海參粉微丸制備工藝

喻樊 *，蔡蓉，蔡伶麗

1. 江蘇省腫瘤靶向納米診療材料工程研究中心，鹽城師范學(xué)院鹽城（鹽城 224007）；2. 藥學(xué)院鹽城師范學(xué)院（鹽城224051）；3. 江蘇省灘涂生物資源與環(huán)境保護重點建設(shè)實驗室（鹽城 224002）；4. 南京工業(yè)大學(xué)（南京 210000）

海參屬于棘皮動物門海參綱的動物，大多分布在世界各大海洋的潮間帶及深海海域。近年來，隨著人們保健意識和生活水平的提高，海參的藥用價值和保健價值受到越來越多的關(guān)注。大量研究表明，海參富含海參多糖、膠原蛋白、海參皂苷和腦苷脂等生物活性物質(zhì)及18種氨基酸，具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓、降血糖和增強免疫力等藥理作用[1-5]*。海參粉中海參多糖的含量最高，約占干海參總有機物的31%[6]*。海參多糖主要為海參糖胺聚糖，能提高機體的細(xì)胞免疫功能，促進淋巴細(xì)胞增長，增加胸腺指數(shù)，從而起到增強免疫力的作用；具有清除氧自由基的能力；能增加血纖維蛋白酶的活力，以防止血纖維蛋白的聚合，并改變血纖維蛋白的構(gòu)筑，從而起到抗血栓的作用[7]*。

微丸屬于多單元型給藥系統(tǒng)，與單劑量型給藥系統(tǒng)相比有許多優(yōu)點：（1）每個給藥劑量通常含有幾十或幾百個微丸，釋藥行為是所有微丸的總和；（2）在胃內(nèi)的滯留時間長，粒徑小，轉(zhuǎn)運受食物輸送節(jié)律的影響較小，因此微丸在胃腸道內(nèi)的吸收一般不受胃排空的影響；（3）藥物在胃腸道內(nèi)的分布面積擴大，生物利用度提高，且對胃腸道的刺激減少或消除。此外，微丸還具備生產(chǎn)工藝簡潔、流動性好、脆碎度小、穩(wěn)定性強等優(yōu)點[8]*。

常見的微丸制備工藝有包衣鍋法、離心造粒法、流化床包衣法和擠出滾圓法[9-10]*。采用擠出滾圓法制丸，制粒種類廣泛、微丸粒徑分布均勻、圓整度好、載藥量高[11]*。試驗采用的是擠出滾圓法，并利用單因素試驗對工藝參數(shù)進行優(yōu)化，考察微丸的粉體學(xué)性質(zhì)并對微丸進行表征。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

E-50擠出制粒機、R-250離心滾圓機（均為重慶英格制藥設(shè)備制造有限公司）；FD-1D-80冷凍干燥機（北京博衣康實驗儀器有限公司）；IKA研磨機、CS-2脆碎度測試儀（均為天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司）；布魯克TENSORⅡ研究級傅里葉變換紅外光譜儀（德國布魯克光譜儀器公司）；SDP電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；三目生物顯微鏡XSP-8C（上海嚴(yán)豐精密儀器有限公司）；Lambda 950紫外分光光度計（美國PE公司）；環(huán)境掃描電子顯微鏡（Quanta 200，荷蘭FEI公司）；FT-104B休止角測定儀（寧波瑞柯偉業(yè)儀器有限公司）；DSC 8500差示掃描量熱儀（美國PerkinElmer）；Millipore Q超純水系統(tǒng)（美國Merck）。

1.2 材料與試劑

淡干海參（煙臺瑞參堂水產(chǎn)有限公司）；玉米淀粉（廣饒麗楓生物科技有限公司，批號2016032601）；碳酸鈣（宜興市第二化學(xué)試劑廠，批號070613）；微晶纖維素（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號20130802）；其他試劑為分析純。

