雙調(diào)蛋白對(duì)支氣管肺發(fā)育不良模型小鼠肺泡分化的影響*

堯惠慈， 盧紅艷， 朱 玥， 喬 瑜， 季 瑋

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院兒科， 江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

支氣管肺發(fā)育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）是一種早產(chǎn)兒慢性肺部疾病，隨著圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，早產(chǎn)兒存活率提高，BPD的發(fā)病率也逐漸升高，其原因主要是發(fā)育中未成熟肺的損傷和修復(fù)之間的不平衡［1］。肺的發(fā)育主要通過(guò)上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞的相互作用介導(dǎo)，肺泡上皮由兩種形態(tài)與功能不同的細(xì)胞組成：Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞（type I alveolar epithelial cell， AECI）和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（type II alveolar epithelial cell， AECII）。平足蛋白（podoplanin， T1α）是AECI的標(biāo)志物［2］，肺表面活性蛋白C（surfactant protein C， SP-C）是AECII的標(biāo)志物［3］，在肺上皮損傷正常修復(fù)中，AECII增殖并分化為AECI以促進(jìn)肺泡結(jié)構(gòu)和氣血屏障形成，一旦出現(xiàn)分化障礙，肺損傷不可逆［4］。

目前認(rèn)為BPD主要為肺血管和肺泡生長(zhǎng)發(fā)育停滯［5］。長(zhǎng)期暴露于85%高氧的新生鼠肺泡腔擴(kuò)大，這表明存在肺發(fā)育受阻［6］。表皮生長(zhǎng)因子家族成員雙調(diào)蛋白（amphiregulin， AREG）在上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中均表達(dá)，能調(diào)節(jié)不同類型細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移，包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞［7］。有研究顯示，AREG可促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖［8］。在呼吸機(jī)相關(guān)急性肺損傷模型中，肺組織內(nèi)AREG表達(dá)上調(diào)，提示AREG表達(dá)升高可能參與呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷［9］。在產(chǎn)前煙霧暴露誘導(dǎo)的BPD小鼠模型中，支氣管和肺細(xì)胞受損可能與AREG-表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor， EGFR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)［10］。EGFR是具有多種配體的酪氨酸激酶受體，在上皮細(xì)胞中，EGFR的極化及其下游信號(hào)的激活在定向細(xì)胞遷移中起重要作用［11］。目前，在高氧暴露所致BPD小鼠模型中，AREG對(duì)肺泡分化的影響尚不明確，本研究通過(guò)建立高氧暴露所致BPD模型小鼠，探討AREG及EGFR在BPD小鼠肺組織中的動(dòng)態(tài)表達(dá)及AREG表達(dá)變化對(duì)肺泡分化的影響，以期為研究BPD肺泡化障礙機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 主要試劑

小鼠抗AREG多克隆抗體及重組小鼠AREG蛋白（recombinant AREG protein， rmAREG）購(gòu)自R&D；兔抗EGFR多克隆抗體及小鼠抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗SP-C多克隆抗體、山羊抗兔IgG及驢抗小鼠IgG均購(gòu)自Abcam；小鼠抗T1α單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；AREG慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因；PBS購(gòu)自HyClone。

2 主要方法

2.1 模型制備 SPF級(jí)孕16～17 d健康C57BL/6小鼠由江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-0053］。待小鼠出生后，將新生小鼠隨機(jī)分為空氣（normoxia， N）組和高氧（hyperoxia， H）組，利用高氧暴露復(fù)制小鼠BPD模型［12］。高氧組小鼠置于氧箱中，氧濃度為85%，空氣組置于同一室內(nèi)常壓空氣中；代母鼠每12 h在各組間更換一次，以避免氧中毒并排除不同組間代母鼠的影響，每日觀察小鼠情況并記錄。各組小鼠于空氣或高氧暴露后7 d和14 d吸入麻醉處死并分為7 d空氣（N7）組、7 d高氧（H7）組、14 d空氣（N14）組和14 d高氧（H14）組。取出肺組織，左肺組織用于制作石蠟切片，觀察免疫熒光檢測(cè)，右肺組織冰凍保存用于相關(guān)蛋白檢測(cè)。

