補(bǔ)骨脂素對(duì)2型糖尿病大鼠種植體骨結(jié)合的影響機(jī)制

胡鵬鯤，楊 鵬，馮亞梅

(邯鄲市口腔醫(yī)院 1.修復(fù)科；2.種植科，河北 邯鄲 056001)

隨著外科技術(shù)和種植體設(shè)計(jì)的不斷發(fā)展，使用種植體進(jìn)行牙齒修復(fù)已成為牙列缺損患者的首選。然而，糖尿病，尤其是2型糖尿病(Type 2 diabetic mellitus,T2DM)作為一種以高血糖為特征的代謝性疾病，可通過(guò)影響種植體骨結(jié)合導(dǎo)致種植失敗[1-2]。注射胰島素是糖尿病治療的主流趨勢(shì)，但其對(duì)種植體骨結(jié)合的改善效果并不理想[3]。因此，迫切需要探索新的治療方式以增強(qiáng)T2DM患者種植體骨結(jié)合。

Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號(hào)通路作為骨形成和愈合的重要調(diào)節(jié)劑，在骨骼發(fā)育和體內(nèi)平衡中發(fā)揮核心作用，并參與細(xì)胞對(duì)各種刺激物的反應(yīng)，包括微環(huán)境失衡、氧化應(yīng)激和植入物表面特性[4]。已經(jīng)證明，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可促進(jìn)種植體表面的生物礦化和種植體/組織界面的組織修復(fù)[5-6]。Ma等[7]研究顯示，麥冬素D可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，改善糖尿病條件下體內(nèi)鈦合金植入物的骨結(jié)合；提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路在糖尿病引起的種植體骨結(jié)合受損中發(fā)揮作用。

補(bǔ)骨脂素(Psoralen,PSO)是一種從補(bǔ)骨脂中提取的天然化合物，具有顯著的骨骼保護(hù)作用[8]。據(jù)報(bào)道，PSO可減輕牙周炎大/小鼠的牙槽骨丟失[9-10]，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成[11]。此外，PSO可誘導(dǎo)兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，與聚己內(nèi)酯三維支架結(jié)合形成人工復(fù)合骨修復(fù)骨不連，可運(yùn)用于骨組織工程[12]。PSO還被報(bào)道可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖[13]。然而，鮮有研究報(bào)道PSO是否可以在高血糖條件下促進(jìn)種植體骨結(jié)合。因此，本研究通過(guò)建立T2DM大鼠模型并在脛骨植入鈦種植體，探究PSO對(duì)T2DM種植體骨結(jié)合的影響及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠80只，7～8周齡，體重(240～280)g，由湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(湘)2020-0006。所有大鼠飼養(yǎng)在相同的控制條件下，包括光照(12 h光/暗循環(huán))、濕度(50%～60%)和溫度(22～24 ℃)，并且可以獲得標(biāo)準(zhǔn)食物和水。

1.2 主要試劑與儀器 PSO(純度>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司，B-065)；重組大鼠Dickkopf-1(Dkk1)蛋白(一種Wnt抑制劑，美國(guó)R&D Systems公司，4010-DK-010)；錐形螺旋鈦種植體(直徑1 mm，長(zhǎng)度10 mm，西安中邦鈦生物材料有限公司)；亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色液(青島克斯特生物科技有限公司，RYX021)；鏈脲佐菌素(STZ，S8050)、蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(G1120)、Masson三色染色試劑盒(G1340)、總RNA提取試劑盒(R1200)(北京Solarbio公司)；PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037Q)(日本Takara公司)；兔源一抗Wnt3a(ab219412)、β-catenin(ab68183)、Lamin B1(ab16048)、GAPDH(ab181602)(英國(guó)Abcam公司)。金剛石鋸(SP1600，德國(guó)Leica公司)；Accu-Chek血糖儀(Roche Diagnostics，加拿大)；Quantum GX2小動(dòng)物活體Micro-CT影像系統(tǒng)(Perkin Elmer，日本)；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.3 模型建立及分組 適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件7 d后，將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組，n=18)和造模組(n=62)。T2DM大鼠模型通過(guò)4周的高脂高糖飲食(53%碳水化合物，31%總脂肪大卡和16%蛋白質(zhì)；北京科奧協(xié)力飼料有限公司，中國(guó))，然后以30 mg/kg的劑量腹腔注射STZ(溶解在0.1 M檸檬酸鹽緩沖液，pH 4.2)誘導(dǎo)[14]。Control組大鼠給予常規(guī)飼料和檸檬酸鹽緩沖液注射。在STZ注射后第3 天，通過(guò)剪尾從尾靜脈收集血樣，然后用Accu-Chek血糖儀測(cè)量空腹血糖(Fasting blood glucose,FBG)；FBG>16.7 mmol/L表明T2DM模型建立成功[15]。造模過(guò)程中，4只大鼠死亡，4只大鼠造模失敗。最后，共得到54只大鼠。

