毛蕊異黃酮抑制胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲并誘導(dǎo)凋亡*

杜亞青， 李向英， 張麗曉， 王云芳， 韓 敏

（邢臺(tái)市人民醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，河北 邢臺(tái) 054001）

隨著飲食和生活的不規(guī)律，我國(guó)胃癌（gastric cancer， GC）的發(fā)病率呈逐漸增加趨勢(shì)，且隨著人口老齡化，GC總例數(shù)也將快速增加［1］。盡管在過(guò)去的幾十年里，GC的治療取得了顯著的進(jìn)步，但5年生存率仍不理想［2］。因此，尋找新的有效的抗胃癌藥物是當(dāng)務(wù)之急。

中藥因其具有多靶點(diǎn)和低毒的作用，已廣泛應(yīng)用于治療多種腫瘤的治療中［3］。特別是，近期有報(bào)道稱(chēng)從天然藥物中提取的某些單體小分子不僅具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫的作用，甚至還能抑制腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell， CSC）的惡性生物學(xué)行為［4-5］。CSC是指在腫瘤中有具有自我更新且能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞群，其具有高致瘤性、強(qiáng)自我更新能力且其對(duì)目前常用的化療藥物極不敏感。毛蕊異黃酮（calycosin）是從黃芪提取出來(lái)的一種具有抗氧化、抗輻射和抗腫瘤等多種藥理活性的黃酮類(lèi)化合物［6-7］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮不僅能抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移［8］，還能增加胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑、阿霉素或5-氟尿嘧啶的敏感性［9］。而目前尚不清楚毛蕊異黃酮是否能對(duì)胃癌干細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，因此本研究評(píng)估了毛蕊異黃酮對(duì)胃癌干細(xì)胞增殖、遷移和侵襲以及凋亡的影響。

材料和方法

1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)試劑

AGS細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基和含谷氨酰胺-DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）；B27 （Invitrogen）；表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Peprotech）；牛血清白蛋白、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8 （CCK-8）、Annexin V- FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）（北京索萊寶科技有限公司）；胰島素（Novo Nordisk）；毛蕊異黃酮（上海源葉生物科技有限公司）；CD44、SOX9和OCT4抗體（南京巴傲得生物科技有限公司—Bioworld）；Bax、Bcl-2、Cyto-c、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9抗體（Abcam）；TUNEL染色試劑盒（紅色熒光）、線粒體/細(xì)胞質(zhì)分離試劑盒、GAPDH抗體、COX Ⅳ抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

2 方法

2.1 AGS細(xì)胞培養(yǎng)與AGS干細(xì)胞分離 將AGS細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)大量培養(yǎng)。然后將AGS通過(guò)成球培養(yǎng)，從中分離出AGS胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞（AGS-CSC）［10］。具體方法：AGS細(xì)胞以1×104的密度鋪板在超低粘附6孔板（康寧）中，用含2% B27、20 μg/L表皮生長(zhǎng)因子、10 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、0.4%牛血清白蛋白和5 mg/L胰島素和谷氨酰胺-DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 d向培養(yǎng)基中補(bǔ)液一次，并將細(xì)胞在培養(yǎng)基中維持7 d（觀察腫瘤球），并將腫瘤球解離成單細(xì)胞懸浮液，并重新培養(yǎng)7 d以再次獲得腫瘤球。將第2代腫瘤球，分散為單細(xì)胞，將此細(xì)胞（AGS-CSC）通過(guò)干細(xì)胞鑒定后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成情況 將AGSCSC細(xì)胞以每孔1 000細(xì)胞接種在6孔板中24 h。第2天起，將細(xì)胞與不同濃度（0、30、60和120 μmol/L）的毛蕊異黃酮一起孵育，并繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每3 d換液一次。用0.5%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色20 min，并對(duì)細(xì)胞集落拍照和計(jì)數(shù)。

