凍融單囊胚移植中囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層評(píng)分對(duì)妊娠結(jié)局及新生兒出生結(jié)局的影響

伏海燕，李美玲，許娟娟，陳莉，李曉艷，林瑩，周城，吳蓉花，王慧，黃夢(mèng)婷，姚兵

(中國(guó)人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，南京 210002)

隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)和體系的不斷成熟和完善，囊胚移植在臨床上得到廣泛應(yīng)用。囊胚培養(yǎng)跨過(guò)胚胎基因組激活階段[1]，通過(guò)該階段的自然選擇，淘汰掉發(fā)育潛能較差的胚胎，有囊胚形成的胚胎往往具有較高的種植潛能[2]，以此提高胚胎的著床率和活產(chǎn)率[3-4]。與卵裂期胚胎相比，囊胚移植可顯著提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率[5]。而相比于兩枚囊胚的移植，單囊胚移植可以達(dá)到相似的臨床妊娠率，且由于降低了移植胚胎的個(gè)數(shù)從而可以顯著降低多胎妊娠的風(fēng)險(xiǎn)[6]。因此如何挑選出發(fā)育潛能最佳的囊胚用于移植，是單囊胚移植能否成功的關(guān)鍵因素之一。

目前篩選優(yōu)質(zhì)囊胚的方法主要還是依賴(lài)于Gardner形態(tài)性評(píng)價(jià)體系[7-8]，該體系主要指標(biāo)是囊胚的擴(kuò)張程度、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)質(zhì)量和滋養(yǎng)層細(xì)胞(TE)質(zhì)量。有研究發(fā)現(xiàn)ICM評(píng)級(jí)較TE評(píng)級(jí)對(duì)臨床妊娠率和活產(chǎn)率有更高的預(yù)測(cè)價(jià)值，而囊胚不同發(fā)育速度和質(zhì)量評(píng)級(jí)對(duì)新生兒結(jié)局無(wú)明顯影響[9]。也有研究認(rèn)為囊胚發(fā)育速度、ICM等級(jí)、TE等級(jí)及囊胚擴(kuò)張程度均與整倍體胚胎復(fù)蘇移植周期早期妊娠結(jié)局無(wú)明顯相關(guān)性[10]。關(guān)于囊胚的發(fā)育速度和種植潛能的關(guān)系目前仍存在爭(zhēng)議，有文獻(xiàn)報(bào)道囊胚的發(fā)育速度對(duì)囊胚的種植潛能影響更為關(guān)鍵，其研究發(fā)現(xiàn)第5天(D5)形成的囊胚種植潛能高于D6形成囊胚組[11-12]；但也有不一致的觀點(diǎn)，有研究發(fā)現(xiàn)D5優(yōu)質(zhì)囊胚移植后的臨床妊娠結(jié)局與D6優(yōu)質(zhì)囊胚類(lèi)似[13]。因此，本研究回顧性分析本中心行單囊胚凍融胚胎移植(FET)患者的臨床資料，旨在探討FET周期中不同的囊胚質(zhì)量對(duì)臨床結(jié)局和新生兒出生結(jié)局的影響，為臨床實(shí)踐中選擇發(fā)育潛能最佳的囊胚進(jìn)行移植提供依據(jù)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2015年1月至2021年12月期間在本科室接受FET單囊胚移植患者的臨床資料，共1 647個(gè)周期。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者年齡≤38歲；(2)行FET單囊胚移植；(3)促排卵方案為激素降調(diào)節(jié)方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)行胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)的周期；(2)存在子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜息肉等影響子宮內(nèi)膜容受性的疾??；(3)促排卵方案為微刺激、自然周期、黃體期促排卵、高孕激素狀態(tài)下促排卵方案等溫和刺激方案；(4)供卵、供精周期；(5)行卵子冷凍的周期。

本研究中所有囊胚的擴(kuò)張程度均為3～6期。根據(jù)囊胚ICM和TE評(píng)分級(jí)別進(jìn)行分組：A組(移植AA級(jí)囊胚)231個(gè)周期；B組(移植AB/BA級(jí)囊胚)422個(gè)周期；C組(移植BB級(jí)囊胚)885個(gè)周期；D組(移植CB/BC級(jí)囊胚)109個(gè)周期。

