高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定動物源性食品中15種禁限獸藥殘留

李 寧，肖 琎，王雪松，苑中策，董潔瓊，王圓圓，鄭百芹，李明陽，雷舒涵，龐學良，吳 桐

（1.唐山市食品藥品綜合檢驗檢測中心，河北唐山 063000；2.遵化市畜牧水產(chǎn)技術服務中心，河北遵化 064200；3.唐山市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法支隊，河北唐山 063000）

隨著我國經(jīng)濟迅速發(fā)展，肉類食品消費量不斷增長，質(zhì)量安全問題也日益凸顯（劉柏林等，2021）。農(nóng)業(yè)部235號公告中明確規(guī)定禁止用于所有食品動物和不得在動物性食品中檢出的藥物有三十余種（王鶴佳等，2021；楊麗君等，2015）。這些藥物殘留在動物性食品中會成嚴重危害人體健康（方從容等，2018）。目前，禁限獸藥殘留的檢測方法大多是針對某種或者某類獸藥，因此，建立一種同時檢測多類違禁藥物的方法具有一定的現(xiàn)實意義（程曉宏等，2022；韓瑨烜等，2022；懷文輝等，2018）。

本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以豬、雞、牛、羊肉基質(zhì)為樣本，β-受體激動劑類、硝基咪唑類等15種禁限獸藥殘留為待測組分，對前處理條件、液相色譜、質(zhì)譜條件進行優(yōu)化，建立一種多種類禁限獸藥同時檢測的方法，以期為動物源性食品中禁限獸藥分析和風險監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支撐（朱姍姍等，2020）。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 高效液相色譜儀、5500+三重四極桿聯(lián)用質(zhì)譜儀（美國AB）；渦旋混勻儀（IKA）；氮氣發(fā)生器（北京中惠普分析技術研究所）；超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）。

甲硝唑等15種標準品均購自天津阿爾塔科技有限公司；甲醇、乙腈（Dikma）；SCRS凈化柱、萃取鹽包（Cyan科技公司）；五氟苯基色譜柱（美國 Phenomenex）。

1.2 標準溶液配制及標準曲線繪制 標準物質(zhì)中間液（10μg/mL）配制：分別將甲硝唑等15種標準品（濃度均為100μg/mL）用甲醇稀釋定容，-20℃避光保存。

混合標準物質(zhì)工作液（100 ng/mL）配制：準確移取甲硝唑等15種標準物質(zhì)中間液各100μL于10 mL容量瓶中，甲醇定容，4℃避光保存。

用 工 作 液 配 制 濃 度 范 圍 為 0.5、2、5、20、50 ng/mL系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 樣品前處理 樣品前處理：準確稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管1（含三顆鋯珠）中；加入 2 mL純凈水，震蕩渦旋 30 s；加入 1% 乙酸-乙腈溶液10 mL，震蕩渦旋5 min；超聲提取15 min，8000 r/min 離心 5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管2中；重復提取一次，將提取液合并至離心管2中，并加入萃取鹽包，立即震蕩渦旋30 s，8000 r/min 離心 5 min，SCRS 凈化柱凈化，取 5 mL凈化液氮吹至近干，用 1 mL甲醇 -水（1：1）復溶，過0.22μm微孔濾膜，供儀器分析測定。

1.4 HPLC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：五氟苯基色譜柱100A（2.6μm，100×2.1 mm）；柱 溫 ：40 ℃ ；進樣體積：2μL；流速為0.4 mL/min，流動相：溶劑A為0.1%甲酸-水；溶劑B為乙腈，梯度洗 脫 程 序 ：0 ～ 0.5 min，1%B ；0.5 ～ 0.6 min，10%B ；0.6 ～ 8 min，100%B ；8.0 ～ 10 min，1%B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 ESI+模式；電噴霧電壓5500 V；離子源溫度：500℃；氣簾氣：35 psi；輔助氣 1：55 psi；輔助氣 2：55 psi；多反應 MRM掃描。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結果與討論