2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）測(cè)定法評(píng)估毛蕊異黃酮對(duì)AGS-CSC細(xì)胞的細(xì)胞活性影響。步驟簡(jiǎn)述如下：將AGS-CSC細(xì)胞用不同濃度（0、30、60和120 μmol/L）的毛蕊異黃酮預(yù)處理30 min，然后按每孔1×104細(xì)胞接種到96孔板并培養(yǎng)24 h，隨后加入10 μL CCK-8溶液并繼續(xù)孵育2 h，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將AGS-CSC細(xì)胞用不同濃度（0、30、60和 120 μmol/L）的毛蕊異黃酮預(yù)處理 30 min，鋪板在6孔板中，然后用20 μL移液槍頭劃痕，用PBS洗2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，拍攝圖像。

2.5 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估細(xì)胞遷移和侵襲。將AGS-CSC細(xì)胞用不同濃度（0、30、60和 120 μmol/L）的毛蕊異黃酮預(yù)處理 30 min，收獲細(xì)胞，然后用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基分別調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L。各取100 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室（其中，鋪有基底膠的Transwell小室用于檢測(cè)細(xì)胞侵襲，未鋪基底膠的Transwell小室用于檢測(cè)細(xì)胞遷移），同時(shí)，將底室加600 μL含有10%FBS的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，擦除Transwell小室濾膜上表層的細(xì)胞，用0.2%結(jié)晶紫對(duì)穿至濾膜下表層的細(xì)胞染色，使用顯微鏡觀察并拍照，并計(jì)數(shù)。

2.6 細(xì)胞凋亡分析 將AGS-CSC細(xì)胞接種在6孔板中，用不同濃度（0、30、60和120 μmol/L）的毛蕊異黃酮24 h。然后分別用Hoechst 33342/TUNEL雙重染色免疫熒光觀察TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞以及Annexin VFITC/PI雙重染色流式細(xì)胞術(shù)檢凋亡細(xì)胞數(shù)的方法評(píng)估毛蕊異黃酮對(duì)AGS-CSC細(xì)胞凋亡的影響。方法簡(jiǎn)述如下：

Hoechst 33342/TUNEL雙重染色免疫熒光法：用PBS洗滌細(xì)胞兩次，然后用4%多聚甲醛固定20 min，洗滌后，用含0.3% Triton X-100對(duì)細(xì)胞打孔（5min），再次洗滌后，用100 μL TUNEL檢測(cè)工作液孵育30 min，PBS洗滌后，加入Hoechst 33342染核5 min，熒光顯微鏡下觀察。

Annexin V- FITC/PI雙重染色流式細(xì)胞術(shù)：用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞倆次，加入200 μL結(jié)合液再次懸浮細(xì)胞一次，避光下加入5 μL Annexin V- FITC染色液室溫5 min，加入10 μL PI染色液室溫10 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2.7 線粒體膜電位評(píng)估 通過(guò)JC-1染色評(píng)估線粒體膜電位。將AGS-CSC細(xì)胞接種在6 孔板中，用不同濃度（0、30、60和120 μmol/L）的毛蕊異黃酮處理24 h，吸出培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞一次，加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，然后加入1 mL JC-1染色工作液并充分混合并于37°C下孵育20 min。 孵育后，吸出上清液并用JC-1染色緩沖液洗滌兩次，加入2 mL培養(yǎng)基，在熒光顯微鏡下觀察，拍照。

2.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 分別用RIPA裂解緩沖液和線粒體/細(xì)胞質(zhì)分離試劑盒提取細(xì)胞總蛋白和線粒體蛋白/細(xì)胞質(zhì)蛋白，并用BCA法對(duì)蛋白濃度進(jìn)行定量。取等量蛋白樣品在8～12% SDS-PAGE上分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在5%脫脂乳中封閉后，將膜與分別與Ⅰ抗［Cyt C、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9均為1∶1 000稀釋?zhuān)籅ax、Bcl-2、CD44、SOX9、OCT4和COX Ⅳ均為1∶2 000稀釋?zhuān)籊APDH為1∶8 000稀釋?zhuān)菰? ℃下孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌后，室溫孵育HRP-山羊抗兔IgG （H+ L）（1∶2 000稀釋?zhuān)? h。再次洗滌后，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑使條帶顯像，并用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用ImageJ軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。以GAPDH作為總蛋白和細(xì)胞質(zhì)蛋白內(nèi)參照，COX Ⅳ作為線粒體蛋白的內(nèi)參照；蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參條帶灰度值×100%。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次。所有結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD），并使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行分析。用t檢驗(yàn)對(duì)兩組間數(shù)據(jù)比較；用單因素方差分析比較多組間數(shù)據(jù)差異，用Bonferroni法對(duì)各組均數(shù)進(jìn)行兩兩比較；P＜0.05則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AGS-CSC的鑒定

