植入前遺傳學(xué)檢測(cè)后凍融胚胎移植周期妊娠結(jié)局的影響因素

胡瑞，魏才娟，賈冬玲，毛斌，馬曉玲，楊媛

植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（preimplantation genetic testing，PGT）是通過(guò)侵入性胚胎活檢，挑選正常胚胎植入子宮的過(guò)程，該技術(shù)在一定程度上預(yù)防了反復(fù)妊娠丟失、出生缺陷及遺傳性疾病[1]。根據(jù)檢測(cè)方法和目的不同，PGT可分為單基因疾病檢測(cè)（PGT for monogenic，PGT-M）、染色體重排檢測(cè)（PGT for structural rearrangements，PGT-SR）和非整倍體篩查檢測(cè)（PGT for aneuploidies，PGT-A）[2]。經(jīng)PGT后的可移植胚胎（無(wú)遺傳突變、染色體結(jié)構(gòu)正常和整倍體）盡可能地減少了因胚胎因素導(dǎo)致的不孕及不良妊娠[3]，所以，臨床上針對(duì)PGT后患者選擇高效、經(jīng)濟(jì)及便捷的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案是臨床治療的關(guān)鍵。目前，凍融胚胎移植（frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET）時(shí)常用的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案包括自然周期（natural cycle，NC）方案、激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）方案、促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRHa）聯(lián)合HRT方案。對(duì)于較為珍貴的PGT胚胎而言，目前尚無(wú)推薦的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。本研究回顧性分析在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院（我院）生殖醫(yī)學(xué)中心行PGT患者的相關(guān)資料及妊娠結(jié)局，旨在為PGT患者FET時(shí)選取適當(dāng)?shù)闹委煼桨柑峁┮罁?jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2017年1月—2022年1月在我院生殖醫(yī)學(xué)中心行PGT助孕的患者195例、共219個(gè)FET移植周期的臨床資料。按照子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案分為NC組（56個(gè)周期）、GnRHa+HRT組（102個(gè)周期）和HRT組（61個(gè)周期）。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且所有患者均簽署了知情同意書。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) PGT-A：①女方年齡＞38歲；②不明原因的反復(fù)自然流產(chǎn)（2次及以上）；③不明原因反復(fù)種植失?。ㄒ浦?次及以上或移植高評(píng)分卵裂期胚胎數(shù)4～6個(gè)或高評(píng)分囊胚數(shù)3個(gè)及以上均失?。?；④嚴(yán)重畸形精子癥。

PGT-M/SR：①夫婦任一方或雙方經(jīng)外周血染色體核型分析診斷為染色體結(jié)構(gòu)異常（相互易位、羅氏易位、倒位、復(fù)雜易位、致病性微缺失或微重復(fù)等）；②夫婦任一方或雙方攜帶嚴(yán)重疾病的遺傳易感基因突變；或具有生育遺傳疾病子代高風(fēng)險(xiǎn)的夫婦，且致病基因突變?cè)\斷或致病基因連鎖標(biāo)記明確；③生育過(guò)嚴(yán)重血液疾病患兒的夫婦，需通過(guò)白細(xì)胞抗原配型行骨髓移植治療。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①子宮內(nèi)膜息肉或?qū)m腔粘連者；②子宮內(nèi)膜炎或子宮內(nèi)膜癌者；③未行治療的輸卵管積水或?qū)m腔積液者；④先天性子宮發(fā)育異常者，如畸形子宮或縱隔子宮者；⑤合并妊娠高風(fēng)險(xiǎn)、不能耐受的全身性疾病者。

1.3 PGT采用胚胎激光打孔法獲取囊胚期3～10個(gè)滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞，行全基因組擴(kuò)增，通過(guò)高通量測(cè)序分析樣本基因分型、基因拷貝數(shù)數(shù)據(jù)，檢測(cè)23對(duì)染色體的非整倍體、染色體嵌合體以及節(jié)段性重復(fù)、缺失、易位等?；顧z后的胚胎進(jìn)行玻璃化冷凍，直至移植前行冷凍復(fù)蘇。

1.4 子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案

1.4.1 NC組 平素月經(jīng)規(guī)律、無(wú)排卵障礙者，于月經(jīng)周期第8～10天開始，每隔2～3 d行超聲檢查，監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜厚度及卵泡大小。當(dāng)卵泡直徑≥17 mm，子宮內(nèi)膜厚度≥8.0 mm，結(jié)合雌二醇（estradiol，E2）、孕酮（progesterone）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平確定排卵日期。排卵后予黃體支持誘導(dǎo)內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，口服地屈孕酮（達(dá)芙通，荷蘭蘇威制藥有限公司）30 mg/d聯(lián)合陰道置入黃體酮軟膠囊（安琪坦，法國(guó)Besins-healthcare公司）600 mg/d。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日后5～6 d行FET。黃體支持至檢測(cè)人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日（移植后14 d檢測(cè)血清β-hCG≥50 U/L為hCG陽(yáng)性）。若成功妊娠，黃體支持至妊娠12周。

