變?nèi)~榕根總黃酮提取工藝及其抗氧化活性研究

習(xí)丹，陳明，吳文明，張菁華，陳途*

1. 江西省人民醫(yī)院（南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院）藥學(xué)部（南昌 330006）；

2. 咸寧市公共檢驗(yàn)檢測(cè)中心（咸寧 437100）；3. 咸寧市中醫(yī)醫(yī)院（咸寧 437100）

變?nèi)~榕（Ficus variolosa）屬雙子葉植物桑科（Moraceae）榕屬植物，產(chǎn)自我國(guó)浙江、江西、福建、廣東（及沿海島嶼）、廣西、湖南、貴州、云南東南部及南部，常生于溪邊林下潮濕處。越南、老撾也有分布[1]*。據(jù)《浙江植物志》記載，莖清熱利尿，葉敷跌打損傷，根亦入藥，補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，祛風(fēng)濕等功效。從桑科榕屬植物中分離得到的化合物有三萜類化合物、黃酮類化合物、倍半萜、香豆素、生物堿、甾醇等[2]*。對(duì)變?nèi)~榕較為系統(tǒng)的化學(xué)成分研究還不多見。試驗(yàn)采用微波輔助提取，利用高頻電磁波加速細(xì)胞破裂，促進(jìn)黃酮類物質(zhì)溶出，進(jìn)一步優(yōu)化總黃酮提取工藝，并考察其體外抗氧化活性，為變?nèi)~榕總黃酮高效提取及進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

變?nèi)~榕根（采自江西省資溪縣，經(jīng)江西省人民醫(yī)院藥學(xué)部副主任應(yīng)萍鑒定為正品）。蘆丁對(duì)照品（純度＞98%，R189033-5 g，Aladdin）；亞硝酸鈉（S818033-500 g，麥克林）；氫氧化鈉（2110281，西隴科學(xué)）；硝酸鋁（A800886-500 g，麥克林）；2, 2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（d6132-1 g，麥克林）；2, 2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基（D141336-250 mg，Aladdin）；過(guò)二硫酸鉀（2107162，西隴科學(xué)）；鐵氰化鉀（P111564-100 g，Aladdin）；L（+）-抗壞血栓（2110142，西隴科學(xué)）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

NP80 touch型超微量分光光度計(jì)（德國(guó)Implen公司）；CW-2000型超聲微波協(xié)同萃取儀（上海亞榮生化儀器廠）；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；HH·SII-Z-S型電熱恒溫水浴鍋（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；FBC1002型超純水機(jī)（青島富勒姆科技有限公司）；Mettler AE240電子天平（萬(wàn)分之一，美國(guó)梅特勒-托利多儀器公司）；DZF-6050AB真空干燥箱（邦西儀器科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品預(yù)處理

變?nèi)~榕根樣品放入恒溫干燥箱內(nèi)60 ℃烘干至恒重，粉碎，過(guò)0.250 mm孔徑（60目）篩，收集粉末，備用。

1.3.2 總黃酮提取工藝

精密稱取1.00 g供試品粉末于50 mL圓底燒瓶中，分別在不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率、提取時(shí)間和料液比因素的條件下提取，減壓過(guò)濾提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行旋轉(zhuǎn)制成浸膏，按照配比加入乙醇溶解，用離心機(jī)進(jìn)行離心，得到的溶液定容到容量瓶中，再進(jìn)行稀釋，配成待測(cè)溶液，測(cè)定其吸光度，計(jì)算提取率。

1.3.3 總黃酮含有量測(cè)定

1.3.3.1 線性關(guān)系考察[3]*

精密稱取26.47 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，加適量75%乙醇溶解并定容至50 mL，作為儲(chǔ)備液。用移液管精密取0，0.25，0.50，1.00，1.25和1.50 mL儲(chǔ)備液分別置于10 mL量瓶中，加0.4 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，加入0.4 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，加無(wú)水乙醇定容，搖勻放置15 min。在510 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，得方程A=0.008 3X-0.029 2（R2*=0.996 3），在0～79 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3.2 提取率測(cè)定

提取率按式（1）計(jì)算。

1.3.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)[4]*

配制0.1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，于0，2，4，6，8和10 h測(cè)定吸光度，測(cè)得其SRSD為0.192%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.3.4 精密度試驗(yàn)