成球?qū)嶒?yàn)的結(jié)果如圖1A所示，進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)了干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物CD44、SOX9和OCT4的表達(dá)，結(jié)果顯示，與AGS細(xì)胞相比，AGS來(lái)源的胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞AGS-CSC的干細(xì)胞標(biāo)志物蛋白水平均顯著增加（圖1B）。

Figure 1. Identification and culture of gastric cancer stem celllike cell line AGS-CSC. A： representative image of sphere formation assay（×100）； B： protein detection of stem cell-related markers.圖1 胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞AGS-CSC的鑒定

2 毛蕊異黃酮抑制AGS-CSC的增殖

隨后，我們利用得到的AGS-CSC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并在0、30、60和120 μmol/L的濃度的毛蕊異黃酮刺激下檢測(cè)細(xì)胞的集落形成和細(xì)胞活性。如圖2所示，隨著毛蕊異黃酮濃度的升高，AGS-CSC的集落形成數(shù)顯著降低，細(xì)胞活性也顯著降低，至濃度為120 μmol/L時(shí)，集落形成數(shù)和細(xì)胞活性達(dá)到最低（P＜0.01），此實(shí)驗(yàn)證實(shí)，毛蕊異黃酮以劑量依賴(lài)性的方式抑制AGS-CSC細(xì)胞的增殖。

3 毛蕊異黃酮抑制AGS-CSC細(xì)胞的遷移和侵襲

通過(guò)細(xì)胞劃痕愈合和Transwell實(shí)驗(yàn)評(píng)估AGSCSC的遷移和侵襲能力。如劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（圖3A）所示，毛蕊異黃酮可劑量依賴(lài)性方式抑制AGS-CSC細(xì)胞的遷移，同樣在Transwell遷移測(cè)定中觀察到類(lèi)似的結(jié)果（圖3B）。此外，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)（圖3C）顯示可劑量依賴(lài)性方式抑制AGS-CSC細(xì)胞的侵襲。以上實(shí)驗(yàn)證明毛蕊異黃酮能抑制AGS-CSC細(xì)胞的遷移和侵襲。

4 毛蕊異黃酮促進(jìn)AGS-CSC細(xì)胞的凋亡

采用TUNEL染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度的毛蕊異黃酮對(duì)AGS-CSC細(xì)胞凋亡水平的影響，結(jié)果顯示，與0 μmol/L組比較，AGS-CSC細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（圖4A）和凋亡比例（圖4B）以劑量依賴(lài)性方式隨毛蕊異黃酮?jiǎng)┝康脑黾佣黾樱≒＜0.01）。

5 毛蕊異黃酮對(duì)AGS-CSC細(xì)胞線粒體膜電位及線粒體通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Figure 2. Calycosin inhibited the proliferation of AGS-CSC cells. A： representative images of colony formation assay of AGS-CSC after application of different concentrations of calycosin； B： statistical results of relative colony number of AGS-CSC cells；C： CCK-8 assay was used to detect the cell viability of AGS-CSC under different concentrations of calycosin. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖 2 毛蕊異黃酮抑制AGS-CSC細(xì)胞的增殖

JC-1染色（圖5A）顯示，線粒體膜電位隨著毛蕊異黃酮處理劑量的增加而降低。隨后，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)研究了線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平是否受毛蕊異黃酮的影響，如圖5B～D所示，毛蕊異黃酮以劑量依賴(lài)性上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，增加細(xì)胞色素C的釋放，并增加cleaved caspase-3和-9的表達(dá)水平（P＜0.05或P＜0.01）。

