1 株耐熱蠟樣芽孢桿菌的鑒定及其緩解炎癥性腸病的功效評價

許一凡，盛康亮，王永中

（安徽大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽省人體微生態(tài)與精準(zhǔn)醫(yī)藥重點實驗室，安徽 合肥 230601）

蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，在土壤、空氣及動物腸道中普遍存在[1]。因其具有高度黏附性的內(nèi)生孢子，常作為實驗室培養(yǎng)或食品生產(chǎn)過程中的一種污染菌株被發(fā)現(xiàn)[2]。其一部分具有一定的毒性，會導(dǎo)致輕微的腹瀉和嘔吐癥狀[3]，另一些則具有益生作用[4]。蠟樣芽孢桿菌作為腸道益生菌易于加工便于貯存，具有調(diào)節(jié)腸道微生物組成、強(qiáng)耐酸性和熱穩(wěn)定性等特點，在腸道疾病的治療領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景[5]。

蠟樣芽孢桿菌是“蠟樣芽孢桿菌群”的成員之一，因該菌群成員之間有密切的進(jìn)化關(guān)系，往往很難使用常規(guī)鑒定方法加以區(qū)分[6]。目前鑒定未知菌株的標(biāo)準(zhǔn)方法是16S rRNA測序輔以生理生化檢測，但16S rRNA序列的分子質(zhì)量小、保守性高，很多時候只能在屬水平上鑒定細(xì)菌，生理生化檢測過程繁瑣，結(jié)果評價主觀性強(qiáng)，只能作為分子鑒定的補(bǔ)充。因此，通過其他保守蛋白編碼基因可進(jìn)一步鑒定菌株。蛋白編碼基因由于密碼子兼并性的特點，其進(jìn)化速度比16S rRNA更快，因此保守蛋白編碼基因在系統(tǒng)發(fā)育分析時具有更高的分辨率[7]。對于親緣關(guān)系十分接近的物種，采用多種保守蛋白編碼基因聯(lián)合鑒定可以進(jìn)一步提高其分辨率[8]。其中g(shù)yrA和gyrB基因是常用于芽孢桿菌鑒定的保守蛋白編碼基因[9-10]。蠟樣芽孢桿菌因其特異性毒力基因的存在，在驗證未知菌株是否為蠟樣芽孢桿菌時，可以用其特異性的毒力基因進(jìn)行分子水平驗證[11]。

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種多發(fā)于結(jié)腸部位的慢性腸道疾病，臨床癥狀以腹瀉、血便及黏液膿血便為主。全球有數(shù)百萬人受其影響，并且發(fā)病率還在迅速上升[12]。現(xiàn)在主流的化學(xué)藥物療法不能完全治愈的同時還伴隨著極大副作用[13-14]，因此安全無副作用的益生菌藥物作為一種新的治療方案開始被應(yīng)用到IBD治療。據(jù)報道在飼料中添加蠟樣芽孢桿菌可以通過增強(qiáng)腸道屏障功能和降低炎癥因子水平預(yù)防腸道炎癥[15]。但蠟樣芽孢桿菌對實驗性小鼠結(jié)腸炎模型的積極作用尚未被評估。

本研究采用16S rRNA、保守蛋白編碼基因（gyrA、gyrB）、蠟樣芽孢桿菌特異性毒力基因（nheA、nheB、nheC、hblA、hblC、hblD、becT、cytK、entFM）及生理生化的方法對實驗室未知菌株進(jìn)行鑒定，并評價其生長特性及其對實驗性小鼠結(jié)腸炎模型的干預(yù)改善作用，旨在探究該株蠟樣芽孢桿菌在炎癥性腸病中的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗菌株 安徽省人體微生態(tài)與精準(zhǔn)醫(yī)療重點實驗室；葡萄糖、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母提取物、瓊脂糖、瓊脂粉、甘油、Tris、Taqmix 生工生物工程（上海）股份有限公司；NaCl、Na2EDTA-2H2O、冰乙酸、無水乙醇、二甲苯 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；KOD-Plus聚合酶 東洋紡（上海）生物科技有限公司；蘇木素染色液、伊紅染色液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPT-P290C智能生化培養(yǎng)箱 上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；-80 ℃超低溫保存箱 青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；JS-680D凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；DYY-2C水平電泳槽 北京六一儀器廠；ZQLY-180S振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 未知菌株的分離培養(yǎng)和純化