將建模成功的54只大鼠分為T2DM組、PSO組、PSO+Dkk1組，每組18只。所有大鼠通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉。然后，用手術(shù)刀沿右側(cè)膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)切開(kāi)1 cm長(zhǎng)的切口，露出脛骨近骺端。隨后，用旋轉(zhuǎn)鉆進(jìn)入髓腔制備種植窩，將種植體植入脛骨骨髓腔，直到種植體末端低于關(guān)節(jié)面。然后，分層縫合手術(shù)切口。所有大鼠在術(shù)后立即肌肉注射3 d的抗生素以預(yù)防感染。PSO組大鼠在手術(shù)后給予8 mg/kg的PSO灌胃[9]，每2日1次；PSO+Dkk1組大鼠在每日給予PSO灌胃的同時(shí)在脛骨種植體植入部位附近以25 mg/kg的劑量皮下注射重組Dkk1蛋白[16]，每周2次；Control組和T2DM組大鼠給予等體積的生理鹽水灌胃和皮下注射。12周后，用致死劑量的麻醉劑(戊巴比妥鈉150 mg/kg，腹腔注射)對(duì)所有大鼠實(shí)施安樂(lè)死。

1.4 大鼠體重和血糖水平 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中定期(實(shí)驗(yàn)前、干預(yù)第4、8、12周)監(jiān)測(cè)大鼠體重變化，并在相同的時(shí)間點(diǎn)采集尾靜脈血測(cè)定FBG水平。

1.5 Micro-CT掃描重建檢測(cè)骨微結(jié)構(gòu) 大鼠安樂(lè)死后，收集帶種植體脛骨樣本，每組選取6只大鼠樣本固定在4%多聚甲醛中，使用Micro-CT系統(tǒng)進(jìn)行掃描。掃描后，從顯微斷層切片重建三維(3D)圖像。為了準(zhǔn)確地表示骨小梁結(jié)構(gòu)，感興趣區(qū)域(ROI)需要包含至少三到五個(gè)小梁間長(zhǎng)度，由于大鼠小梁骨的厚度約為100 μm，因此ROI位于生長(zhǎng)板下方1 mm，距種植體表面的環(huán)半徑為500 μm，厚度為800 μm。計(jì)算骨小梁以下參數(shù)：骨體積百分比(BV/TV，%)，骨小梁數(shù)(Tb.N，mm)和骨整合百分比(OI，%)。BV代表ROI中的骨骼體積，TV代表ROI的總空間體積；OI(%)是直接接觸的骨-種植體界面與總種植體表面的面積比例。