二、研究方法

1.促排卵及體外受精：納入本研究的所有患者均采用激素降調(diào)節(jié)方案促排卵。當(dāng)主導(dǎo)卵泡平均直徑≥18 mm時(shí)，予HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)5 000～10 000 U扳機(jī)，36～38 h后采用超聲引導(dǎo)下的卵泡穿刺術(shù)取卵。所有獲得的卵母細(xì)胞均置于37℃、5%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)取卵日男方精液狀況決定授精方式，處理后男方精子總數(shù)達(dá)到IVF加精標(biāo)準(zhǔn)的患者行IVF，男方因素不育或未達(dá)IVF加精標(biāo)準(zhǔn)的患者行ICSI。授精后4.5 h脫除卵母細(xì)胞顆粒細(xì)胞，確定卵母細(xì)胞成熟度和雙極體(2PB)情況，若卵母細(xì)胞2PB數(shù)/MⅡ卵數(shù)≤30%，行補(bǔ)救ICSI(R-ICSI)；受精后16～18 h觀察卵子受精情況。

2.胚胎培養(yǎng)和評(píng)級(jí)：胚胎置于37℃、5%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至第3天，觀察胚胎的卵裂情況，并根據(jù)伊斯坦布爾共識(shí)[14]對(duì)卵裂期胚胎進(jìn)行評(píng)分。細(xì)則如下：Ⅰ級(jí)(4分)：胚胎卵裂球等大，形態(tài)規(guī)則，胞質(zhì)均勻清晰，碎片率少于10%；Ⅱ級(jí)(3分)：胚胎卵裂球大小不均，形態(tài)欠規(guī)則，碎片率10%～25%；Ⅲ級(jí)(2分)：胚胎卵裂球大小嚴(yán)重不均，形態(tài)欠規(guī)則，碎片率30%～50%；Ⅳ級(jí)(1分)：碎片率大于50%。Ⅰ～Ⅱ級(jí)卵裂期胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎，可以冷凍或移植；Ⅲ級(jí)卵裂期胚胎為非優(yōu)質(zhì)胚胎，可以繼續(xù)培養(yǎng)至囊胚。

囊胚評(píng)估采用Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7-8]進(jìn)行評(píng)分，分別在第5～7天觀察并對(duì)形成的囊胚進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分細(xì)則如下：根據(jù)囊胚腔的擴(kuò)張程度分為6個(gè)時(shí)期，分別為1期(早期囊胚，囊胚腔體積<囊胚總體積的一半)、2期(囊胚腔體積>囊胚總體積的一半)、3期(完全擴(kuò)張囊胚，囊胚腔體積占據(jù)整個(gè)囊胚)、4期(擴(kuò)張后囊胚，囊胚腔體積較早期囊胚明顯擴(kuò)大，透明帶變薄)、5期(正在孵出囊胚，囊胚正從透明帶裂口孵出)和6期(完全孵化囊胚，囊胚完全從透明帶中孵出)。根據(jù)ICM和TE細(xì)胞數(shù)量多少及形態(tài)分為3個(gè)等級(jí)，分別為A級(jí)(ICM細(xì)胞數(shù)多且排列緊密；TE細(xì)胞數(shù)多，形成緊密的上皮)、B級(jí)(ICM細(xì)胞數(shù)少，松散；TE細(xì)胞數(shù)少，上皮松散)、C級(jí)(ICM細(xì)胞數(shù)很少或幾乎沒(méi)有，TE細(xì)胞很少或僅由幾個(gè)稀疏細(xì)胞組成)。囊胚的擴(kuò)張程度在3～6期，TE和ICM評(píng)分均在B級(jí)以上即定義為優(yōu)質(zhì)囊胚；囊胚評(píng)分在3BC/3CB及以上即可冷凍或移植。

卵裂期胚胎和囊胚均采用玻璃化冷凍技術(shù)進(jìn)行冷凍，具體操作參照玻璃化冷凍試劑盒(Kitazato，日本)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

3.FET：子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案包括自然周期、人工周期和激素替代周期方案。移植當(dāng)日內(nèi)膜厚度達(dá)到7 mm方可移植。