1.3 試驗方法

1.3.1 海參粉的制備

（1）回軟：在淡干海參中倒入0～5 ℃純凈水，置于4 ℃冰箱中泡發(fā)24～48 h，每12 h換1次水。

（2）去沙嘴：用剪刀將海參開膛去沙嘴，去除海參的內(nèi)臟。

（3）水煮：將海參放入鍋中小火煮70～90 min。

（4）泡發(fā)：出鍋后用涼水沖洗海參，將其用0～5 ℃純凈水泡發(fā)，置于4 ℃冰箱保存2～3 d，每12 h換1次水。

（5）冷凍保存：將上述泡發(fā)完成后的海參剪成厚度約2 cm小塊裝在培養(yǎng)皿中，冷凍保存24 h左右。

（6）冷凍干燥：將冷凍后的海參放入冷凍干燥機進行冷凍干燥。

（7）粉碎機粉碎：將干燥后的海參放入研磨機中進行粉碎，將粉碎后的海參粉放入干燥器中保存。

1.3.2 微丸的制備[12]*

（1）混合：將物料混合均勻。

（2）制軟材：將混合均勻的物料與10%淀粉漿捏合均勻。

（3）擠出：將軟材握成團后放入擠出制粒機中，擠成直徑相同的條狀軟材。

（4）滾圓：將擠出的軟材倒入離心滾圓機中進行滾圓。

（5）微丸干燥：將滾圓好的微丸放入烘箱（60～80 ℃）干燥。

空白微丸的制備處方：碳酸鈣40 g、微晶纖維素10 g。

海參粉微丸的制備處方：海參粉2.0 g、碳酸鈣10.0 g、微晶纖維素3.2 g。

1.3.3 工藝因素考察

由于擠出頻率、滾圓頻率和滾圓時間對試驗的結(jié)果影響較大，因此以圓整度為主要的評價指標(biāo)，利用單因素試驗篩選出最佳的制備工藝參數(shù)。

1.3.3.1 擠出頻率的考察

擠出頻率是影響擠出物料質(zhì)量的一個重要因素。若擠出頻率過快，軟材溫度升高，造成軟材中水分喪失，成形性變差；若擠出頻率過慢，則耗時長，軟材容易變干，不易滾圓[13]*。固定滾圓頻率50 Hz、滾圓時間4 min，考察擠出頻率30，40和50 Hz時對微丸成丸效果影響。

1.3.3.2 滾圓頻率的考察

滾圓為條狀軟材提供剪切力和離心力，若滾圓頻率太低，細(xì)長條軟材難以切斷，無法形成微丸。固定擠出頻率30 Hz、滾圓時間4 min，考察滾圓頻率30，40和50 Hz時對微丸的成丸效果影響。

1.3.3.3 滾圓時間的考察

在一定的范圍內(nèi)，滾圓時間越長，微丸的圓整度越好。但時間過長，則造成微丸的粒徑增大或粘連，且粉塵增多；時間過短，軟材則不易塑變成球形[14]*。固定擠出頻率30 Hz、滾圓頻率50 Hz，考察滾圓時間4，6和8 min時對微丸的成丸效果影響。

1.3.4 粉體學(xué)性質(zhì)的測定

1.3.4.1 海參粉粉體學(xué)性質(zhì)的測定

1.3.4.1.1 流動性的測定

將海參粉、碳酸鈣和微晶纖維素倒入漏斗中，使其在重力的作用下做自由落體運動，在漏斗下方形成圓錐體，測量圓錐體的高度（h）和半徑（r），計算出休止角。

1.3.4.1.2 松密度的測定

將一定量的海參粉倒入量筒中，在沒有外力的作用下，測定海參粉的密度，即松密度[15]*。

1.3.4.2 微丸粉體學(xué)性質(zhì)的測定

1.3.4.2.1 粒度分布

采用篩析法測定空白微丸的粒度分布。稱取40 g微丸，用標(biāo)準(zhǔn)篩篩分3 min，稱量通過不同孔徑篩孔的微丸的質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)，繪制粒度分布圖。

1.3.4.2.2 休止角的測定

使用休止角測定儀測量空白微丸的休止角。將空白微丸倒入漏斗中，使其在重力作用下做自由落體運動，空白微丸落到表面皿中形成圓錐體，測量空白微丸的錐形高度（h）和微丸在表面皿中的半徑（r），θ為休止角，按式（1）計算[16]*。

1.3.4.2.3 表面形態(tài)和圓整度

通過生物顯微鏡觀察微丸的表面形態(tài)，利用HRT1000圖像顆粒軟件拍攝圖片并測定圓整度。

1.3.4.2.4 堆密度的測定

稱取20 g微丸，緩緩?fù)ㄟ^玻璃漏斗傾倒至50 mL量筒內(nèi)，測出微丸的松容積，按式（2）計算出微丸的堆密度。

1.3.4.2.5 脆碎度的測定

稱取質(zhì)量m0的微丸倒入脆碎度儀，轉(zhuǎn)速24 r/min，旋轉(zhuǎn)圈數(shù)100 r。收集并稱量剩下微丸質(zhì)量m，按式（3）計算脆碎度Fr。

1.3.5 微丸的表征

1.3.5.1 掃描電子顯微鏡法（SEM）

以海參粉、空白微丸、海參粉微丸、海參粉微丸的橫切面、空白微丸的橫切面和經(jīng)人工胃液腐蝕5 s的海參粉微丸作為樣品，噴金15 s后，置于電鏡測試儀器內(nèi)，于高壓15.00 kV進行測定。