1.4.2 GnRHa+HRT組 平素月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙或其他內(nèi)膜準(zhǔn)備方案失敗者，于經(jīng)期第2～3天給予長(zhǎng)效醋酸曲普瑞林（達(dá)菲林，法國(guó)博福-益普生制藥有限公司）肌內(nèi)注射1.875 mg或亮丙瑞林（貝伊，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠）皮下注射3.750 mg。于注射亮丙瑞林14 d或醋酸曲普瑞林28 d后，口服戊酸雌二醇（補(bǔ)佳樂(lè)，德國(guó)拜耳醫(yī)藥保健有限公司）4～6 mg/d，根據(jù)患者子宮內(nèi)膜厚度及卵泡發(fā)育具體情況調(diào)整藥量，12～14 d，內(nèi)膜厚度≥8.0 mm，結(jié)合LH、E2、孕酮水平，黃體支持轉(zhuǎn)化內(nèi)膜（同NC組）。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日后第6～7天行FET，黃體支持至檢測(cè)hCG日。若成功妊娠，黃體支持至妊娠12周。戊酸雌二醇用至檢測(cè)hCG日后逐漸減量至停藥。

1.4.3 HRT組 平素月經(jīng)不規(guī)律、排卵障礙或既往子宮內(nèi)膜薄者，口服戊酸雌二醇4～6 mg/d。用藥12～14 d左右，內(nèi)膜厚度≥8.0 mm以上，結(jié)合LH、E2、孕酮水平，黃體支持及移植時(shí)間同GnRHa+HRT組。

1.5 妊娠結(jié)局判定標(biāo)準(zhǔn)移植后4周進(jìn)行陰道超聲檢查，宮腔內(nèi)可見妊娠囊者定義為臨床妊娠。胚胎于宮腔外著床定義為異位妊娠。妊娠14周之前胚胎停止發(fā)育或已經(jīng)發(fā)生死亡并且未自然排出宮腔者定義為胚胎停育。妊娠不足28周或胎兒體質(zhì)量不足1 000 g而終止妊娠者定義為流產(chǎn)。妊娠28周后分娩活嬰定義為活產(chǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量資料采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法；不符合正態(tài)分布的定量資料采用中位數(shù)和四分位數(shù)[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；定性資料采用例（%）表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。采用多因素Logistic回歸分析PGT患者FET妊娠結(jié)局的影響因素。所有檢驗(yàn)均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般情況比較3組患者的年齡、不良孕產(chǎn)史、不孕時(shí)間、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、輔助生殖史、基礎(chǔ)卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、基礎(chǔ)LH、基礎(chǔ)E2、抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、催乳素（prolactin，PRL）及促排卵情況（獲卵數(shù)、總囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率和囊胚培養(yǎng)率）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。3組患者的PGT類型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），NC組行PGT-SR的患者比例高于另兩組（P＜0.05）。見表1和表2。

表1 3組患者的一般情況比較

表2 3組患者的排卵情況及PGT類型比較

2.2 3組患者FET情況及妊娠結(jié)局比較3組患者的可移植胚胎數(shù)、移植日子宮內(nèi)膜厚度、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、胚胎停育率和活產(chǎn)率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。NC組的異位妊娠率高于GnRHa+HRT組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 3組患者FET情況及妊娠結(jié)局比較

2.3 活產(chǎn)組與非活產(chǎn)組的臨床特征比較將所有周期分為活產(chǎn)組（138個(gè)周期）、非活產(chǎn)組（81個(gè)周期），活產(chǎn)組的BMI≤25 kg/m2、獲卵數(shù)＞12個(gè)、可移植胚胎數(shù)＞2個(gè)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)＞2個(gè)的周期比例高于非活產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表4。

表4 活產(chǎn)影響因素的單因素分析 [例（%）]

2.4 PGT患者活產(chǎn)的影響因素分析以妊娠結(jié)局活產(chǎn)為因變量（活產(chǎn)賦值0，非活產(chǎn)賦值1），將2組比較P＜0.2的臨床特征因素包括不良孕產(chǎn)史、BMI、獲卵數(shù)、總囊胚數(shù)、可移植胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)等指標(biāo)作為自變量給予賦值后進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)＞2個(gè)是PGT患者FET活產(chǎn)的保護(hù)因素（P＜0.05），見表5。

