基于JAK1/STAT3信號通路探討壽胎丸含藥血清對人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞增殖、侵襲和遷移的影響

牟珍妮，申思楠，唐麗，劉瑩蝶，周紫薇，雷磊

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410021

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是妊娠常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率約1%～5%[1]，其發(fā)病機制復(fù)雜，目前仍有40%～60%患者病因不明[2]，稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（URSA）。雖然URSA確切病因仍不清楚，但一般認為絨毛外滋養(yǎng)層（extravillous trophoblast，EVT）細胞功能缺陷導(dǎo)致的螺旋動脈重塑受損是其病因之一[3]。EVT細胞增殖及向子宮蛻膜層和肌層血管進一步侵襲、遷移、分化，啟動并完成血管重塑，是建立母胎循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。JAK1/STAT3信號通路參與細胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)等重要生理過程[5]，是RSA發(fā)病重要的通路之一[6]。

壽胎丸出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》，有補腎安胎作用。臨床研究表明，壽胎丸聯(lián)合西藥治療URSA臨床效果顯著優(yōu)于單純西藥[7-8]。前期基礎(chǔ)研究也表明，壽胎丸可通過調(diào)節(jié)RSA小鼠蛻膜蛋白及代謝物水平改善RSA 妊娠結(jié)局[9-11]。本研究以人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/Svneo為研究對象，從JAK1/STAT3通路探討壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲和遷移的影響，明確其治療RSA的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物和細胞

SPF級雌性SD大鼠16只，體質(zhì)量220～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，溫度（22±2）℃，濕度（50±5）%，自由飲食飲水，光照/黑暗周期12 h。本實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準（LL2021032501）。人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞HTR-8/Svneo，購于上海美灣生物科技有限公司，貨號C1016。

1.2 藥物及試劑

壽胎丸（炒菟絲子12 g，桑寄生6 g，續(xù)斷6 g，阿膠6 g），飲片購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，經(jīng)藥劑科主任戴冰教授鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》要求。采用水提醇沉法制備，濃縮成原藥材濃度為2 g/mL。

胎牛血清、無血清非程序凍存液、RPMI1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素（雙抗）、0.25%胰蛋白酶、PBS（武漢普諾賽科技有限公司，批號分別為164210-50、PB180438、PM150110、PB180120、PB180226、PB180327），CCK8試劑盒（上海碧云天生物生物技術(shù)有限公司，批號C0039），matrigel 基底膜膠（美國Corning公司，批號356234），0.1%結(jié)晶紫染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號G1063），BCA蛋白濃度測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-BC-K318-M），RIPA裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0013B），Janus激酶1（JAK1）、p-JAK1、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、p-STAT3、Ki67、微染色體維持蛋白2（MCM2）、增殖核抗原（PCNA）抗體（美國Affinity Biosciences公司，批號分別為AF5012、AF2012、AF6294、AF3293、AF0198、AF0206、AF0239），血管內(nèi)皮細胞生長因子受體（VEGFR）-2 抗體（英國Abcam 公司，批號ab39638），基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 抗體、辣根過氧化物酶標記二抗（美國Proteintech，批號分別為10375-2-AP、SA00001-2），超純總RNA 提取試劑盒（杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，批號5003050），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR染料（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，批號分別為E047、E096）。

1.3 儀器

Series 8000 WJ 型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司），OSE-DB-02型加熱型五段程控金屬?。ū本┨旄萍加邢薰荆?，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），Heraeus Fresco 17型超速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司），Axio Vert.A1型倒置顯微鏡（德國Zeiss公司），Cytation3 型多功能酶標儀（美國Bio-Tek 公司），T100TMThermal Cycler型RT-PCR儀（美國Bio-Rad公司），Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽（美國Bio-Rad公司），SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備

16只大鼠隨機分為空白組和壽胎丸組，每組8只。壽胎丸組每日灌胃壽胎丸藥液（2 g/mL）20.25 g/kg，空白組每日灌胃等量生理鹽水，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，腹主動脈無菌采血，3 000 r/min離心20 min，取上層血清，同組血清合并混勻，密封后置于56 ℃水浴鍋滅活30 min。超凈工作臺內(nèi)經(jīng)0.22 μm無菌微孔濾膜過濾后，分裝于1.5 mL無菌EP管，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞培養(yǎng)

HTR-8/Svneo細胞用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI1640完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，當細胞融合至80%以上且細胞狀態(tài)良好時，棄上清液，PBS清洗細胞2～3次，向培養(yǎng)皿中加入0.25%胰蛋白酶1 mL消化傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 細胞分組及存活率檢測