移植當(dāng)日解凍患者囊胚，解凍具體方法參照玻璃化解凍試劑盒(Kitazato，日本)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。解凍后的囊胚行激光輔助孵化后放入囊胚培養(yǎng)液(SAGE，美國(guó))中置于37℃、5%CO2、5%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，觀察囊胚擴(kuò)張情況。

4.主要觀察指標(biāo)和妊娠結(jié)局判定：本研究主要觀察指標(biāo)有移植后臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率等。具體定義如下：移植后14 d測(cè)血HCG，移植后28 d行超聲檢查可見(jiàn)孕囊及監(jiān)測(cè)到胎心搏動(dòng)者為臨床妊娠。分娩妊娠≥28周的存活嬰兒定義為活產(chǎn)；妊娠≥28周且<37周間分娩者即早產(chǎn)。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；活產(chǎn)率=活產(chǎn)分娩周期數(shù)/移植周期總數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；早產(chǎn)率=早產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

本研究還觀察了新生兒出生結(jié)局方面的指標(biāo)，主要有新生兒男女性別比、單胎分娩孕周、出生體重，及低出生體重(LBW)、極低出生體重(VLBW)、巨大兒(HBW)、極小于胎齡兒(VSGA)、小于胎齡兒(SGA)、大于胎齡兒(LGA)和極大于胎齡兒(VLGA)的發(fā)生情況。且為了排除多胎對(duì)新生兒出生體重、出生缺陷、是否早產(chǎn)以及是否剖宮產(chǎn)的影響，本研究?jī)H對(duì)單胎分娩新生兒的出生結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、單囊胚FET周期各組患者一般資料及促性腺激素(Gn)使用情況比較

本研究共納入1 647個(gè)單囊胚FET周期，其中移植AA級(jí)單囊胚231個(gè)周期(A組)，移植AB/BA級(jí)單囊胚422個(gè)周期(B組)，移植BB級(jí)單囊胚885個(gè)周期(C組)，移植CB/BC級(jí)單囊胚109個(gè)周期(D組)。4組患者間平均年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎(chǔ)性激素水平、不孕年限、授精方式及Gn總量、Gn天數(shù)比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

二、單囊胚FET周期各組患者妊娠結(jié)局和新生兒出生結(jié)局比較

1.FET妊娠結(jié)局：各組患者的臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率組間比較均有顯著性差異(P<0.01)，且隨著ICM和TE評(píng)分的下降(從A組到D組)，臨床妊娠率和活產(chǎn)率有逐漸下降的趨勢(shì)，流產(chǎn)率則有逐漸上升的趨勢(shì)。各組間的早產(chǎn)率比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表2)。

2.新生兒出生結(jié)局：截至2021年12月31日，A、B、C及D組活產(chǎn)的新生兒分別是113例、167例、357例和25例。新生兒出生性別比4組間有顯著性差異(P<0.05)，A、B組出生的男嬰比例有明顯上升趨勢(shì)，而D組出生女?huà)氡壤忻黠@上升趨勢(shì)(表3)。各組分娩的新生兒出生孕周、出生體重(表3)及LBW、HBW、SGA、LGA等異常出生體重發(fā)生率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表1 各組患者的一般資料比較 [(-±s)，n(%)]

表2 各組患者妊娠結(jié)局比較(%)

表3 各組新生兒出生情況比較 [(-±s)，%]

表4 各組新生兒異常出生體重分類(lèi)比較[n(%)]

三、影響囊胚發(fā)育潛能的其他相關(guān)因素在各組間的比較

根據(jù)囊胚的發(fā)育特點(diǎn)，對(duì)可能影響囊胚發(fā)育潛能的其他因素(包括D3胚胎評(píng)分、D3胚胎細(xì)胞數(shù)以及囊胚擴(kuò)張程度、囊胚發(fā)育速度)進(jìn)一步分析。各組間不同D3胚胎評(píng)分和D3胚胎細(xì)胞數(shù)的周期數(shù)占比存在顯著性差異(P<0.01)。A組AA級(jí)囊胚中既往D3胚胎評(píng)分為Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)的優(yōu)質(zhì)胚胎占比達(dá)77.49%(179/231)，7～9細(xì)胞占比達(dá)76.62%；而在D組CB/BC級(jí)囊胚中既往D3胚胎評(píng)分為優(yōu)質(zhì)胚胎的比例顯著下降，僅為45.87%(50/109)，7～9細(xì)胞數(shù)占比為60.55%(表5)。