2.1 樣品前處理優(yōu)化 在5 ng/kg添加水平下，15種禁限獸藥用乙酸乙酯、乙腈、甲醇、1%（V/V）乙酸-乙腈溶劑提取，目標組分最低回收率分別為45%、67%、58%、77%。試驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)渦旋震蕩后再經(jīng)超聲助提可明顯提高提取效率。與渦旋震蕩10 min相比，渦旋震蕩5 min加標回收率無差異。超聲10、15、20 min的最低回收率分別為68%、77%、78%。若提取一次，加標回收率范圍為44%～82%，重復提取為77%～104%。比較了無水NaSO4和無水MgSO4為主要成分的萃取鹽包，采用 2 g無水 NaSO4和 1 g無水 MgSO4混合萃取鹽包除水效果較好。還比較了Prime HLB、SCRS凈化柱兩種固相萃取柱的凈化效果，加標回收率范圍分別為55%～96%、77%～104%。

2.2 基質(zhì)效應 為了降低基質(zhì)效應，評價了在4種不同基質(zhì)中，15種禁限獸藥的響應值，以樣品前處理的空白基質(zhì)和50%乙腈-水分別稀釋標準品配制標準曲線，以二者的斜率計算標準曲線。4種基質(zhì)中15種禁限獸藥的ME值在0.851～1.079之間，說明SCRS凈化柱凈化效果顯著。

2.3 液相色譜與質(zhì)譜條件的優(yōu)化 為了減少上機溶劑效應的干擾，采用乙腈為有機相。比較了水、0.1%甲酸-水作為水相，表明0.1%甲酸-水作為水相各組分的響應值較好，峰形呈現(xiàn)較好。另比較 Waters T3 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8μm）、五 氟 苯 基 色 譜 柱（100 mm×2.1 mm，2.6μm）響應值及色譜峰形，表明五氟苯基色譜柱比T3色譜柱響應值高13%。將15種禁限獸藥的混合標準工作液配置成濃度為2 ng/mL，采用MRM模式，以ESI+模式優(yōu)化各個離子對的去簇電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 線性關系及檢出限、定量限 由表2可知，將15種禁限獸藥標準工作液用50%乙腈-水作為溶劑，配制濃度范圍為 0.5、2、5、20、50μg/L 的混合標準系列溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用，繪制標準曲線。結果發(fā)現(xiàn)，15種禁限獸藥在0.5～50μg/L的范圍線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.998。以3倍基線噪聲確定各組分的檢出限，10倍基線噪聲確定各組分的定量限，最低檢出限均低于0.5μg/kg，定量限均低于1.0μg/kg。表明該方法具有較好的靈敏度。

表2 15種禁限獸藥的線性方程、檢出限和定量限

2.5 加標回收率和精密度 由表3可知，在4種空白基質(zhì)樣品中添加5μg/kg的混合標準溶液進行加標回收試驗，重復測定6次，結果表明，4種基質(zhì)樣品中15種禁限獸藥的平均加標回收率為78%～98%，相對標準偏差（RSDs）為2.6%～8.3%。

表3 豬、雞、牛、羊肉樣品中15種禁限獸藥的回收率和精密度（n=6）

2.6 實際樣品分析 采用該方法對隨機采取的4種基質(zhì)30份樣品進行檢測，其中雞肉樣品中檢出1份甲硝唑藥物殘留，其定量結果為2.3μg/kg。采用國家標準（SN/T 1626-2019）進行復驗，定量結果為2.0μg/kg，結果偏差為13%，說明禁限獸藥在動物源性食品中依然存在添加風險。

3 結論

本文建立了4種基質(zhì)中檢測15種禁限獸藥殘留的檢測方法，采用外標法定量。該方法具有操作簡單、回收率高、成本低等優(yōu)點，可適用于大批量樣本分析，為風險監(jiān)測提供有效的數(shù)據(jù)支撐。