用無菌接種環(huán)挑取未知菌株的單菌落，LB（Luria-Bertani）液體培養(yǎng)基于37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)12 h。所得菌液稀釋105倍后，將100 μL稀釋菌液平板涂布于LB固體培養(yǎng)基上，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16 h，分析并記錄污染菌株的菌落形態(tài)。再次挑取單菌落在同樣條件下培養(yǎng)24 h，所得菌液與60%甘油-磷酸鹽緩沖液以1∶1的比例混合，保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2 分離菌的16S rRNA鑒定

使用革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒提取分離菌的基因組DNA，在生工生物工程（上海）股份有限公司合成16S rRNA擴(kuò)增引物。上游引物序列：5’-AGAGT-TTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物序列：5’-AAGGAGGATCCAGCCGCA-3’[16]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）條件與文獻(xiàn)[17]一致，并將PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳驗證。驗證無誤后，將PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序得到的分離菌序列在NCBI官網(wǎng)上使用BLAST工具進(jìn)行同源性分析。

1.3.3 分離菌的保守蛋白編碼基因鑒定

SnapGene軟件設(shè)計保守蛋白編碼基因gyrA和gyrB的上下游引物（表1）。以分離菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，條件同1.3.2節(jié)。PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳驗證無誤后，檢測PCR產(chǎn)物序列并在NCBI官網(wǎng)上使用BLAST工具進(jìn)行同源性分析。選取常見芽孢桿菌作為外群，通過MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，進(jìn)行核酸同源性比對。

表1 蠟樣芽孢桿菌保守蛋白編碼基因和毒力基因的檢測引物Table 1 Primers used for the amplification of conserved protein-coding genes and virulence genes in B.cereus

1.3.4 分離菌的毒力基因鑒定

合成蠟樣芽孢毒力基因的上下游引物[18]見表1。使用1.3.2節(jié)的PCR條件以分離菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，擴(kuò)增目的基因。PCR產(chǎn)物用10 g/L的瓊脂糖凝膠進(jìn)行凝膠電泳驗證。

1.3.5 分離菌的生理生化鑒定

根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》的實驗方法對分離菌形態(tài)學(xué)特征、生理生化指標(biāo)及生長特性進(jìn)行測定[19]。

1.3.6 動物實驗分組及模型的建立

取體質(zhì)量（20±2）g的健康雄性C57BL/6J小鼠30 只，自由進(jìn)食和飲水的情況下，保持12 h的光周期在室溫（25±0.5）℃、相對濕度（50±5）%環(huán)境下適應(yīng)1 周，并隨機(jī)分為3 組：空白對照組、結(jié)腸炎模型組（葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）、蠟樣芽孢桿菌干預(yù)組。每組含10 只小鼠，蠟樣芽孢桿菌干預(yù)組小鼠灌胃菌懸液的劑量為2×108CFU，重懸于200 μL生理鹽水中，灌胃時間為21 d，對照組與結(jié)腸炎模型組灌胃等量的生理鹽水。第14～21天，給予結(jié)腸炎模型組和蠟樣芽孢桿菌干預(yù)組2.5% DSS溶液自由飲用，用于實驗性潰瘍結(jié)腸炎小鼠模型造模，每天記錄小鼠的糞便形狀、便血狀況和體質(zhì)量的變化，對其進(jìn)行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）打分[15]。本研究涉及動物的所有程序均按照實驗動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行，并經(jīng)安徽大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.3.7 蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色

10%福爾馬林溶液固定小鼠結(jié)腸組織樣本，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水、蘇木精染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、脫水和封片后，倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。使用結(jié)腸組織的病理組織分級評分定量評估小鼠結(jié)腸組織的病理學(xué)改變[15]。

1.3.8 real-time PCR

按照TaKaRa公司的總RNA提取試劑盒說明書，提取小鼠結(jié)腸組織樣本的總RNA。使用Synergy H1酶標(biāo)儀測定RNA濃度，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明設(shè)計反轉(zhuǎn)錄體系，獲得cDNA樣品。根據(jù)TB Green?Premix ExTaqTMGC試劑盒的方法進(jìn)行real-time PCR，基因引物見表S3[20-21]。所有基因均以GAPDH為對照基因，采用比較閾值法（2-ΔΔCt）進(jìn)行相對定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌16S rRNA鑒定結(jié)果