1.3.5.2 紅外光譜

以海參粉、碳酸鈣、微晶纖維素、空白微丸、物理混合物和海參粉微丸作為樣品，分別在400～4 000 cm-1*范圍內(nèi)檢測紅外吸收光譜，記錄數(shù)據(jù)并作圖[17]*。

1.3.5.3 X射線衍射法（XRD）

以海參粉、碳酸鈣、微晶纖維素、空白微丸、物理混合物和海參粉微丸作為樣品進行XRD分析。檢測的條件：Cu靶，K線；掃描方式，定性，步進掃描；管壓40 kV，管流30 mA，掃描步長0.02°，掃描范圍10°～80°，掃描速度2°/min。取干燥后的樣品研磨，壓片，置于X射線粉末衍射儀上；設(shè)置衍射參數(shù)（10°～80°，10°/min）[18]*，記錄數(shù)據(jù)并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝因素的確定

2.1.1 擠出頻率的確定

固定滾圓頻率50 Hz、滾圓時間4 min，考察擠出頻率30，40和50 Hz時對微丸成丸效果影響，試驗結(jié)果見表1。

由表1可知，擠出頻率為30 Hz時，微丸的圓整度較好，因此擠出頻率確定為30 Hz。

表1 擠出頻率對微丸圓整度的影響

2.1.2 滾圓頻率的確定

固定擠出頻率30 Hz、滾圓時間4 min，考察滾圓頻率30，40和50 Hz時對微丸的成丸效果影響，試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，滾圓頻率50 Hz時，微丸的圓整度較好，因此滾圓頻率確定為50 Hz。

表2 滾圓頻率對微丸圓整度的影響

2.1.3 滾圓時間的確定

固定擠出頻率30 Hz、滾圓頻率50 Hz，考察滾圓時間4，6和8 min時對微丸的成丸效果影響，試驗結(jié)果見表3。

由表3可知，滾圓時間4 min時，微丸的圓整度較好，因此滾圓時間確定為4 min。

表3 滾圓時間對微丸圓整度的影響

綜上所述，微丸的最佳制備工藝參數(shù)為擠出頻率30 Hz、滾圓頻率50 Hz、滾圓時間4 min。

2.2 粉體學(xué)性質(zhì)結(jié)果分析

2.2.1 海參粉的粉體學(xué)性質(zhì)結(jié)果分析

2.2.1.1 海參粉的流動性

通常休止角的大小可判定流動性。海參粉、碳酸鈣、微晶纖維素的休止角分別為56.3°，34.1°和38.2°，可見海參粉的流動性差，但兩種輔料的流動性均較好，可充當(dāng)助流劑。

2.2.1.2 海參粉的松密度

通過計算，海參粉的松密度為0.08 g/mL，表明其密度小，因而制軟材時應(yīng)注意物料的加入順序，先加入海參粉，再依次加入碳酸鈣、微晶纖維素。

2.2.2 微丸的粉體學(xué)性質(zhì)

2.2.2.1 微丸的粒度分布

微丸的粒度分布見圖1。結(jié)果表明，空白微丸的粒度分布范圍窄。

圖1 空白微丸的粒度分布

2.2.2.2 微丸的流動性

微丸的休止角為38.7°。表面微丸的流動性基本符合要求。

2.2.2.3 微丸的表面形態(tài)

微丸的顯微鏡圖片見圖2。微丸的表面形態(tài)好，測得的圓整度均大于0.8，表明微丸形態(tài)基本合格。

圖2 微丸顯微鏡圖片

2.2.2.4 微丸的堆密度

利用式（2）計算得微丸的堆密度為1.4 g/mL。

2.2.2.5 微丸的脆碎度

利用式（3）計算得微丸的脆碎度為4.2%。

2.3 微丸的表征

2.3.1 掃描電子顯微鏡（SEM）分析

測試結(jié)果見圖3。由圖3（A）可以看出海參粉呈現(xiàn)片狀和塊狀的形態(tài)。由圖3（B和C）可以看出，空白微丸和海參粉微丸的圓整度均好，但2種微丸的表面粗糙，存在皺褶或裂縫，這可能是微丸干燥時被擠壓造成的[19]*。將海參粉微丸與經(jīng)人工胃液腐蝕5 s的海參粉微丸比較，后者的表面形態(tài)比前者差，其他并無差別，可能由于腐蝕的時間短，微丸的溶出效果不明顯。觀察空白微丸和海參粉微丸的橫切面，可見兩者的橫切面均有缺口，可能因微丸干燥后藥物或輔料縮水而造成。

