]*，阻礙蛋白質(zhì)的溶出。

圖1 原料粒徑對提取率和純度的影響

2.1.2 提取時間對蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

如圖2所示，在原料粒徑150 μm、料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、微波提取溫度40 ℃、超聲功率300 W、超聲時間3 min的條件下，提取時間在15 min時提取率和純度最佳。提取時間5和15 min，15和30 min之間有顯著性差異，而在30 min之后蛋白質(zhì)的提取率和純度趨于平緩，說明在15 min時蛋白質(zhì)的沉淀量已達到最大。而在提取時間60 min時，蛋白質(zhì)的純度和提取率略微下降，猜測可能是在長時間的超聲波-微波耦合提取條件下，蛋白質(zhì)發(fā)生水解形成多肽或氨基酸，或者發(fā)生變性，導(dǎo)致水溶性增加或者是等電點改變，導(dǎo)致提取率和純度下降。因此，選取10，15和30 min這3個水平進行正交試驗。

圖2 提取時間對提取率和純度的影響

2.1.3 超聲時間對蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

如圖3所示，在原料粒徑150 μm、料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、微波提取溫度40 ℃、超聲功率300 W、提取時間15 min條件下，隨著超聲時間的延長，提取率和純度呈現(xiàn)先上升再下降過程。超聲時間過短，提取程度不夠，使得蛋白質(zhì)提取不完全，提取率和純度稍低，超聲時間3 min時，提取率和純度最高，繼續(xù)延長超聲時間，提取率和純度降低并趨于平緩。產(chǎn)生此變化的原因可能是長時間超聲波處理的空化效應(yīng)、機械效應(yīng)等使蛋白質(zhì)肽鍵斷裂、氨基酸側(cè)鏈發(fā)生變性，或與其他分子的縮合發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化[26]*，導(dǎo)致提取率和純度降低。因此，選取1，3和5 min這3個水平進行正交試驗。

圖3 超聲時間對提取率和純度的影響

2.1.4 超聲功率對蛋白質(zhì)的提取率和純度的影響

如圖4所示，在原料粒度150 μm、料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、微波提取溫度40 ℃、提取時間15 min、超聲時間3 min條件下，隨著超聲波功率的不斷增加，提取率和純度呈現(xiàn)上升趨勢。超聲功率由100 W上升至300 W時，提取率和純度逐漸上升，原因是功率增大，空化效應(yīng)增強，蛋白質(zhì)溶出增加，但變化幅度較小，沒有顯著性差異性。功率達到400 W時，提取率和純度均達到峰值，且具有差異性。超聲功率達到500 W時，提取率和純度下降，分析原因可能是高功率超聲波的“聲空化”作用使蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)發(fā)生嚴重的裂解或重構(gòu)[27]*，使空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，等電點發(fā)生變化，提取率和純度降低。因此，選取300，400和500 W這3個水平進行正交試驗。

圖4 超聲功率對提取率和純度的影響

2.1.5 微波提取溫度對蛋白質(zhì)提取率和純度的影響

如圖5所示，在原料粒度150 μm、料液比1∶8（g/mL）、pH 7.0、提取時間15 min、超聲時間3 min、超聲功率400 W條件下，溫度低于40 ℃時，隨著提取溫度的升高，蛋白質(zhì)的提取率和純度均逐漸上升，這是因為溫度升高，分子運動加快，蛋白質(zhì)分子容易從脫脂粉中分離出來。提取溫度達到40 ℃時，蛋白質(zhì)的提取率和純度達到最大值，且具有顯著性差異，繼續(xù)升高溫度，蛋白質(zhì)會形成凝膠，提取液黏度增大，蛋白質(zhì)分離難度增加[28]*，蛋白質(zhì)提取率和純度無顯著性提高的趨勢，因此，選定40 ℃作為最佳的微波提取溫度。因此，選取30，40和50 ℃這3個水平進行正交試驗。

圖5 微波提取溫度對提取率和純度的影響

2.2 正交試驗結(jié)果與分析

根據(jù)試驗實際操作過程及單因素試驗結(jié)果，選取影響較大的提取時間、超聲時間、超聲功率、微波提取溫度4個單因素進行正交試驗。又因提取率是評價蛋白質(zhì)提取工藝的主要指標，故采用L9(34*)正交設(shè)計優(yōu)化黃粉蟲蛋白質(zhì)的提取條件，具體因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表

按照L9(34*)正交表（表1）對黃粉蟲蛋白質(zhì)提取率的影響因素進行正交試驗，試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果

采用直觀分析法對4個因素的極差值進行比較，由結(jié)果可知，影響蛋白質(zhì)提取率的各因素主次是提取時間（A）＞超聲時間（B）＞微波提取溫度（D）＞超聲功率（C）。蛋白質(zhì)提取的最佳工藝組合是A1B3C2D3，由于最佳組合不是正交表中出現(xiàn)的提取率最高組合，因此，需要將該組合與正交表中最優(yōu)組合A1B3C3D3進行驗證性試驗。在進行重復(fù)性試驗后，結(jié)果表明A1B3C2D3組合的平均蛋白質(zhì)提取率為63.23%，A1B3C3D3組合的平均蛋白提取率為59.79%。因此蛋白質(zhì)提取的最佳工藝為A1B3C2D3，即在pH 7.0、料液比1∶8（g/mL）、原料粒度150 μm、提取時間10 min、超聲時間5 min、超聲功率400 W、微波提取溫度50 ℃條件下，蛋白質(zhì)的提取率為63.23%，純度為75.59%。

3 結(jié)論

試驗以黃粉蟲成蟲為原料，采用Na2HPO4-檸檬酸緩沖液作為蛋白質(zhì)提取液提取黃粉蟲蛋白質(zhì)，以蛋白質(zhì)提取率和純度作為評價蛋白質(zhì)提取效果的指標。根據(jù)5次單因素試驗和正交試驗得出蛋白質(zhì)提取的最佳工藝：黃粉蟲脫脂粉150 μm，pH 7.0，料液比1∶8（g/mL），提取時間10 min，超聲時間5 min，超聲功率400 W，微波提取溫度50 ℃。采用冷凍干燥法將蛋白質(zhì)提取液加工成蛋白粉，在此最佳工藝條件下，蛋白質(zhì)的提取率為63.23%，純度為75.59%。在同等試驗條件下復(fù)現(xiàn)楊田[22]*的黃粉蟲蛋白質(zhì)提取工藝，得到蛋白質(zhì)提取率54.61%、純度64.68%。相比較，試驗結(jié)果蛋白質(zhì)提取率及純度均高于楊田[22]*的研究結(jié)果。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過一定程度的粉碎之后，采用超聲波-微波耦合技術(shù)提取黃粉蟲蛋白質(zhì)的工藝可行，且具有更加鮮明的優(yōu)勢。