2.2AREG過(guò)表達(dá)及敲低 取重組AREG蛋白5 μg溶于100 μL PBS中，于第10天給高氧暴露新生小鼠腹腔注射重組AREG蛋白（每只100 μL）實(shí)現(xiàn)AREG過(guò)表達(dá)［13］，對(duì)照組于相同時(shí)間注射相同劑量PBS，并分為rmAREG組和PBS組，每組各5只。取小鼠AREG小干擾RNA（small interfering RNA， siRNA）慢病毒表達(dá)載體溶液10 μL（載體濃度為3×1011TU/L），于第10天給高氧暴露新生小鼠鼻內(nèi)滴注，實(shí)現(xiàn)AREG敲低（AREG knockdown， KD）［14］，對(duì)照組于相同時(shí)間滴注相同劑量陰性對(duì)照（negative control， NC）載體溶液，并分為NC組和KD組，每組各5只，各組小鼠于高氧第14天處死并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 Western blot檢測(cè)肺組織中AREG、EGFR、SP-C及T1α的蛋白表達(dá) RIPA裂解液（含PMSF、蛋白酶抑制劑）提取各組肺組織總蛋白，按每泳道10 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，濕式電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉溶液37 ℃封閉1 h后，分別加入小鼠抗AREG多克隆抗體（1∶500）、兔抗EGFR多克隆抗體、小鼠抗T1α單克隆抗體、兔抗SP-C多克隆抗體和小鼠抗β-actin單克隆抗體（均1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜，分別以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（均1∶5 000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯色。以目的蛋白與內(nèi)參照β-actin蛋白條帶的灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)檢測(cè)SP-C/T1α表達(dá) 將肺組織切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后用5% BSA在37 ℃封閉20 min，并與兔多克隆抗SP-C抗體（1∶100稀釋）和小鼠單克隆抗T1α抗體（1∶100稀釋）的混合物在4 ℃下孵育過(guò)夜，切片用PBS洗3次后，與山羊抗兔Ⅱ抗和驢抗小鼠Ⅱ抗（1∶1 000稀釋）在37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗3次后，采用DAPI室溫避光染核，熒光倒置顯微鏡下觀察肺組織的熒光染色，ImageJ軟件分析陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及共定位。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad 8.0軟件繪制柱狀圖。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 高氧暴露BPD小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織中AREG、EGFR、T1α及SP-C的蛋白表達(dá)情況

與同時(shí)點(diǎn)空氣組相比，高氧組AREG、EGFR和T1α蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），SP-C蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。在空氣及高氧狀態(tài)下，AREG及EGFR蛋白表達(dá)隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)。見圖1。

Figure 1. The protein expression of AREG， EGFR， SP-C and T1α in lung tissues of normoxia and hyperoxia mice at different time points. N7： normoxia for 7 d； H7： hyperoxia for 7 d； N14： normoxia for 14 d； H14： hyperoxia for 14 d. Mean±SD. n=5.*P＜0.05， **P＜0.01 vs N7 group； #P＜0.05， ##P＜0.01 vs N14 group.圖1 空氣組及高氧組不同時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織中AREG、EGFR、SP-C及T1α的蛋白表達(dá)水平

2 高氧暴露BPD小鼠肺組織中SP-C和T1α免疫熒光共定位情況

采用肺上皮細(xì)胞標(biāo)志物SP-C和T1α蛋白進(jìn)行免疫熒光染色，綠色熒光為SP-C的陽(yáng)性表達(dá)，紅色熒光為T1α的陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色熒光為DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核，SP-C和T1α雙陽(yáng)性則呈橙色。免疫熒光結(jié)果顯示，相較于同時(shí)點(diǎn)空氣組，高氧組中SP-C和T1α共定位細(xì)胞顯著減少（P＜0.05，P＜0.01），見圖2。

Figure 2. Immunofluorescence staining of SP-C （green） and T1α （red） in lung tissues of normoxia and hyperoxia mice at different time points （scale bar=20 μm）.Blue indicates DAPI； arrows indicate SP-C and T1α positive cells. N7： normoxia for 7 d； H7： hyperoxia for 7 d； N14： normoxia for 14 d； H14： hyperoxia for 14 d. Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs N7 group；**P＜0.01 vs N14 group.圖2 空氣組及高氧組不同時(shí)點(diǎn)小鼠肺組織SP-C和T1α免疫熒光共定位情況

3 高氧暴露BPD小鼠過(guò)表達(dá)AREG后肺組織中AREG、EGFR、T1α及SP-C的蛋白表達(dá)情況

在高氧狀態(tài)下，腹腔注射rmAREG后，與PBS組相比，rmAREG組中AREG和EGFR蛋白表達(dá)顯著升高 （P＜0.01），而SP-C和T1α蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01），見圖3。

4 高氧暴露BPD小鼠過(guò)表達(dá)AREG后肺組織中SP-C和T1α免疫熒光共定位情況

在高氧狀態(tài)下，注射rmAREG后，rmAREG組中SP-C與T1α共定位細(xì)胞較PBS組顯著減少（P＜0.01），見圖4。

5 高氧暴露BPD小鼠敲低AREG后肺組織中AREG、EGFR、T1α及SP-C的表達(dá)情況

在高氧狀態(tài)下，小鼠鼻內(nèi)滴注AREG siRNA慢病毒表達(dá)載體溶液后，與NC組比較，KD組中AREG和EGFR蛋白表達(dá)顯著降低 （P＜0.01），而SP-C和T1α蛋白表達(dá)則顯著升高（P＜0.01），見圖5。