討 論

胃癌的化療失敗在很大程度上與胃癌分期、化療藥物耐藥、化療不良反應(yīng)和毒副作用等因素有關(guān)［11］。其中，CSC是化療耐藥特別是繼發(fā)性腫瘤的化療耐藥的原因之一，且其也與腫瘤的復(fù)發(fā)以及不良預(yù)后密切相關(guān)［12］。據(jù)報(bào)道CSC對(duì)目前常用的化療藥物不敏感［12-13］，因此，尋找抑制胃癌CSC的藥物對(duì)胃癌的治療具有重要意義。中藥在腫瘤的治療中不僅能發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫作用，甚至還具有直接治療、增加化療療效的作用，特別是，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的某些中藥單體還具有抑制CSC的作用［3-5］。毛蕊異黃酮作為一種從名貴中藥材黃芪中提取的黃酮類(lèi)化合物，其被證明在胃癌細(xì)胞中不僅能發(fā)揮抗腫瘤作用還具有對(duì)化療藥物的增敏作用，但目前并不清楚其是否能對(duì)胃癌干細(xì)胞發(fā)揮抑制作用［8-9］。本研究通過(guò)成球培養(yǎng)方法從AGS細(xì)胞系中獲得AGS來(lái)源的胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞AGS-CSC，并且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮能抑制AGS-CSC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并能促進(jìn)其凋亡，說(shuō)明毛蕊異黃酮具有抑制AGS-CSC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的能力。

本研究進(jìn)一步探討了毛蕊異黃酮抑制AGS-CSC細(xì)胞命運(yùn)的機(jī)制。影響細(xì)胞凋亡的途徑主要有線粒體途徑、死亡配體途徑和穿孔素/顆粒酶途徑等，其中線粒體途徑是最主要的凋亡途徑（約占90%）［14］。越來(lái)越多的證據(jù)［15-17］表明，毛蕊異黃酮在多種腫瘤細(xì)胞中可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)、Wnt信號(hào)或p38信號(hào)上調(diào) Bax/Bcl2比率，進(jìn)一步增加線粒體極化，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。且已有文獻(xiàn)［18-19］報(bào)道，毛蕊異黃酮可通過(guò)p活化的線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)人骨肉瘤和肝癌細(xì)胞的凋亡。因此，在本研究中， 我們研究了毛蕊異黃酮對(duì)AGS-CSC細(xì)胞的線粒體凋亡途徑的影響。本研究顯示毛蕊異黃酮能上調(diào)Bax，并下調(diào)Bcl-2表達(dá)，進(jìn)一步降低線粒體膜電位和細(xì)胞色素C釋放，促進(jìn)凋亡執(zhí)行蛋白cleaved caspase-9和3的表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。此外，本研究還具有一定的局限性，比如，毛蕊異黃酮如何與膜表面受體結(jié)合進(jìn)入AGS-CSC，然后通過(guò)何種途徑激活的線粒體凋亡途徑，還有，毛蕊異黃酮對(duì)其他胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞是否也具有一致的抑制作用，這些都需要進(jìn)一步確定。

Figure 3. Calycosin inhibited the migration and invasion of AGS-CSCs cells. A： representative images （×40） and statistical results of wound-healing assay of AGS-CSC cells； B： representative images（×200） and statistical results of Transwell migration assay of AGS-CSC cells； C： representative images （×400） and statistical results of Transwell invasion assay of AGS-CSC cells. Mean±SD. n=3. *P＜0.05， **P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖3 毛蕊異黃酮抑制AGS-CSC細(xì)胞的遷移和侵襲

總之，本研究顯示，毛蕊異黃酮可抑制AGS-CSC增殖、侵襲與遷移并能促進(jìn)其凋亡，且能激活線粒體凋亡途徑。這些結(jié)果提示，毛蕊異黃酮不僅是潛在的抗胃癌藥劑，且其可能還能抑制胃癌干細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

Figure 5. Effects of calycosin on mitochondrial apoptosis pathway in AGS-CSC cells. A： representative JC-1 staining images of GSCSC cells （×400） and statistical results of mitochondrial membrane potential； B， C and D： Western blot was used to detect the effect of calycosin on the expression of mitochondrial apoptosis pathway-related proteins. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 μmol/L group.圖5 毛蕊異黃酮對(duì)AGS-CSC細(xì)胞線粒體凋亡通路的影響