0.1 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，連續(xù)測(cè)定吸光度6次，測(cè)得其SRSD為0.283%，表明儀器精密度良好。

1.3.3.5 加樣回收率試驗(yàn)

取10 mL 0.053 94 mg/mL提取液，共9份，置于50 mL量瓶中，加入10 mL 0.061，0.053和0.042 mg/mL蘆丁對(duì)照品溶液，共3份，用75%乙醇定容，測(cè)定吸光度，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，3份溶液的回收率分別為99.4%，98.7%和99.8%，SRSD為0.96%。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

以變?nèi)~榕根總黃酮提取率為指標(biāo)，在固定其他試驗(yàn)條件的情況下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波時(shí)間、微波功率、料液比對(duì)變?nèi)~榕根總黃酮提取率的影響。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取液中總黃酮含量，根據(jù)變?nèi)~榕根中總黃酮提取率，考察分析微波萃取中的單個(gè)因素影響。

1.3.4.1 微波功率

固定樣品粉末用量1.0 g、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（g/mL）、微波時(shí)間20 min，選擇微波功率200，300，400，500和600 W，取1 mL，按1.3.3.1的方法稀釋到10 mL，測(cè)定吸光度。

1.3.4.2 微波時(shí)間

固定樣品粉末用量1.0 g、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W，選擇微波時(shí)間5，10，15，20和25 min，取1 mL，按1.3.3.1的方法稀釋到10 mL，測(cè)定吸光度。

1.3.4.3 料液比

固定樣品粉末用量1.0 g、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W、微波時(shí)間20 min，選擇料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50（g/mL），取1 mL，按1.3.3.1的方法稀釋到10 mL，測(cè)定吸光度。

1.3.4.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)

固定樣品粉末用量1.0 g、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W、微波時(shí)間20 min，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，50%，60%，70%和80%，取1 mL，按1.3.3.1的方法稀釋到10 mL，測(cè)定吸光度。

1.3.5 響應(yīng)面法優(yōu)化[5]*

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)4個(gè)單因素條件（乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、微波功率、微波提取時(shí)間）進(jìn)行考察，以總黃酮提取率為響應(yīng)指標(biāo)，應(yīng)用Design-Expert 13.0.1.0軟件，優(yōu)化試驗(yàn)條件。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 藥液配制

將最優(yōu)條件下得到的提取液在50～55 ℃下濃縮至2.01 mg/mL，用75%乙醇依次稀釋至5.00，10.00，15.00，20.00和25.00 μg/mL，并配制相同質(zhì)量濃度維生素C、蘆丁溶液作為對(duì)照，冷藏備用。

1.3.6.2 對(duì)DPPH·的清除能力

參照Yu等[6]*報(bào)道的方法，略有改動(dòng)。精密吸取100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（6.25，12.5，25，50和100 μg/mL），加入100 μL的100 μg/mL DPPH溶液，充分混勻后，避光，于37 ℃反應(yīng)30 min，于酶標(biāo)儀在517 nm處測(cè)定吸光度As。同時(shí)設(shè)定溶劑空白組（An，DPPH溶液用等體積甲醇代替）和樣品空白組（A0，樣品溶液用等體積甲醇代替）。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次。按式（2）計(jì)算各組分對(duì)DPPH·清除率，并依此計(jì)算IC50值。

1.3.6.3 對(duì)ABTS+*·的清除能力[7]*

參照王榮等[7]*報(bào)道的方法。避光稱取15 mg ABTS自由基粉末，加4 mL超純水溶解，得7.0 mmol/L的ABTS水溶液。稱取5 mg K2S2O8加7.5 mL超純水溶解，將以上2種溶液按體積比1∶1等量混合，制備ABTS+*·母液，置于4 ℃冰箱保存10～12 h，備用。使用時(shí)，用無(wú)水乙醇稀釋至吸光度在0.7±0.02范圍內(nèi)即可。將各組分的母液用無(wú)水乙醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（6.25，12.50，25.00，50.00和100.00 μg/mL）。以100 μL各組分樣品溶液和100 μL ABTS+*·水溶液為試驗(yàn)組，對(duì)照組為100 μL無(wú)水乙醇代替ABTS+*·水溶液，以加入100 μL ABTS+*·水溶液和100 μL無(wú)水乙醇為標(biāo)準(zhǔn)組，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在734 nm下測(cè)定吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。按式（2）計(jì)算ABTS+*·清除率，計(jì)算IC50值。