Figure 3. The protein expression of AREG， EGFR， SP-C and T1α in mice lung tissues after overexpression of AREG under hyperoxia. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs PBS group.圖3 高氧下過(guò)表達(dá)AREG后小鼠肺組織AREG、EGFR、SP-C及T1α的蛋白表達(dá)水平

6 高氧暴露BPD小鼠敲低AREG后肺組織中SP-C和T1α免疫熒光共定位情況

在高氧狀態(tài)下，小鼠鼻內(nèi)滴注AREG siRNA慢病毒表達(dá)載體溶液后，與NC組相比，KD組中SP-C與T1α共定位細(xì)胞顯著增多（P＜0.01），見圖6。

討 論

BPD是早產(chǎn)兒最常見的并發(fā)癥之一，其主要病理學(xué)特征是肺泡化受阻，表現(xiàn)為AECII向AECI分化障礙［10］。AREG在免疫調(diào)節(jié)中有重要作用，是參與炎癥細(xì)胞中肌成纖維細(xì)胞分化的驅(qū)動(dòng)因素［15］。本研究通過(guò)建立高氧暴露的BPD模型小鼠，過(guò)表達(dá)及敲低AREG并觀察其對(duì)肺泡分化的影響，結(jié)果顯示AREG抑制高氧暴露的BPD模型小鼠AECII向AECI分化。

Figure 4. Immunofluorescence staining of SP-C （green） and T1α （red） in mice lung tissues after overexpression of AREG under hyperoxia（scale bar=20 μm）. Blue indicates DAPI； arrows indicate SP-C and T1α positive cells. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs PBS group.圖4 高氧下過(guò)表達(dá)AREG后小鼠肺組織中SP-C和T1α免疫熒光共定位細(xì)胞情況

肺發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，可分為胚胎期、假腺體期、小管期、囊泡期和肺泡期［16］。在小管期和囊泡期階段，肺細(xì)胞開始分化，末端分支變窄并形成上皮囊，在出生后肺泡階段發(fā)育成肺泡［17］。BPD的主要病理變化發(fā)生在囊泡期和肺泡期，肺發(fā)育中斷，肺泡化過(guò)程受阻［18-19］。本研究通過(guò)對(duì)高氧暴露BPD模型小鼠肺上皮標(biāo)志物研究，觀察到與同時(shí)點(diǎn)空氣組相比，高氧組SP-C蛋白表達(dá)降低，T1α蛋白表達(dá)增加，提示高氧后AECII減少而AECI增加，但免疫熒光雙標(biāo)顯示SP-C與T1α共定位細(xì)胞并未增加，反而減少，提示高氧下AECII向AECI分化減少。由于實(shí)驗(yàn)條件所限，本研究未能對(duì)AECII進(jìn)行示蹤研究，但有研究通過(guò)對(duì)AECII進(jìn)行特殊標(biāo)記，觀察到在高氧狀態(tài)下，T1α的增多并不是由已標(biāo)記的AECII分化而來(lái)［20］，且有研究顯示，在高氧狀態(tài)下，盡管T1α蛋白表達(dá)增加，但在損傷修復(fù)時(shí)AECI功能受損，這可能與肺上皮緊密連接破壞以及氣血屏障受損有關(guān)［21］，結(jié)合本次研究結(jié)果，提示在高氧狀態(tài)下存在AECII向AECI分化障礙。

Figure 5. The protein expression of AREG， EGFR， SP-C and T1α in mice lung tissues after knockdown of AREG under hyperoxia. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs NC group.圖5 高氧下敲低AREG后小鼠肺組織中AREG、EGFR、SPC及T1α的蛋白表達(dá)水平

AREG在上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中作用的研究引起關(guān)注。Hillman等［22］研究顯示，在早產(chǎn)羔羊機(jī)械通氣期間，肺組織AREG表達(dá)隨著機(jī)械通氣時(shí)間增多而升高，并影響肺泡分化。本研究觀察到高氧組中AREG表達(dá)較同時(shí)點(diǎn)空氣組升高，提示AREG參與了BPD的病理生理過(guò)程。Zuo等［23］研究顯示，AREG可驅(qū)動(dòng)氣道上皮細(xì)胞向基質(zhì)細(xì)胞和黏膜細(xì)胞增生分化，但AREG是否參與BPD肺泡分化障礙尚不明確。