16S rRNA測序結(jié)果顯示，分離菌16S rRNA片段長度為1487 bp，對序列進(jìn)行BLAST比對，得到多株不同的芽孢桿菌與分離菌親緣性超過99%（表2）。說明16S rRNA鑒定顯示分離菌是芽孢桿菌屬的成員之一，進(jìn)一步鑒定出分離菌的種系需要采用分辨率更高的鑒定方法。

表2 16S rRNA序列同源性比對結(jié)果Table 2 Results of homology alignment of 16S rRNA sequences

2.2 分離菌保守蛋白編碼基因鑒定結(jié)果

將測序得到的分離菌gyrA和gyrB基因序列與NCBI官網(wǎng)上常見芽孢桿菌的gyrA和gyrB基因序列通過MAGA7軟件生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，gyrA和gyrB的系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果都顯示，分離菌與蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌種系的親緣關(guān)系較近，和其他芽孢桿菌種系的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖1）。根據(jù)保守蛋白編碼基因鑒定可以得出分離菌屬于蠟樣芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌。

圖1 分離菌的保守蛋白編碼基因gyrA（A）和gyrB（B）的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic trees for the strain based on conserved protein-coding genes gyrA (A) and gyrB (B)

2.3 分離菌的毒力基因鑒定結(jié)果

分離菌的蠟樣芽孢桿菌特異性毒力基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證，每個重復(fù)2 次，結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶與NCBI官網(wǎng)上對應(yīng)蠟樣芽孢桿菌特異性毒力基因的大小相符（圖2），可以證明分離菌基因組中含有蠟樣芽孢桿菌特異性的毒力基因。蠟樣芽孢桿菌特異性毒力基因鑒定的結(jié)果得出分離菌屬于蠟樣芽孢桿菌。

圖2 分離菌株蠟樣芽孢桿菌毒力基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoretic results of PCR amplification products of virulence genes in B.cereus

2.4 分離菌的生理生化鑒定結(jié)果

在LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h后可以觀察到分離菌株菌落較大，淡黃色、不透明，菌落近似圓形表面呈融蠟狀，邊緣呈擴(kuò)展?fàn)睿▓D3A）。倒置顯微鏡下分離菌革蘭氏染色結(jié)果為陽性，芽孢呈桿狀，不規(guī)則排列（圖3B）。生理生化的鑒定結(jié)果如表3所示，經(jīng)對照分離菌生理生化特性與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中蠟樣芽孢桿菌的生理生化性質(zhì)一致[19]，佐證了分子鑒定的結(jié)果。故將分離菌命名為蠟樣芽孢桿菌HMPM18123，并保藏于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC）。

圖3 分離菌的菌落（A）及芽孢形態(tài)（B）Fig.3 Colony (A) and spore morphology (B) of B.cereus HMPM18123

表3 分離菌株生理生化實驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of B.cereus HMPM18123

對蠟樣芽孢桿菌HMPM18123別進(jìn)行耐酸、耐高溫和胃液腸液耐受測試，發(fā)現(xiàn)其在pH 5和pH 6的環(huán)境中生長旺盛，在pH 4以下的環(huán)境不能繁殖（圖4A）。該菌株在30 ℃和40 ℃時繁殖旺盛；50 ℃和60 ℃時繁殖緩慢；70 ℃時則不能生長（圖4B）。另外，在50 ℃和60 ℃環(huán)境下培養(yǎng)72 h后轉(zhuǎn)入37 ℃正常培養(yǎng)24 h繁殖速度可以立即恢復(fù)，70 ℃培養(yǎng)72 h的菌株再轉(zhuǎn)入37 ℃正常培養(yǎng)也無法繼續(xù)生長（圖4C）。蠟樣芽孢桿菌HMPM18123在人工胃液中前2 h存活率接近100%，3 h后依然有半數(shù)存活（圖5A）；分離菌接種到人工腸液中3 h后活菌數(shù)不變（圖5B）。以上結(jié)果表明蠟樣芽孢桿菌HMPM18123具有良好的耐熱和胃液腸液耐受特性。

圖4 蠟樣芽孢桿菌HMPM18123的耐酸耐高溫生長特性Fig.4 Acid resistance and high temperature resistance of B.cereus HMPM18123