1.3.6.4 對(duì) Fe3+*還原能力

參照Mazor等[8]*與朱偉等[9]*報(bào)道的方法，取0.8 mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液（6.25，12.50，25.00，50.00和100.00 μg/mL），加入2 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和2 mL 1%鐵氫化鉀，于50 ℃水浴20 min，加2 mL 10%三氯乙酸，以3 000 r/min離心10 min，取2 mL上清液加2 mL去離子水、0.4 mL 0.1%三氯化鐵，反應(yīng)5 min，于700 nm測(cè)吸光度，以VC為陽(yáng)性對(duì)照，試驗(yàn)平行操作3次，測(cè)得的吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)[10]*。

還原力試驗(yàn)的原理是樣品將鐵氫化鉀還原成亞鐵氫化鉀，亞鐵氰化鉀與鐵離子作用，生成普魯士藍(lán)，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度越大，表明其對(duì)Fe3+*還原的活性越強(qiáng)。吸光度0.5時(shí)的樣品濃度，即為IC50值，IC50值越小表示樣品還原能力越強(qiáng)[11]*。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率[12]*

圖2顯示，總黃酮提取率隨著微波功率升高而先升高后降低，其原因是微波離子傳導(dǎo)作用可隨其功率增大而增強(qiáng)，促使變?nèi)~榕根細(xì)胞膜膨化、破裂，總黃酮在功率500 W時(shí)全部溶出，繼續(xù)增大微波功率，不但損耗能量，黃酮提取率還會(huì)隨之下降，可能是熱效應(yīng)導(dǎo)致黃酮分解[13]*，故確定微波功率為500 W。

圖2 微波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.2 微波時(shí)間

圖3顯示，微波提取時(shí)間小于20 min時(shí)，總黃酮提取率隨著時(shí)間延長(zhǎng)熱效應(yīng)逐漸加強(qiáng)，釋放量隨之增大，20 min時(shí)最高，表明該成分已完全釋放。25 min時(shí)，提取率迅速下降，主要是由于過(guò)量熱效應(yīng)可使總黃酮分解，故確定微波時(shí)間為20 min。

圖3 微波時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.3 料液比

提取溶液料液比對(duì)提取率產(chǎn)生影響，選取合適的料液比可以增加黃酮的提取量[14]*。圖4顯示，隨著料液比中乙醇用量增加，總黃酮逐漸被溶出，提取率逐漸增加。但其過(guò)量時(shí)，反而會(huì)因雜質(zhì)溶出而導(dǎo)致總黃酮提取率下降，故確定料液比為1∶40（g/mL）。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)

圖5顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)小于60%時(shí)，總黃酮提取率隨著其升高而增加，并在60%時(shí)達(dá)到溶解平衡，提取率最高。大于60%時(shí)，過(guò)量滲透壓會(huì)將變?nèi)~榕根中雜質(zhì)溶出，提取率反而下降，故確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化變?nèi)~榕根黃酮的提取工藝

2.2.1 因素水平設(shè)計(jì)

通過(guò)Design-Expert 13.0.1.0軟件分析，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)（Y）進(jìn)行優(yōu)化[15]*，因素水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2?；貧w方程為Y=17.64+0.24A-0.69B+0.18C+0.29D-0.067AB+0.005AC-1.41AD-0.095BC+0.56BD-0.59CD-0.69A2*-1.75B2*-0.82C2*-1.98D2*。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

方差分析見表3。由此可知：模型P＜0.000 1，表明模型顯著；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型失擬性不顯著；R2*為0.990，表明模型回歸顯著，準(zhǔn)確度高；Radj2*為0.981，表明總黃酮提取率與各因素之間相關(guān)度較高；C.V.僅為1.29%，表明模型可靠性高；模型F值與變量對(duì)響應(yīng)值影響呈正比[16]*，故各因素影響程度依次為微波時(shí)間（B）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）＞微波功率（A）＞料液比（C），與單因素試驗(yàn)結(jié)果一致；兩因素相互作用影響程度依次為AD＞CD＞BD＞BC＞AB＞AC。響應(yīng)面分析見圖6～圖11。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖6 微波功率（A）和微波時(shí)間（B）交互作用對(duì)提取率的影響