1.6 組織形態(tài)學(xué)分析 將含有鈦種植體的脛骨脫水，嵌入甲基丙烯酸甲酯中而不脫鈣，然后用金剛石鋸(SP1600，Leica，Germany)切片，獲得50 μm厚的未脫鈣切片。隨后，未脫鈣切片用1%亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色并用光學(xué)顯微鏡觀察。使用Image Pro Plus 6.0測(cè)量骨-種植體接觸率(Bone-implant contact,BIC，%)，BIC在生長(zhǎng)板下方1 mm處測(cè)量。BIC為骨-種植體表面接觸長(zhǎng)度與種植體在骨內(nèi)段表面總長(zhǎng)度的比值。取出在4%多聚甲醛中固定48 h的脛骨，用流水沖洗后，用10% EDTA脫鈣4～6周，直到可以無(wú)阻力地插入針頭。然后沿骨軸方向小心取出種植體，然后將組織標(biāo)本進(jìn)行梯度乙醇脫水，石蠟包埋，并在種植體周圍橫向切成5 μm的切片。然后進(jìn)行HE染色和Masson染色，分別評(píng)估新骨形成和新骨成熟度。

1.7 RT-qPCR分析骨組織runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、I型膠原蛋白α1(COL1A1)mRNA表達(dá) 使用Trizol試劑從種植體周圍骨組織中提取總RNA，并采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系：2 μL第一鏈cDNA、上游和下游引物(10 pM)各2 μL、4 μL dNTP(2 mM)、5 μL 10×PCR buffer、1 μL Taq酶(2 U/μL)、34 μL ddH2O。然后，在ABI Prism? 7500型熒光定量PCR儀上使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(20 μL)：1.0 μL cDNA模板、10 μL SYBR Green Mix、7.4 μL ddH2O、上游和下游引物各0.8 μL，熱循環(huán)條件如下：95 ℃ 10 min；然后是95 ℃ 15 s和60 ℃ 60 s的40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸1 min。采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行目的基因相對(duì)表達(dá)分析，并將mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.8 Western blot檢測(cè)骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá) 采用RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)在冰上裂解組織以提取總蛋白，并采用核蛋白提取試劑盒提取胞核蛋白(用于檢測(cè)β-catenin)，使用BCA法測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。然后，使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離等量蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。5 %脫脂牛奶用于封閉膜1 h。隨后，將膜用一抗[GAPDH(1∶2 000)、Wnt3a(1∶1 000)、β-catenin(1∶1 000)和Lamin B1(1∶1 000)]在4 ℃下孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗膜3次(每次5 min)，并與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。最后，增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)用于顯示蛋白質(zhì)條帶，并用Image J軟件分析蛋白質(zhì)條帶的灰度值進(jìn)行量化。GAPDH用作總蛋白內(nèi)參對(duì)照，Lamin B1用作胞核蛋白內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體重變化 所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均存活，未觀察到種植體感染。與Control組相比，T2DM組大鼠體重顯著降低(P<0.05)；與T2DM組相比，PSO組、PSO+Dkk1組大鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠體重變化比較

2.2 各組大鼠血糖變化 與Control組相比，T2DM組大鼠FBG水平顯著升高(P<0.05)；與T2DM組相比，PSO組、PSO+Dkk1組大鼠FBG水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠FBG水平比較

2.3 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)比較 與Control組相比，T2DM組大鼠骨組織BV/TV、Tb.N和OI顯著降低(P<0.05)；與T2DM組相比，PSO組大鼠骨組織BV/TV、Tb.N和OI顯著升高(P<0.05)；與PSO組相比，PSO+Dkk1組大鼠骨組織上述指標(biāo)水平顯著降低(P<0.05)；見(jiàn)圖1、表4。

A:Control組；B：T2DM組；C:PSO組；D:PSO+Dkk1組；箭頭表示骨小梁。圖1 各組大鼠骨-種植體界面的Micro-CT檢查結(jié)果

表4 各組大鼠BV/TV、Tb.N和OI水平比較

2.4 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化 未脫鈣切片的亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色結(jié)果顯示，與Control組相比，T2DM組種植體周圍骨量減少且散在分布，BIC顯著降低(P<0.05)；與T2DM組相比，PSO組大鼠種植體周圍的骨量和密度明顯增加，BIC顯著升高(P<0.05)；與PSO組相比，PSO+Dkk1組種植體周圍的骨量和密度減少，BIC顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖2、表5。