圖5 蠟樣芽孢桿菌HMPM18123在人工胃液和人工腸液中的存活率Fig.5 Survival rate of B.cereus HMPM18123 in simulated gastric fluid and simulated intestinal fluid

2.5 蠟樣芽孢桿菌HMPM18123對實驗性結(jié)腸炎小鼠的干預(yù)作用

結(jié)腸炎模型組小鼠相比對照組小鼠體質(zhì)量持續(xù)降低（圖6A），DAI評分持續(xù)增高（圖6B），結(jié)腸長度明顯縮短（圖7）。蠟樣芽孢桿菌HMPM18123干預(yù)后可以顯著緩解小鼠結(jié)腸炎導(dǎo)致的體質(zhì)量下降、DAI評分上升和結(jié)腸長度縮短的情況。

圖6 各實驗組小鼠的體質(zhì)量（A）及DAI評分（B）變化Fig.6 Changes in body mass (A) and DAI score (B) of mice in normal control,DSS-induced colitis and B.cereus HMPM18123 intervention groups

圖7 各實驗組小鼠的結(jié)腸照片（A）及結(jié)腸長度對比（B）Fig.7 Colonic photos (A) and colonic length (B) of mice in normal control,DSS-induced colitis and B.cereus HMPM18123 intervention groups

如圖8A所示，對照組小鼠結(jié)腸黏膜層及隱窩結(jié)構(gòu)正常，且無炎癥細(xì)胞浸潤發(fā)生。模型組結(jié)腸組織出現(xiàn)隱窩缺失、炎癥細(xì)胞浸潤、黏膜損傷和黏膜下層薄壁水腫。相比之下，蠟樣芽孢桿菌HMPM18123干預(yù)組一定程度上恢復(fù)了結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織完整性。此外，結(jié)腸組織病理評分結(jié)果表明（圖8B），干預(yù)組小鼠結(jié)腸組織損傷顯著減輕。以上證據(jù)表明，蠟樣芽孢桿菌HMPM18123可以緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。

圖8 各實驗組小鼠的結(jié)腸HE染色照片及病理分析結(jié)果Fig.8 HE staining photos and pathological analysis of colon tissues of mice in normal control,DSS-induced colitis and B.cereus HMPM18123 intervention groups

2.6 蠟樣芽孢桿菌HMPM18123對結(jié)腸炎小鼠炎癥及抑炎因子基因表達(dá)的影響

檢測各實驗組小鼠結(jié)腸組織中炎癥及抑炎因子的基因表達(dá)水平，定量評價小鼠結(jié)腸炎癥的程度。如圖9所示，模型組小鼠結(jié)腸組織相比對照組炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β基因表達(dá)水平顯著上調(diào)。蠟樣芽孢桿菌HMPM18123干預(yù)后顯著下調(diào)了小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子mRNA的表達(dá)水平，并且顯著提高了抑炎因子IL-10的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明蠟樣芽孢桿菌HMPM18123可以下調(diào)炎癥因子表達(dá)并上調(diào)抑炎因子表達(dá)減輕腸道炎癥反應(yīng)。

圖9 各實驗組小鼠結(jié)腸炎癥及抗炎因子基因的表達(dá)量Fig.9 Expression levels of pro-inflammatory and anti-inflammatory factor genes in colon tissues of mice in each experimental group

3 討論

16S rRNA基因序列對比是細(xì)菌鑒別和構(gòu)建細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹最有效的方法。然而由于16S rRNA序列過高的相似度，此方法在鑒定親緣關(guān)系較近的芽孢桿菌屬物種時往往難以奏效[22]。本研究在16S rRNA鑒定的基礎(chǔ)上，結(jié)合了保守的蛋白編碼基因和蠟樣芽孢桿菌特異性毒力基因鑒定方法將實驗室未知菌種鑒定為蠟樣芽孢桿菌，并且該菌株的形態(tài)學(xué)特性和生理生化指標(biāo)也與蠟樣芽孢桿菌一致。本研究從分子和生理生化兩個方面成功將分離菌鑒定為蠟樣芽孢桿菌，并命名為蠟樣芽孢桿菌HMPM18123?，F(xiàn)保存于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編碼為GDMCC 61838。在進(jìn)一步的生長特性測定實驗中發(fā)現(xiàn)，該菌株可以在4 ℃條件下快速繁殖，并且在60 ℃高溫下也能緩慢生長，恢復(fù)適宜溫度后還能恢復(fù)原有的繁殖速度，相較絕大多數(shù)蠟樣芽孢桿菌菌株具有更好的耐高溫特性[23]。另外，蠟樣芽孢桿菌HMPM18123還具有在胃液腸液中長時間存活的特性，這些特性為其在腸道穩(wěn)定定植發(fā)揮益生作用提供了前提條件。