各組間不同囊胚擴(kuò)張程度和囊胚形成時(shí)間的周期數(shù)占比亦存在顯著性差異(P<0.01)。各組間囊胚的擴(kuò)張程度分布不均，但均以4期囊胚為主；囊胚的形成時(shí)間也不均衡，A組(AA級(jí)囊胚)在D5發(fā)育為囊胚的周期數(shù)占比高達(dá)93.94%，而D組(CB/BC級(jí)囊胚)較多于D6發(fā)育為囊胚，占比達(dá)74.31%(表5)。

表5 不同D3胚胎評(píng)分、胚胎細(xì)胞數(shù)及囊胚擴(kuò)張程度、形成時(shí)間在各組間的分布情況[n(%)]

四、對(duì)單囊胚FET周期臨床妊娠率和活產(chǎn)率的多因素Logistic回歸分析

對(duì)臨床妊娠率的影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，女方年齡、BMI、不孕年限、D3胚胎細(xì)胞數(shù)、D3胚胎評(píng)分、囊胚擴(kuò)張程度、囊胚形成時(shí)間對(duì)臨床妊娠率的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而隨著囊胚ICM和TE評(píng)級(jí)的增高，臨床妊娠率越高，且其影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)(表6)。

對(duì)活產(chǎn)率的影響因素進(jìn)行多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，BMI、不孕年限、D3胚胎細(xì)胞數(shù)、D3胚胎評(píng)分、囊胚擴(kuò)張程度、囊胚形成時(shí)間對(duì)活產(chǎn)率的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而女方年齡、囊胚ICM和TE評(píng)級(jí)對(duì)活產(chǎn)率的影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表6)。

表6 臨床妊娠率和活產(chǎn)率的多因素回歸分析

討 論

如何篩選具有較高發(fā)育潛能的囊胚是單囊胚移植中非常重要的問(wèn)題。本研究納入1 647個(gè)單囊胚FET周期進(jìn)行分析，結(jié)果表明囊胚的ICM和TE評(píng)級(jí)對(duì)判斷囊胚的發(fā)育潛能具有一定價(jià)值，這與之前較多的文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)似。目前Gardner囊胚的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7-8]和人類(lèi)IVF-ET實(shí)驗(yàn)室操作專(zhuān)家共識(shí)[15]均將ICM和TE評(píng)級(jí)作為評(píng)估囊胚質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。Guo等[16]研究發(fā)現(xiàn)囊胚的ICM和TE評(píng)級(jí)為活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素。Shi等[17]的研究結(jié)果表明囊胚的ICM質(zhì)量是整倍體囊胚發(fā)生流產(chǎn)的潛在因素，A級(jí)ICM的囊胚移植后流產(chǎn)率顯著低于B級(jí)。因此本研究以囊胚的ICM和TE評(píng)級(jí)這兩個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分組，分析發(fā)現(xiàn)隨著囊胚ICM和TE評(píng)級(jí)的逐漸下降，囊胚移植后的臨床妊娠率和活產(chǎn)率亦逐漸下降，流產(chǎn)率則逐漸上升。本研究結(jié)果顯示，ICM和TE評(píng)級(jí)均為A的囊胚移植后(A組)的臨床妊娠率為66.67%、活產(chǎn)率為48.92%，數(shù)據(jù)在4組中最高；流產(chǎn)率11.69%，為4組中最低。而ICM和TE評(píng)級(jí)為CB/BC的囊胚移植后(D組)的臨床妊娠率37.61%、活產(chǎn)率22.94%，顯著低于其他組；流產(chǎn)率34.15%，顯著高于其他組(P均<0.05)。提示囊胚的ICM和TE綜合評(píng)級(jí)可作為預(yù)測(cè)囊胚發(fā)育潛能的重要指標(biāo)之一。