取對數(shù)生長期HTR-8/Svneo細胞，胰蛋白酶消化后細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×104個/mL，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS清洗1～2次，將細胞分為對照組（10%空白血清）和壽胎丸低（2.5%壽胎丸含藥血清+7.5%空白血清）、中（5%壽胎丸含藥血清+5%空白血清）、高（10%壽胎丸含藥血清）劑量組，每組5個復(fù)孔，分別加入提前配好的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12、24、36 h。棄去培養(yǎng)基，加入CCK8反應(yīng)液（RPMI1640培養(yǎng)基∶CCK8試劑=10∶1）110 μL，培養(yǎng)箱反應(yīng)2 h，酶標儀波長450 nm檢測各孔OD值，以只加培養(yǎng)基孔調(diào)零，計算存活率。存活率（%）=（實驗組OD值-調(diào)零孔OD值）/（對照組OD值-調(diào)零孔OD值）×100%。

2.4 細胞劃痕實驗

將6孔板背面用馬克筆劃出3條對稱橫線，取對數(shù)生長期HTR-8/Svneo細胞，胰蛋白酶消化后細胞計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整細胞密度為2.5×105個/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長至80%左右時，每孔中央用1 mL槍頭做垂直劃痕，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗2～3次，按“2.3”項下方法分組，每組3個復(fù)孔，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別在0、36 h拍照記錄。用Image J 2x軟件進行劃痕寬度分析，計算劃痕愈合率，評價各組細胞橫向遷移能力。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕寬度-36 h劃痕寬度）÷0 h劃痕寬度×100%。

2.5 Transwell實驗

2.5.1 縱向遷移能力

取對數(shù)生長期HTR-8/Svneo細胞，以5×105個/孔接種于6孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按“2.3”項下方法分組，每組3個復(fù)孔，分別加入相應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，胰蛋白酶消化細胞，用空白培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞密度為2×105個/mL，每組取200 μL細胞懸液加至Transwell 上室，另將含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基500 μL加至下室，繼續(xù)培養(yǎng)36 h。將細胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，顯微鏡下觀察，隨機選取3個視野對遷移細胞進行計數(shù)，計算細胞遷移率（實驗組遷移細胞數(shù)÷對照組遷移細胞數(shù)×100%）。

2.5.2 侵襲能力

將基質(zhì)膠于冰上融化，使用空白培養(yǎng)基將基質(zhì)膠稀釋8 倍，取50 μL 加入Transwell 上室，37 ℃凝固30 min，將細胞懸液加至鋪有基質(zhì)膠的上室中，其余操作步驟同“2.5.1”，計算細胞侵襲率（實驗組侵襲細胞數(shù)÷對照組侵襲細胞數(shù)×100%）。

2.6 Western blot檢測

細胞按“2.3”項下方法分組處理36 h后，棄去原培養(yǎng)基，PBS 沖洗1～2 次，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 500 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白上樣，凝膠電泳分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，TBST洗膜3次，分加入JAK1一抗（1∶2 000）、p-JAK1 一抗（1∶2 000）、STAT3 一抗（1∶2 000）、p-STAT3 一抗（1∶2 000）、Ki67 一抗（1∶2 000）、VEGFR-2 一抗（1∶750）、MMP-9 一抗（1∶3 000）、MCM2 一抗（1∶3 000）、PCNA 一抗（1∶3 000），4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，滴加二抗（1∶10 000），37 ℃震蕩孵育60 min，TBST洗膜3次，加ECL顯色液顯色，曝光并采集圖像，用Image Lab軟件分析蛋白灰度值。

2.7 RT-PCR檢測

細胞按“2.3”項下方法分組處理36 h后，棄去原培養(yǎng)基，加入Trizol 提取總RNA，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)說明書進行PCR，反應(yīng)條件：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s，58 ℃、5 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。引物序列見表1。

表1 各基因PCR引物序列

3 統(tǒng)計學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo 細胞存活率的影響

培養(yǎng)12 h，與對照組和壽胎丸低劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞存活率顯著升高（P<0.05）。培養(yǎng)24 h，與對照組比較，壽胎丸低、中、高劑量組細胞存活率均顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與壽胎丸低、中劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞存活率顯著升高（P<0.01）。培養(yǎng)36 h，與對照組比較，壽胎丸低、中、高劑量組細胞存活率均顯著升高（P<0.01）；與壽胎丸低劑量組比較，壽胎丸中、高劑量組細胞存活率顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與壽胎丸中劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞存活率顯著升高（P<0.01）。見表2。培養(yǎng)36 h細胞存活率升高最明顯，故后續(xù)實驗選擇36 h作為干預(yù)時間。

表2 各組HTR-8/Svneo細胞不同時點存活率比較（，%）

表2 各組HTR-8/Svneo細胞不同時點存活率比較（，%）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與壽胎丸低劑量組比較，#P<0.05，##P<0.01；與壽胎丸中劑量組比較，▲▲P<0.01