A：種植體縱切面圖像；B：種植體橫截面圖像；黃色箭頭表示種植體周圍骨組織染色；亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色，比例尺=50 μm。圖2 各組大鼠種植體骨結(jié)合的硬組織切片分析

表5 各組大鼠BIC比較

HE染色結(jié)果顯示，在Control組和PSO組中可以觀察到種植體周圍不同數(shù)量的骨組織，而T2DM組和PSO+Dkk1組幾乎全部被纖維組織占據(jù)(見(jiàn)圖3)。Masson染色結(jié)果顯示，Control組和PSO組中種植體周圍出現(xiàn)了藍(lán)色索狀新骨組織，同時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)紅色染色的骨組織，表明存在新骨，且成熟骨較多；而T2DM組和PSO+Dkk1組中種植體周圍的新生骨較少(見(jiàn)圖3)。

A：HE染色(黑色箭頭表示纖維組織)；B：Masson染色(紅色箭頭表示新生骨組織，綠色箭頭表示成熟骨組織)；脫鈣切片，比例尺=50 μm。圖3 各組大鼠種植體骨結(jié)合的組織學(xué)染色結(jié)果

2.5 各組大鼠骨組織RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平比較 與Control組相比，T2DM組RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；與T2DM組相比，PSO組RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與PSO組相比，PSO+Dkk1組RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平顯著降低(P<0.05)；見(jiàn)表6。

表6 各組大鼠骨組織RUNX2、OCN、COL1A1 mRNA水平比較

2.6 各組大鼠骨組織Wnt3a、β-catenin蛋白水平比較 與Control組相比，T2DM組Wnt3a、核β-catenin蛋白水平顯著降低P<0.05)；與T2DM組相比，PSO組Wnt3a、核β-catenin蛋白水平顯著升高P<0.05)；與PSO組相比，PSO+Dkk1組Wnt3a、核β-catenin蛋白水平顯著降低P<0.05)；見(jiàn)圖4、表7。

圖4 各組大鼠骨組織Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)

表7 各組大鼠骨組織Wnt3a、β-catenin蛋白水平比較

3 討論

T2DM會(huì)阻礙牙種植體的骨再生。動(dòng)物模型的成功建立是深入研究糖尿病發(fā)展和并發(fā)癥的基礎(chǔ)。由高脂飲食和低劑量STZ誘導(dǎo)的大鼠T2DM模型體現(xiàn)了人類T2DM的代謝特征，可持久和穩(wěn)定的維持高血糖，在針對(duì)糖尿病骨代謝特征及其可能的新療法研究中具有廣泛應(yīng)用[17-18]。在本研究中，給予高脂高糖飲食并注射STZ的大鼠血糖水平升高且體重減輕，表明成功構(gòu)建了T2DM模型。本研究還表明，T2DM大鼠的種植體穩(wěn)定性受損，組織學(xué)評(píng)估和Micro-CT掃描證明T2DM組大鼠BIC和OI較低，種植體周圍骨微結(jié)構(gòu)受損。BIC用于在二維圖中描述直接骨-種植體界面的長(zhǎng)度占種植體總直徑的百分比，而OI用于在三維圖中描述直接骨-種植體界面與總種植體表面的面積比例。此外，T2DM組更容易拔出種植體，這表明生物力學(xué)性能不理想；與該領(lǐng)域的先前研究一致[19-20]。所有這些結(jié)果都證實(shí)T2DM會(huì)對(duì)種植體骨結(jié)合產(chǎn)生負(fù)面影響。