表5 PGT患者活產(chǎn)影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

隨著胚胎遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和臨床應(yīng)用，PGT成為了較成熟、準(zhǔn)確、安全且可靠的輔助生殖技術(shù)之一[4]。該技術(shù)顯著提高持續(xù)妊娠率和活產(chǎn)率；降低流產(chǎn)率、多胎妊娠率及新生兒遺傳性疾病風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育有重要意義。眾所周知，影響胚胎植入的因素主要有胚胎質(zhì)量及子宮內(nèi)膜容受性。盡管PGT助孕流程復(fù)雜，費(fèi)用較高，對(duì)胚胎的質(zhì)量也有一定的要求。但使用篩選過(guò)的正常及優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植，已最大程度地降低因胚胎因素導(dǎo)致的不良妊娠結(jié)局。所以，為改善患者的妊娠結(jié)局，分析其他相關(guān)的影響因素顯得極為關(guān)鍵。

3.1 PGT人群不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)其妊娠結(jié)局的影響NC、HRT和GnRHa+HRT方案是常見的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案。對(duì)于月經(jīng)周期規(guī)律、排卵正常的患者且子宮內(nèi)膜厚度能達(dá)到移植標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)先推薦NC方案[5]，僅在排卵前行月經(jīng)周期監(jiān)測(cè)，體內(nèi)激素水平更接近自然狀態(tài)，可預(yù)防高雌激素對(duì)內(nèi)膜容受性的不良影響。但是，該方案的周期可控性較低，取消率較高（5%～6%）。HRT方案主要適于排卵不規(guī)律、無(wú)自發(fā)性排卵或多次采用NC周期失敗者[5]，該方案補(bǔ)充外源性雌、孕激素促進(jìn)內(nèi)膜增殖并與胚胎發(fā)育同步化，可控性較強(qiáng)、復(fù)診次數(shù)少、周期取消率低。但其成本增加，可能出現(xiàn)與補(bǔ)充雌激素有關(guān)的潛在不良影響，如血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加，內(nèi)源性早發(fā)性的LH峰影響內(nèi)膜微環(huán)境，不利于胚胎著床[6]。GnRHa+HRT方案則適于子宮肌瘤、子宮腺肌病、子宮內(nèi)膜異位癥者或其他內(nèi)膜準(zhǔn)備方案失敗者。GnRHa可抑制內(nèi)源性LH峰，并且提高子宮內(nèi)膜對(duì)外源性雌激素的敏感性[7]，但周期長(zhǎng)、費(fèi)用較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，臨床上不同PGT類型的患者子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案選擇有差異。對(duì)于PGT-A患者，更傾向于選擇人工周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案（GnRHa+HRT方案或單獨(dú)HRT方案）。PGT-A患者更多因高齡、反復(fù)種植失敗、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等選擇該項(xiàng)助孕技術(shù)，該類患者可能有子宮內(nèi)膜分型差、血供減少、宮腔微環(huán)境異常及子宮內(nèi)膜容受性較低等問(wèn)題，GnRHa+HRT方案或單獨(dú)HRT方案可以獲得與NC方案相似的妊娠結(jié)局[8-9]，所以針對(duì)既往有不良孕產(chǎn)史的患者更傾向人工周期。PGT-SR患者主要因染色體異常（易位、倒位、致病性微缺失或微重復(fù)等）前來(lái)就診，這類患者的不孕病因較為明確，并非因異常的子宮內(nèi)膜容受性，在月經(jīng)周期及排卵規(guī)律的情況下，NC方案基本可滿足胚胎著床的要求。