近年來，IBD的治療策略逐漸舍棄了價格昂貴、副作用大、停藥后容易復(fù)發(fā)的傳統(tǒng)化學(xué)藥物。因此，安全廉價的益生菌制劑開始作為治療和預(yù)防IBD的藥物應(yīng)用于臨床。例如益生菌制劑VSL #3和大腸桿菌Nissle 1917在治療IBD方面已被證明具有不弱于美沙拉嗪的療效[24-25]，并已經(jīng)作為藥物投入市場。蠟樣芽孢桿菌被報道具有調(diào)節(jié)腸道微生物組成、改善腸道屏障功能、抗炎抗氧化的益生特性，并已廣泛應(yīng)用于改善動物健康[26]，但目前還缺少在IBD方向的報道。值得注意的是，部分蠟樣芽孢桿菌具有一定毒性，可能導(dǎo)致輕微的嘔吐和腹瀉。本研究鑒定的蠟樣芽孢桿菌也具有一些毒力基因，主要是以nhe和hbl為主的腸毒素基因，不存在嘔吐基因ces?，F(xiàn)已證明其安全性的蠟樣芽孢桿菌制劑擁有與蠟樣芽孢桿菌HMPM18123相似的毒力基因組成[27]，同時在動物實驗期間給予小鼠灌胃蠟樣芽孢桿菌，小鼠也未出現(xiàn)不良反應(yīng)。本研究使用DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型模擬人類的潰瘍性結(jié)腸炎，模型組小鼠臨床表現(xiàn)為體質(zhì)量衰減、DAI評分升高和結(jié)腸縮短，蠟樣芽孢桿菌干預(yù)后則可以明顯緩解小鼠結(jié)腸炎癥狀。蠟樣芽孢桿菌組的組織學(xué)病理評分也明顯低于模型組小鼠，具體表現(xiàn)為減輕DSS導(dǎo)致的隱窩缺失、炎癥細(xì)胞浸潤、黏膜損傷和黏膜下層薄壁水腫。

在IBD的發(fā)生和發(fā)展過程中，最主要的特征就是腸道炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量升高[28]。本研究采用real-time PCR方法檢測小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子的表達(dá)水平，結(jié)果顯示模型組小鼠結(jié)腸組織的炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-1β基因表達(dá)水平顯著上調(diào)，并且IL-1β相對表達(dá)量的上升幅度最大。已有研究報道炎癥因子IL-1β是IBD發(fā)病機(jī)制中最重要的炎癥因子，通過TLR4-NFκBNLRP3炎癥小體信號通路激活的IL-1β通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化加劇腸道炎癥[29-31]。近期研究也證明芽孢桿菌及其代謝產(chǎn)物可以通過阻斷NF-κB信號通路和NLRP3炎癥小體的激活，抑制IL-1β的活化，有效緩解腸道炎癥[32-33]，這與本實驗結(jié)果一致。而經(jīng)蠟樣芽孢桿菌HMPM18123干預(yù)后，炎癥因子的表達(dá)被顯著抑制，同時抑炎因子IL-10表達(dá)水平顯著上調(diào)。與炎癥因子對應(yīng)的抑炎因子IL-10由M2型巨噬細(xì)胞釋放，已被證明可以減輕腸道炎癥[34]。以上結(jié)果表明，蠟樣芽孢桿菌可以調(diào)控小鼠結(jié)腸組織炎癥因子和抑炎因子的表達(dá)，減輕腸道炎癥反應(yīng)，緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎。

本研究使用多種分子鑒定方法及生理生化鑒定方法成功鑒定出了1 株具有耐熱及胃液腸液耐受性質(zhì)的蠟樣芽孢桿菌，并通過DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型評價該菌株具有緩解小鼠結(jié)腸炎的功效，為今后開發(fā)蠟樣芽孢桿菌作為IBD的治療藥物提供了研究基礎(chǔ)。