紅景天苷對脂多糖所致癡呆小鼠Tau蛋白過度磷酸化的作用

王 翔，杜明奧，徐國友，李 菲，李明剛

(1.遵義市播州區(qū)人民醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義 563100；2.遵義醫(yī)科大學 藥學院藥理學教研室，貴州 遵義 563099)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是最常見的與年齡密切相關的神經(jīng)退行性疾病，占全球癡呆總數(shù)的60%～70%。主要臨床表現(xiàn)為記憶和認識功能的逐漸下降，包括語言、視覺和空間感覺、執(zhí)行能力等受損[1-2]。AD腦內的主要病理特征包括兩種異常結構：細胞外β淀粉樣蛋白(Amyloid beta，Aβ)沉積形成的老年斑和細胞內Tau蛋白過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(Neurofibrillary tangles，NFTs)。Aβ是由跨膜淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)經(jīng)系列酶切而成；Tau蛋白是參與微管穩(wěn)定的微管相關蛋白，發(fā)生過度磷酸化后與微管解離并聚集形成成對的螺旋絲結構和NFTs[1-2]。Aβ沉淀而成的斑塊和Tau蛋白形成的纖維纏結是導致神經(jīng)元損傷和記憶、認知等功能下降的直接原因，與AD的行為異常密切相關。但因AD病因復雜，發(fā)病機制尚未完全確定。其中炎癥反應在AD發(fā)病中的作用備受關注，神經(jīng)炎癥促進Tau蛋白纏結形成具有神經(jīng)毒性的NFTs，而聚集的Tau蛋白又加劇了神經(jīng)炎癥反應，形成了相互加劇的惡性環(huán)路[3]。干擾該環(huán)路的環(huán)節(jié)對于減輕AD病理損傷具有良好的研究前景。

藏藥紅景天(Rhodiola rosea L.)性平、味寒、甘、澀，具有益智養(yǎng)心等功效，在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、皮膚等方面具有廣泛的應用[4]。紅景天苷是其主要活性成分，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷可減緩Aβ所致的神經(jīng)毒性作用[5]，通過抑制細胞焦亡用于緩解帕金森病[6]，通過抑制炎癥反應用于AD和血管性癡呆的防治[7-8]，但關于紅景天苷對AD病理特征Tau蛋白過度磷酸化的影響研究較少?？紤]到神經(jīng)炎癥在AD發(fā)展過程中的重要作用，本實驗采用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射以誘導小鼠出現(xiàn)記憶和認知功能下降，神經(jīng)元損傷等，模擬AD主要的臨床及病理表現(xiàn)，以此探索紅景天苷的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組和模型制備 8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠購自湖南省萊克景達實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(湘)2019-0004。所用動物實驗均符合遵義醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會的相應規(guī)定([2021]2-444)。所用小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，晝夜交替12 h、(23±1)℃、相對濕度60%。隨機分為7組(n=7)：空白組，空白+Sal高劑量組，LPS，LPS+Sal低劑量組，LPS+Sal中劑量組，LPS+Sal高劑量組，LPS+多奈哌齊組(Donepezil，DP)。分別灌胃給予小鼠Sal 25、50、100 mg/kg，或DP 1 mg/kg，每天1次，連續(xù)30 d；空白和LPS組小鼠給予同體積雙蒸水。給藥第15天開始腹腔注射，LPS小鼠腹腔注射LPS 250 μg/kg，空白組和空白+Sal高劑量組注射同體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)注射7 d。