圖3 掃描電子顯微鏡結(jié)果

2.3.2 紅外分析

紅外光譜結(jié)果見圖4。由于海參粉中富含大量氨基酸，氨基酸含有氨基和羧基，因此海參粉在3 315 cm-1*處有一個強度較弱的單峰，為N—H的伸縮振動；在1 536 cm-1*處為N—H的變形振動；在1 656 cm-1*處為羧基的特征吸收峰。碳酸鈣紅外吸收曲線在1 795 cm-1*出現(xiàn)的是C—O伸縮振動峰，在1 403 cm-1*出現(xiàn)C—O反對稱伸縮振動，而在873 cm-1*出現(xiàn)CO32-*面外變形振動峰，在710 cm-1*處是O—C—O的面內(nèi)變形振動峰。微晶纖維素的紅外譜圖中位于1 165 cm-1*處有C—O不對稱伸縮振動峰，位于1 432 cm-1*處是O—H彎曲振動峰，位于1 647 cm-1*處是纖維素分子吸附水分子而出現(xiàn)的吸收峰，位于2 909 cm-1*處是C—H伸縮振動峰，而位于3 328和3 408 cm-1*處的寬峰是分子內(nèi)氫鍵O—H伸縮振動峰?？瞻孜⑼柙?10和873 cm-1*的特征峰是由碳酸鈣引起的，而在2 915 cm-1*處的特征峰是由微晶纖維素引起的，說明空白微丸中含有碳酸鈣和微晶纖維素。物理混合物在710和873 cm-1*的特征峰是由碳酸鈣引起的，但未檢測到微晶纖維素和碳酸鈣的吸收峰，可能因為碳酸鈣量多，遮蓋微晶纖維素和海參粉。而在海參粉微丸的紅外譜圖中，有碳酸鈣和微晶纖維素的特征峰，但沒有海參粉的特征峰，說明海參粉在制備過程中可能進入微丸內(nèi)部，因而未檢測到海參粉的特征峰。

圖4 紅外吸收光譜

2.3.3 X射線衍射法（XRD）分析

XRD結(jié)果見圖5。由曲線（A）可知，海參粉的峰形又寬又大，說明海參粉為非晶體物質(zhì)。由曲線（B）可知，碳酸鈣在30°左右呈現(xiàn)很強的衍射峰，表明其為晶體結(jié)構(gòu)[20]*。微晶纖維素由于其結(jié)晶性質(zhì)在23°有一個尖銳的衍射峰。由曲線（D）可知，空白微丸中含有碳酸鈣和微晶纖維素的衍射峰，說明空白微丸中含有這兩種輔料。由曲線（E）可知，物理混合物中只有輔料的衍射峰，可能由于海參粉的量少，被輔料掩蓋，因而未發(fā)現(xiàn)海參粉的衍射峰，而海參粉微丸中也未出現(xiàn)海參粉的衍射峰，可能由于海參粉以無定形的形式高度分散于微丸中。

圖5 X射線衍射法（XRD）測試結(jié)果

3 討論與結(jié)論

常用的制備微丸所用輔料為微晶纖維素、淀粉、糊精和蔗糖。但是利用微晶纖維素所制備的微丸成品率不高，微丸密度也不高，并且微晶纖維素價格較昂貴，制備成本高，而利用淀粉和蔗糖制備的微丸不適用于患糖尿病的患者。為克服上述輔料存在不足，選用碳酸鈣作為微丸的輔料。碳酸鈣來源廣且價格便宜，制備的微丸具有成品率高、密度高、脆碎度低、粒徑分布窄、圓整度好等優(yōu)點，還具有補鈣效果。因此采用碳酸鈣為輔料，微晶纖維素為成球促進劑，10%淀粉漿為黏合劑，再加入海參粉，利用擠出滾圓法制備海參粉微丸。

采用單因素試驗考察制備工藝參數(shù)時發(fā)現(xiàn)：擠出頻率不宜太快，若太快會導(dǎo)致物料分散，無法擠出；滾圓頻率不宜太小，若太小會導(dǎo)致細(xì)長條軟材無法切斷，不易成丸；滾圓時間不宜太長，若太長會導(dǎo)致軟材變干，出現(xiàn)許多細(xì)粉，微丸的圓整度也不高。

通過紫外和紅外光譜分析，海參粉微丸中藥物的結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變，這有利于保持其原有的生物活性，差示掃描量熱法和X射線衍射法結(jié)果表明，藥物高度分散于微丸中。因此，試驗制備海參粉微丸的方法具有可行性，為海參產(chǎn)品的進一步開發(fā)提供技術(shù)參考。