關(guān)于囊胚的發(fā)育速度是否會(huì)影響移植后的臨床結(jié)局仍存在爭(zhēng)議。Ferreux等[11]研究發(fā)現(xiàn)D6囊胚移植組與D5囊胚移植組相比活產(chǎn)率顯著下降(29.6% vs. 17.0%，P<0.01)，D6優(yōu)質(zhì)囊胚形成率亦顯著低于D5優(yōu)質(zhì)囊胚形成率(82% vs. 68%，P<0.001)，提示D6囊胚組的活產(chǎn)率下降可能是由于優(yōu)質(zhì)囊胚率下降導(dǎo)致的。而陳麗娜等[9]對(duì)938個(gè)優(yōu)質(zhì)單囊胚FET周期的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，D5單囊胚移植組與D6單囊胚移植組有相似的活產(chǎn)率。本研究中以囊胚形成時(shí)間作為囊胚發(fā)育速度的指標(biāo)，Logistic多因素分析的結(jié)果顯示，囊胚的發(fā)育速度不是臨床妊娠率和活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素(P>0.05)。因此我們認(rèn)為只要是優(yōu)質(zhì)囊胚移植，囊胚自身的發(fā)育速度并不明顯影響囊胚種植后的妊娠結(jié)局。

本研究中，不同D3胚胎評(píng)分和細(xì)胞數(shù)在各組間的分布是不一致的，A組的AA級(jí)囊胚主要來(lái)源于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎(占比達(dá)77.49%)，而D組CB/BC級(jí)囊胚來(lái)源于Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎的比例顯著下降，僅為45.87%；形成的可移植囊胚中來(lái)源于4～6細(xì)胞D3胚胎的比例從A組的3.46%上升至D組的30.28%；且D3胚胎中發(fā)育速度較慢的胚胎在D組的分布相對(duì)較多(6.42%)。提示低評(píng)分囊胚多來(lái)源于D3評(píng)分較低且發(fā)育速度較慢的胚胎。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著D3胚胎評(píng)級(jí)的下降，囊胚形成率也顯著下降(P<0.01)，尤其是Ⅲ級(jí)胚胎與Ⅰ級(jí)胚胎之間，下降趨勢(shì)有顯著性差異(P<0.01)。Herbemont等[19]研究發(fā)現(xiàn)，D3/D2胚胎的評(píng)級(jí)對(duì)優(yōu)質(zhì)囊胚的種植潛能沒(méi)有明顯影響；我們的研究結(jié)果與之類(lèi)似，本研究中多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明D3胚胎評(píng)分和細(xì)胞數(shù)不是臨床妊娠率和活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素，提示只要有囊胚形成，D3胚胎的評(píng)分和細(xì)胞數(shù)的多少并不明顯影響該囊胚的種植潛能。

本研究還觀察了不同ICM和TE評(píng)級(jí)的囊胚移植后新生兒出生結(jié)局情況，4組間早產(chǎn)率、新生兒出生孕周、出生體重和LBW等發(fā)生率比較均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。提示不論是優(yōu)質(zhì)囊胚還是非優(yōu)質(zhì)CB/BC級(jí)囊胚，雖然臨床妊娠率和活產(chǎn)率有顯著性差異，但是一旦獲得活產(chǎn)，新生兒出生情況差異并不明顯；但尚不能排除由于樣本量較少而造成的結(jié)論偏倚。本研究結(jié)果與何于夏等[20]的研究類(lèi)似。然而，本研究中4組間的出生嬰兒性別比有顯著性差異(P<0.05)，提示囊胚ICM和TE評(píng)級(jí)可能與出生性別比有一定關(guān)聯(lián)。Maalouf等[21]也有類(lèi)似的發(fā)現(xiàn)，他們分析了英國(guó)10年間經(jīng)ART治療出生的106 066個(gè)新生兒，其數(shù)據(jù)顯示單囊胚移植后分娩的新生兒出生性別比顯著上升(P<0.05)。

綜上所述，在單囊胚FET周期中，囊胚的ICM和TE評(píng)分較為關(guān)鍵，是臨床妊娠率和活產(chǎn)率的獨(dú)立影響因素；其可作為移植后預(yù)測(cè)妊娠結(jié)局的一個(gè)重要參數(shù)，為臨床上單囊胚移植策略的制定提供一定參考。