4.2 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo 細胞橫向遷移能力的影響

與對照組比較，壽胎丸中、高劑量組細胞劃痕愈合率顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與壽胎丸低劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞劃痕愈合率顯著升高（P<0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組HTR-8/Svneo細胞劃痕愈合情況（×100）

表3 各組HTR-8/Svneo細胞橫向遷移能力比較（）

表3 各組HTR-8/Svneo細胞橫向遷移能力比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與壽胎丸低劑量組比較，#P<0.05

4.3 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo 細胞縱向遷移能力的影響

與對照組比較，壽胎丸低、中、高劑量組細胞遷移率顯著升高（P<0.01）；與壽胎丸低、中劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞遷移率顯著升高（P<0.01）。見圖2、表4。

圖2 各組HTR-8/Svneo細胞縱向遷移情況（結(jié)晶紫染色，×200）

表4 各組HTR-8/Svneo細胞遷移率比較（，%）

表4 各組HTR-8/Svneo細胞遷移率比較（，%）

注：與對照組比較，**P<0.01；與壽胎丸低劑量組比較，##P<0.01；與壽胎丸中劑量組比較，▲▲P<0.01

4.4 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo 細胞侵襲能力的影響

與對照組比較，壽胎丸低、中、高劑量組細胞侵襲率顯著升高（P<0.01）；與壽胎丸低、中劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞侵襲率顯著升高（P<0.01）。見圖3、表5。

圖3 各組HTR-8/Svneo細胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×200）

表5 各組HTR-8/Svneo細胞侵襲率比較（，%）

表5 各組HTR-8/Svneo細胞侵襲率比較（，%）

注：與對照組比較，**P<0.01；與壽胎丸低劑量組比較，##P<0.01；與壽胎丸中劑量組比較，▲▲P<0.01

4.5 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo 細胞JAK1/STAT3通路蛋白表達的影響

與對照組比較，壽胎丸高劑量組細胞p-JAK1、p-STAT3蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與壽胎丸低劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞p-JAK1蛋白表達顯著升高（P<0.05）。見圖4、表6。

表6 各組HTR-8/Svneo細胞JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較（）

表6 各組HTR-8/Svneo細胞JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05；與壽胎丸低劑量組比較，#P<0.05

圖4 各組HTR-8/Svneo細胞JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3蛋白免疫印跡

4.6 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo 細胞增殖相關(guān)蛋白表達的影響

與對照組比較，壽胎丸中、高劑量組細胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；與壽胎丸低劑量組比較，壽胎丸中劑量組細胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9 蛋白表達顯著升高，壽胎丸高劑量組細胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白表達顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。見圖5、表7。

圖5 各組HTR-8/Svneo細胞Ki67、VEGFR-2、MMP-9、MCM2、PCNA蛋白免疫印跡

表7 各組HTR-8/Svneo細胞增殖相關(guān)蛋白表達比較（）

表7 各組HTR-8/Svneo細胞增殖相關(guān)蛋白表達比較（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與壽胎丸低劑量組比較，#P<0.05，##P<0.01

4.7 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo細胞Ki67、增殖核抗原mRNA表達的影響

與對照組比較，壽胎丸低、中、高劑量組細胞Ki67、PCNA mRNA 表達顯著升 高（P<0.05，P<0.01）；與壽胎丸低劑量組比較，壽胎丸中劑量組細胞Ki67 mRNA表達顯著升高（P<0.05），壽胎丸高劑量組細胞Ki67、PCNA mRNA表達顯著升高（P<0.01）；與壽胎丸中劑量組比較，壽胎丸高劑量組細胞Ki67、PCNAmRNA表達顯著升高（P<0.01）。見表8。

表8 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo細胞Ki67、PCNA mRNA表達的影響（）

表8 壽胎丸含藥血清對HTR-8/Svneo細胞Ki67、PCNA mRNA表達的影響（）

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與壽胎丸低劑量組比較，#P<0.05，##P<0.01；與壽胎丸中劑量組比較，▲▲P<0.01

5 討論

RSA屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，首見于《葉氏女科證治》“妊娠有三月而墮者，有六七月而墮者，有屢孕屢墮者，由于氣血不足，名曰滑胎”。中醫(yī)學(xué)認為，滑胎由腎虛沖任虛衰、胎失所養(yǎng)，胎結(jié)不實所致，故常用補腎安胎法防治RSA[12]。作為補腎安胎代表方，壽胎丸一直沿用至今，臨床療效確切[13]。該方由炒菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、阿膠組成。菟絲子養(yǎng)陰通絡(luò)，守而能走，補腎養(yǎng)精，益陰而固陽；桑寄生補肝腎，養(yǎng)血而固沖任，安胎；續(xù)斷甘溫助陽，補益肝腎，調(diào)理沖任，有固本安胎之功；阿膠補陰血，止血。四藥合用，共奏補腎安胎功效。