Figure 6. Immunofluorescence staining of SP-C （green） and T1α （red） in mice lung tissues after knockdown of AREG under hyperoxia（scale bar=20 μm）. Blue indicates DAPI； arrows indicate SP-C and T1α positive cells. Mean±SD. n=5. **P＜0.01 vs NC group.圖6 高氧下敲低AREG后小鼠肺組織SP-C和T1α的免疫熒光共定位情況

為進(jìn)一步探討AREG表達(dá)變化對(duì)高氧暴露BPD模型小鼠肺泡分化的影響，本研究通過(guò)腹腔注射rmAREG蛋白實(shí)現(xiàn)AREG過(guò)表達(dá)，鼻內(nèi)滴注AREG siRNA慢病毒表達(dá)載體溶液實(shí)驗(yàn)AREG敲低，并檢測(cè)肺組織中SP-C和T1α表達(dá)變化，觀察到過(guò)表達(dá)AREG后，SP-C蛋白及T1α蛋白表達(dá)減少，SP-C與T1α共定位細(xì)胞數(shù)顯著減少，表明BPD小鼠過(guò)表達(dá)AREG后AECII向AECI分化障礙加重。在肺慢性異體移植功能障礙的氣道重塑中，觀察到AREG主要定位于氣道上皮細(xì)胞，且過(guò)表達(dá)AREG后，出現(xiàn)纖毛細(xì)胞分化，纖維化增加［24］。而在西地那非治療的BPD模型大鼠中，AREG mRNA的表達(dá)降低，肺泡化障礙得以改善［25］。本研究顯示，敲低AREG后，SP-C和T1α蛋白表達(dá)增加，SP-C與T1α共定位細(xì)胞增多，也進(jìn)一步證實(shí)AREG減少可緩解高氧暴露BPD小鼠中AECII向AECI分化障礙。在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β誘導(dǎo)的肺纖維化發(fā)病機(jī)制中，AREG的沉默會(huì)降低成纖維細(xì)胞的增殖、肌成纖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化及膠原沉積［26］，在萘誘導(dǎo)的肺損傷模型中也顯示AREG是肺上皮黏液細(xì)胞化生的關(guān)鍵因子，AREG敲除后肺上皮黏液細(xì)胞化生得到緩解［27］，這與本研究一致，提示AREG可通過(guò)影響AECII向AECI分化參與BPD的發(fā)展。在病理狀態(tài)下，肺上皮細(xì)胞可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化為基質(zhì)成纖維細(xì)胞或肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致BPD的異常修復(fù)［28］，但AREG是否參與BPD上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化仍有待進(jìn)一步研究。

Lkhagvadorj等［10］研究表明，AREG/EGFR信號(hào)通路與受損的上皮細(xì)胞分化有關(guān)，作為AREG的受體，EGFR可調(diào)節(jié)肺損傷后細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移以及細(xì)胞間黏附［29］。本研究顯示高氧組EGFR表達(dá)升高，且隨著高氧時(shí)間的延長(zhǎng)，EGFR表達(dá)呈上升趨勢(shì)，提示在高氧狀態(tài)下，EGFR增多以響應(yīng)AREG/EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究觀察到過(guò)表達(dá)AREG后，EGFR蛋白表達(dá)升高，而敲低AREG后，EGFR蛋白表達(dá)降低，提示EGFR表達(dá)趨勢(shì)與AREG一致。Todd等［24］研究顯示，在肺移植后的氣道重塑中，AREG和EGFR轉(zhuǎn)錄組在組織中大量表達(dá)，且定位于富有纖維組織的氣道上皮細(xì)胞，也有研究觀察到脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的BPD大鼠模型中，EGFR的增加影響了肺肌成纖維細(xì)胞的定位，導(dǎo)致BPD中肺泡發(fā)育受阻［30］。綜合以上研究，推測(cè)AECII向AECI分化障礙與AREG/EGFR信號(hào)通路有關(guān)，該機(jī)制可能在BPD模型小鼠肺泡分化障礙機(jī)制中起重要作用，但仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究初步探討了AREG對(duì)BPD模型小鼠肺泡分化的影響，觀察到高氧暴露BPD模型小鼠肺組織AREG升高，AECII向AECI分化障礙；高氧下敲低AREG后，AECII向AECI分化障礙緩解，提示AREG參與了BPD模型小鼠肺泡分化障礙的病理生理過(guò)程，可能與AREG抑制AECII向AECI分化有關(guān)。本研究的局限性在于未能結(jié)合AECII示蹤技術(shù)探討肺上皮細(xì)胞分化，且僅通過(guò)腹腔注射外源性重組AREG蛋白及AREG慢病毒實(shí)現(xiàn)AREG過(guò)表達(dá)及敲低，未能通過(guò)基因敲除技術(shù)敲除小鼠AREG進(jìn)行研究，這些將在今后的研究中進(jìn)一步優(yōu)化。