圖11 料液比（C）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）交互作用對(duì)提取率的影響

表3 方差分析

圖7 微波功率（A）和料液比（C）交互作用對(duì)提取率的影響

圖8 微波功率（A）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）交互作用對(duì)提取率的影響

圖9 料液比（C）和微波時(shí)間（B）交互作用對(duì)提取率的影響

圖10 乙醇體積分?jǐn)?shù)（D）和微波時(shí)間（B）交互作用對(duì)提取率的影響

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)59.3%、料液比1∶41.4（g/mL）、微波功率525.7 W、微波時(shí)間18.9 min，此時(shí)總黃酮提取率為1.77%。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)操作，將其修正為微波功率500 W、微波時(shí)間20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（g/mL），其他條件不變。開展3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總黃酮平均提取率為1.771%，接近預(yù)測(cè)值1.774%，表明模型擬合情況良好。

2.4 抗氧化活性

2.4.1 對(duì)DPPH·的清除能力

圖12顯示，隨著提取物質(zhì)量濃度的增大，變?nèi)~榕根總黃酮和VC對(duì)DPPH·的清除能力逐漸上升，但均低于VC，在100 μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，自由基清除率為總黃酮96.83%、VC 99.22%，且在高濃度時(shí)變?nèi)~榕根總黃酮清除率與VC相當(dāng)?？傸S酮的IC50值25.62 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50值8.47 μg/mL。從而可以證明，變?nèi)~榕根總黃酮具有良好的抗氧化活性，其活性隨濃度升高而增強(qiáng)。

圖12 不同濃度總黃酮提取物對(duì)DPPH·的清除率

2.4.2 對(duì)ABTS·的清除能力

圖13顯示，總黃酮隨著質(zhì)量濃度升高對(duì)ABTS·的清除能力也隨之加強(qiáng)，在低質(zhì)量濃度下與VC差距較大，在質(zhì)量濃度高于12.5 μg/mL時(shí)，總黃酮清除率迅速升高逐漸接近VC，總黃酮的IC50值6.99 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50值2.31 μg/mL。與DPPH·比較，總黃酮對(duì) ABTS·的清除能力相對(duì)較強(qiáng)，在質(zhì)量濃度均低于25.00 μg/mL時(shí)明顯高于對(duì)DPPH·的清除能力。

圖13 不同濃度總黃酮提取物對(duì)ABTS·的清除率

2.4.3 還原能力測(cè)定結(jié)果

還原力試驗(yàn)的原理是樣品將鐵氫化鉀還原成亞鐵氫化鉀，亞鐵氰化鉀與鐵離子作用，生成普魯士藍(lán)，在700 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，吸光度越大，表明其對(duì)Fe3+*還原的活性越強(qiáng)。吸光度0.5時(shí)的樣品濃度，即為IC50值，IC50值越小表示樣品還原能力越強(qiáng)[17]*。

如圖14所示，在6.25～100 μg/mL濃度的范圍內(nèi)，變?nèi)~榕根總黃酮對(duì)Fe3+*還原活性隨著濃度的增加活性增強(qiáng)?？傸S酮的IC50值大于100 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照VC的IC50值48.26 μg/mL。由此可見，變?nèi)~榕根總黃酮對(duì)Fe3+*還原活性明顯低于VC。

圖14 不同濃度總黃酮提取物對(duì)Fe3+*的還原能力

3 結(jié)論

試驗(yàn)所得最優(yōu)變?nèi)~榕根總黃酮微波輔助提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、料液比1∶40（g/mL）、微波功率500 W、微波時(shí)間20 min，此時(shí)總黃酮提取率為1.77%，接近于預(yù)測(cè)值，表明工藝準(zhǔn)確可靠。變?nèi)~榕根總黃酮提取液對(duì)DPPH·、ABTS·均有較強(qiáng)的清除能力，在質(zhì)量濃度高于20 μg/mL僅略低于VC，對(duì)Fe3+*還原活性明顯低于VC。綜上所述，變?nèi)~榕根總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化能力，表明該植物可作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、保健品等行業(yè)，開發(fā)前景廣闊。