1.2 主要試劑 紅景天苷(純度：99.79%，CAS：10338-51-9)購自MedChemExpress(MCE)公司。LPS來源Escherichia coli(O111:B4)購自sigma公司。Elisa試劑盒購自索萊寶科技有限公司。IL-1β、IL-6、NF-κB、總Tau、S202、S404、S396和T231位點磷酸化的抗體購自Cell Signaling Technology；β-actin和GAPDH購自Absin。Western blot實驗所用二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 實驗方法 灌胃結束前7 d行Morris水迷宮實驗檢測小鼠行為學變化。小鼠水迷宮為直徑120 cm的圓形迷宮，人為劃分為4個象限，平臺直徑10 cm，固定放置與其中一個象限，并處于水面之下1 cm，為隱匿平臺。水迷宮訓練共6 d，除隱匿平臺所在象限外，每天從其余3個象限將小鼠面朝池壁輕輕放置入水，每天訓練3次。若小鼠在60 s內未找到隱匿平臺，則將小鼠引導至平臺上并停留10 s。通過計算機視頻跟蹤系統(tǒng)和mt-200圖像分析軟件記錄每只小鼠從入水點到找到平臺所需時間即為逃避潛伏期(s)，每天3次訓練結果取平均值作為當天的成績。

行為學檢測結束后24 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，采用0.01 M PBS透心灌注，直至流出液清晰，繼而斷頭取腦，收集腦組織用于Elisa和Western blot法檢測。取一側腦組織加0.9%生理鹽水，機械研磨成組織勻漿，以12 000 rpm 4 ℃離心10 min，取上清用于Elisa法檢測炎癥因子的含量。另一側腦組織采用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液在冰上操作裂解腦組織，4 ℃高速離心15 min后取上清采用BCA法進行蛋白定量；蛋白通過高熱變性后，經(jīng)SDS-PAGE膠分離；轉至PVDF膜；5%脫脂牛奶(磷酸化抗體采用5 % BSA)室溫封閉2 h；4 ℃孵育一抗過夜；室溫孵育二抗1 h，ECL化學發(fā)光劑顯影；全自動凝膠成像分析儀顯影成像及Image J圖像分析系統(tǒng)定量分析。

2 結果

2.1 紅景天苷對LPS誘導的小鼠行為學的影響 Morris水迷宮定位航行實驗結果顯示隨著訓練次數(shù)的增加，各組小鼠找到隱匿平臺(逃避潛伏期)所需的時間逐漸下降并趨于穩(wěn)定，經(jīng)重復測量方差分析的Mauchly球形度檢驗得近似卡方值為66.39，P<0.001；故主體內效應檢驗結果參考Greenhouse-Geisser(F=52.577，P<0.001)；主體內效應檢驗F=4.41，P=0.002，提示小鼠逃避潛伏期存在分組因素的影響(見表1)。后續(xù)成對比較結果顯示：訓練至第5、6天，LPS組小鼠逃避潛伏期明顯長于空白對照組(P<0.01)；LPS+Sal和DP組小鼠與LPS組相比逃避潛伏期顯著減少(P<0.01，見表1和圖1)；Sal正常給藥組小鼠的逃避潛伏期與空白組接近，無統(tǒng)計學差異。

表1 各組小鼠Morris水迷宮實驗逃避潛伏期(s)比較

2.2 紅景天苷對LPS誘導的小鼠腦組織炎癥因子的影響 本實驗通過ELISA和Western blot法檢測Sal對小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-κB含量的影響。Western blot法檢測小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和NF-κB蛋白的含量，結果如圖2A所示：LPS刺激后小鼠腦組織中IL-1β、IL-6和NF-κB(P<0.01)的蛋白表達水平較空白組明顯增加。給予Sal低劑量后并沒有明顯改變IL-6和NF-κB的蛋白表達水平。Sal中劑量有降低IL-6蛋白表達的趨勢，但沒有統(tǒng)計學差異。Sal高劑量和陽性藥DP均明顯的降低了IL-1β、IL-6和NF-κB(P<0.01)的蛋白表達水平。采用Elisa法對具有代表性的組包括空白組、LPS組、LPS+Sal高劑量和DP組炎癥因子水平進行了驗證，結果如圖2B所示：LPS刺激后小鼠腦組織中IL-1β(P<0.01)、IL-6和TNF-α(P<0.05)水平均較空白組明顯增加。給予Sal高劑量和DP干擾之后IL-1β、IL-6、TNF-α的含量均顯著下降(P<0.05)。