PSO屬于植物雌激素，具有防止骨質(zhì)流失、促進(jìn)新骨形成的功能，被視為治療骨質(zhì)疏松癥的替代選擇。最近的一項(xiàng)研究顯示，PSO在骨組織工程的骨不連修復(fù)中具有重要作用，可通過(guò)刺激兔骨內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞增殖，與聚己內(nèi)酯支架結(jié)合形成人工復(fù)合骨，促進(jìn)骨愈合，修復(fù)骨不連[12]。本研究探討PSO對(duì)T2DM模型大鼠種植體骨結(jié)合的影響。結(jié)果顯示，PSO對(duì)降低T2DM大鼠的血糖濃度和增加體重幾乎沒(méi)有作用，然而，Micro-CT掃描和組織學(xué)染色顯示PSO減輕T2DM大鼠種植體周圍骨微結(jié)構(gòu)受損，增加BIC和OI；此外，HE和Masson染色評(píng)估骨結(jié)合過(guò)程中新骨的形成和成熟度，顯示出一致的結(jié)果；RT-qPCR結(jié)果進(jìn)一步表明，PSO促進(jìn)RUNX2、OCN、COL1A1基因表達(dá)。提示，PSO可改善T2DM大鼠種植體骨結(jié)合。

本研究進(jìn)一步探討PSO對(duì)促進(jìn)T2DM大鼠種植體骨結(jié)合影響的潛在機(jī)制。Wnt信號(hào)是幾乎所有組織(包括骨骼、神經(jīng)組織、心肌和表皮)的修復(fù)或再生所必需的[21]。據(jù)報(bào)道，Wnt/β-catenin通路為開(kāi)發(fā)新型藥物或種植體材料以改善種植體骨結(jié)合的有希望的治療靶點(diǎn)[22]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可在糖尿病條件下促進(jìn)鈦種植體在骨缺損修復(fù)中的成骨和骨結(jié)合[7,15]。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的下游成分，Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的激活導(dǎo)致β-catenin降解減少，β-catenin可以在細(xì)胞質(zhì)中積累并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄。王慧麗等[15]研究顯示，在T2DM大鼠中植入鈦種植體后，β-catenin表達(dá)降低，而LiCl(Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑)可促進(jìn)種植體周圍骨形成，促進(jìn)種植體骨結(jié)合。Wnt3a是一種Wnt蛋白，可以激活經(jīng)典的β-catenin通路。研究顯示，添加外源性脂質(zhì)體Wnt3a蛋白可為種植體周圍骨形成創(chuàng)造成骨環(huán)境，有利于種植體的骨結(jié)合[23-24]。在本研究中，植入鈦種植體后，T2DM大鼠骨組織中Wnt3a和核β-catenin蛋白水平均降低，與以往的研究結(jié)果一致，說(shuō)明Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制。給予PSO干預(yù)后，T2DM大鼠骨組織中Wnt3a和核β-catenin蛋白水平增加，表明PSO促進(jìn)β-catenin的核轉(zhuǎn)位。Dkk-1是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制劑，可通過(guò)與靶細(xì)胞上的LRP5/6結(jié)合來(lái)抑制Wnt信號(hào)通路[13]。本研究結(jié)果顯示，Wnt3a和β-catenin的表達(dá)被Dkk-1抑制，且Dkk1可部分逆轉(zhuǎn)PSO對(duì)T2DM大鼠種植體骨結(jié)合的改善作用，這進(jìn)一步證明PSO通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)種植體骨結(jié)合。

綜上所述，PSO可促進(jìn)T2DM大鼠鈦種植體周圍骨形成，改善種植體骨結(jié)合；其作用機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本研究初步探討PSO在T2DM鈦種植體骨結(jié)合中的作用及潛在機(jī)制，表明PSO具有增加種植體骨結(jié)合的潛力。然而，PSO對(duì)T2DM大鼠的高血糖和體重減少并無(wú)改善作用，考慮其與胰島素等降糖藥物聯(lián)合使用是否對(duì)促進(jìn)T2DM大鼠骨結(jié)合產(chǎn)生累加或協(xié)同作用。此外，還需要進(jìn)一步的細(xì)胞和分子水平實(shí)驗(yàn)，以更加全面驗(yàn)證PSO的作用與機(jī)制。