人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞來自外胚層，是母胎界面重要的調(diào)節(jié)細胞，在早期胚胎植入和免疫調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用[14]。滋養(yǎng)細胞增殖、遷移和侵襲功能的正常發(fā)揮是螺旋動脈重構(gòu)的必要條件，也是人類胚胎著床和胎盤形成的重要步驟。螺旋動脈重構(gòu)是由血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞沿子宮螺旋動脈壁上游移動，取代內(nèi)皮細胞并破壞肌層內(nèi)膜，直接影響妊娠結(jié)局[15-16]。一旦滋養(yǎng)細胞功能發(fā)生障礙，可致子宮螺旋動脈重構(gòu)受損，引發(fā)不良妊娠結(jié)局，包括妊娠丟失、先兆子癇、宮內(nèi)生長受限及早產(chǎn)等[14，16]。本研究采用CCK8實驗發(fā)現(xiàn)，HTR-8/Svneo細胞存活率隨壽胎丸含藥血清濃度升高而升高，且在干預(yù)36 h時效果最佳。故后續(xù)以36 h為干預(yù)時間，分別進行細胞劃痕實驗、Transwell遷移及侵襲實驗。結(jié)果表明，隨著壽胎丸含藥血清濃度升高，HTR-8/Svneo細胞遷移、侵襲能力增強，說明壽胎丸含藥血清在一定濃度范圍內(nèi)可提高HTR-8/Svneo細胞生理功能。

滋養(yǎng)細胞的侵襲是一個復(fù)雜過程，涉及基質(zhì)細胞、腺體、動脈、巨噬細胞和蛻膜自然殺傷細胞的相互作用[17]。MMPs在滋養(yǎng)細胞侵襲子宮蛻膜的過程中發(fā)揮重要作用[18]。Plaks等[19]研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9缺失小鼠胚胎植入后不久表現(xiàn)出滋養(yǎng)層分化和侵襲缺陷，以及宮內(nèi)生長受限或胚胎死亡。本研究結(jié)果顯示，隨壽胎丸含藥血清濃度升高，MMP-9蛋白表達也有所升高，推測壽胎丸含藥血清可能通過上調(diào)MMP-9表達促進HTR-8/Svneo細胞侵襲能力。

Ki67、PCNA、MCM2是細胞增殖的分子標志物。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在胚胎發(fā)育的血管形成過程中起關(guān)鍵作用。VEGFR-2是一種在血管內(nèi)皮細胞膜上表達的VEGFR[20]，其與VEGF 結(jié)合可促進細胞增殖，還可提高增強細胞遷移的整合素水平。本研究結(jié)果顯示，Ki67、PCNA 蛋白和mRNA 表達及MCM2、VEGFR-2蛋白表達均隨壽胎丸含藥血清濃度增加而升高，提示壽胎丸含藥血清可能通過上調(diào)Ki67、PCNA、MCM、VEGFR-2 等細胞增殖相關(guān)分子表達，促進HTR-8/Svneo細胞增殖和遷移能力。

JAK/STAT信號通路是參與細胞增殖、分化的重要信號通路之一。由接收信號的酪氨酸激酶相關(guān)受體、傳遞信號的酪氨酸激酶JAK 和產(chǎn)生效應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子STAT三部分構(gòu)成[21]。當多種細胞因子與受體結(jié)合后，可以激活JAK，磷酸化下游靶蛋白的酪氨酸殘基，招募并磷酸化轉(zhuǎn)錄因子STAT，使其以二聚體的形式進入細胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄輸出信號，進而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡等過程[22]。研究表明，激活JAK/STAT 通路可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移[23-24]。此外，JAK/STAT通路在胚胎著床中也發(fā)揮重要作用。STAT1和STAT3的磷酸化與胚胎植入密切相關(guān)[25]，敲除STAT3 基因的小鼠妊娠第7 日胚胎即死亡[26]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)壽胎丸含藥血清處理后，細胞p-JAK1、p-STAT3蛋白表達升高，表明壽胎丸含藥血清可激活JAK1/STAT3信號通路。

綜上所述，壽胎丸含藥血清能促進HTR-8/Svneo細胞增殖、侵襲和遷移能力，且呈濃度依賴性，其機制是通過激活JAK1/STAT3信號通路實現(xiàn)。本研究為壽胎丸治療RSA提供實驗依據(jù)，后期將繼續(xù)在動物及臨床研究層面深入挖掘壽胎丸治療RSA的作用機制，以為經(jīng)典名方的應(yīng)用及推廣提供參考。