2.3 紅景天苷對LPS誘導的小鼠腦組織Tau蛋白磷酸化的影響 通過Western blot檢測小鼠腦組織中總Tau蛋白的表達水平，及Tau蛋白在S202、T231、S396和S404位點磷酸化的水平，結果如圖3所示，LPS腹腔注射后小鼠腦組織中Tau蛋白在上述位點磷酸化的水平顯著高于空白組(P<0.01)；給予Sal和DP治療后小鼠腦組織中Tau蛋白在上述位點的磷酸化水平均明顯低于LPS組(P<0.01)；而總Tau蛋白的表達水平在各組間無統(tǒng)計學差異。

A：Western blot法檢測小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和NF-κB的蛋白表達；B：ELISA法檢測小鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平；*、**：與Control組比較， P<0.05、P<0.01；#、##：與單純LPS組比較，圖2 紅景天苷對LPS誘導的小鼠腦組織炎癥因子的影響

**：與Control組比較，P<0.01；#、##：與單純LPS組比較，圖3 紅景天苷對LPS誘導的小鼠腦組織Tau蛋白磷酸化水平的影響

3 討論

早有報道顯示全身性炎癥反應通過多途徑比如室周器官、迷走神經(jīng)、血腦屏障等引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)炎癥反應[9]，而腹腔注射LPS制備的動物癡呆模型常被用于觀察和分析AD疾病的發(fā)病機制和藥物的干擾作用[10]。本實驗采用小鼠腹腔注射LPS連續(xù)7 d后停止注射7 d，再采用水迷宮檢測，結果顯示小鼠空間學習記憶能力下降，與文獻報道一致[11-13]，說明小鼠癡呆模型制備成功，可用于后續(xù)觀察藥物的干擾作用。經(jīng)預先灌胃給予紅景天苷低、中、高(25、50、100 mg/kg)3個劑量梯度和陽性藥多奈哌齊后，在水迷宮訓練的最后2 d，即第5、6天，紅景天苷中、高劑量和多奈哌齊均能明顯減輕LPS造成的小鼠學習記憶功能的缺損，顯示出紅景天苷抗外周注射LPS所致AD模型的良好前景。

據(jù)研究報道，遲發(fā)性AD的病理改變中，慢性神經(jīng)炎癥的反應往往早于AD的特征性病理表現(xiàn)Aβ和Tau蛋白的過度磷酸化[14]。過度磷酸化的Tau形成的神經(jīng)纖維纏結與神經(jīng)元突觸的丟失、膠質細胞增生、神經(jīng)炎癥及AD的臨床癥狀密切相關，但導致Tau過度磷酸化的因素很多，其中神經(jīng)炎癥是關鍵因素[3]，當然過度磷酸化的Tau又進一步加重了神經(jīng)炎癥反應。本實驗采用外周給予LPS引發(fā)小鼠腦內炎癥因子水平增加以及Tau蛋白過度磷酸化，紅景天苷和多奈哌齊均能降低炎癥因子IL-1β、IL-6、NF-κB和TNF-α的水平，并且還抑制Tau蛋白在S202、T231、S396和S404位點過度磷酸化的水平，提示紅景天苷對AD特征性病理改變過度磷酸化Tau的影響可能與減輕神經(jīng)炎癥有關，但因該實驗設計未考察到過度磷酸化Tau與神經(jīng)炎癥的先后關系，因此也無法肯定紅景天苷對過度磷酸化Tau與神經(jīng)炎癥的影響的因果關系。本實驗結果顯示小鼠大腦總Tau蛋白的表達水平未發(fā)生變化，也提示紅景天苷對Tau的影響是通過調節(jié)Tau蛋白翻譯后修飾實現(xiàn)的，而不是改變蛋白質的表達水平。但對于紅景天苷是如何調節(jié)Tau蛋白翻譯后修飾，以及對神經(jīng)炎癥和Tau蛋白過度磷酸化先后關系的影響方面，仍需進一步研究。

綜上所述，紅景天苷明顯的改善了腹腔注射LPS引起的小鼠學習記憶功能障礙，其機制可能與降低神經(jīng)炎癥水平及抑制Tau蛋白的過度磷酸化有關。

(致謝：感謝遵義醫(yī)科大學基礎藥理教育部重點實驗室提供的實驗平臺。)