但是，上述3個(gè)方案的FET應(yīng)用人群尚存在爭(zhēng)議，尤其是PGT胚胎的子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的研究很少。一項(xiàng)大型Meta分析顯示，沒(méi)有足夠的證據(jù)可以證明在FET的3種方案中哪種最優(yōu)[10]。一項(xiàng)關(guān)于PGT-A患者的FET周期方案的研究發(fā)現(xiàn)，NC方案和HRT方案的臨床妊娠率、流產(chǎn)率及活產(chǎn)率無(wú)顯著差異[7]。同時(shí)，NC方案和HRT方案的PGT患者的臨床妊娠率、活產(chǎn)率及早期流產(chǎn)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[11]。本研究也發(fā)現(xiàn)，PGT患者的FET周期中，3組內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的臨床妊娠率及活產(chǎn)率相似。此外，本研究顯示NC組的異位妊娠率高于GnRHa+HRT組，與HRT組無(wú)差異。既往研究表明，NC方案和HRT方案的異位妊娠風(fēng)險(xiǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.53%vs.0.47%，OR=1.12，95%CI：0.89～1.42）[12]。Pang等[13]也發(fā)現(xiàn)NC方案與HRT方案的異位妊娠率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1/98vs.1/76，P=0.877）。本研究與上述研究結(jié)論不一致可能是由于這些研究納入的研究對(duì)象幾乎是所有FET類型的體外受精/卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射（in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection，IVF/ICSI）患者，其不孕因素主要包括男方因素、輸卵管因素、子宮內(nèi)膜異位癥和內(nèi)分泌相關(guān)不孕等。異位妊娠的發(fā)生可能與輸卵管功能及盆腔環(huán)境異常相關(guān)。本研究對(duì)象全部為PGT患者，但并非所有的PGT患者都需要進(jìn)行輸卵管通暢度及功能的檢測(cè)。輸卵管盆腔因素已是公認(rèn)的異位妊娠的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]。之前研究指出，胚胎植入宮腔時(shí)，輸卵管功能如果受損將無(wú)法把胚胎送回宮腔，44%的胚胎會(huì)被推入輸卵管中[15]。因此，推測(cè)在行NC方案解凍移植時(shí)，輸卵管盆腔因素的異常很可能增加了異位妊娠發(fā)生率，但本研究樣本量有限，需更大樣本的研究進(jìn)行證實(shí)。

3.2 PGT活產(chǎn)結(jié)局的影響因素本研究結(jié)果還顯示，活產(chǎn)組中，BMI≤25 kg/m2、獲卵數(shù)＞12個(gè)、可移植胚胎數(shù)＞2個(gè)、優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)＞2個(gè)的周期比例較高（P＜0.05）。超重和肥胖女性的生育力較差，其IVF/ICSI的活產(chǎn)率降低，可能與卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞質(zhì)量、胚胎發(fā)育及宮腔環(huán)境等因素有關(guān)[16]。另外，獲卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)與活產(chǎn)的關(guān)系尚未統(tǒng)一。有研究表明，PGT-M/SR周期的活產(chǎn)率隨著獲卵數(shù)和可移植胚胎數(shù)的增加而上升[17]，與本研究結(jié)果一致。當(dāng)獲卵數(shù)超過(guò)10個(gè)，活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)，但也有其他研究指出，獲卵數(shù)超過(guò)18個(gè)時(shí)活產(chǎn)率不再增加。這很可能與隨獲卵數(shù)增加的卵巢過(guò)度刺激綜合征風(fēng)險(xiǎn)及未成熟卵比例增高有關(guān)[18]。在復(fù)蘇及選擇移植胚胎時(shí)，為了進(jìn)一步改善妊娠結(jié)局，應(yīng)優(yōu)先考慮優(yōu)質(zhì)囊胚[19]。同樣，在本研究中發(fā)現(xiàn)，優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)＞2個(gè)為PGT患者活產(chǎn)的保護(hù)因素。

3.3 結(jié)語(yǔ)針對(duì)PGT患者而言，3種常見內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的臨床妊娠率及活產(chǎn)率無(wú)明顯差別，但NC組的異位妊娠率高于GnRHa+HRT組，推測(cè)與輸卵管因素有關(guān)，PGT患者是否需要進(jìn)行輸卵管通暢度的檢查，還需大樣本的統(tǒng)計(jì)分析及進(jìn)一步探究，在臨床中可能需要注意。另外，PGT患者的活產(chǎn)率還可能與BMI、獲卵數(shù)、可移植胚胎數(shù)及優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)等因素有關(guān)。因此，在促排卵周期中，盡可能讓超重及肥胖的女性患者減重，把握卵巢刺激強(qiáng)度使獲卵數(shù)控制在一定數(shù)量，盡量不低于12枚，但也要同時(shí)防止卵巢過(guò)度刺激。另外，要重視影響囊胚培養(yǎng)過(guò)程的不利因素，在安全有效的原則下，建議提高優(yōu)質(zhì)囊胚數(shù)（＞2個(gè)），而不是僅僅追求總囊胚數(shù)量。本研究的局限性在于，PGT樣本例數(shù)有限（尤其是PGT-M類型），因此還需擴(kuò)大樣本例數(shù)及研究中心范圍，深入個(gè)體化研究，進(jìn)一步去闡述PGT患者與妊娠結(jié)局相關(guān)的影響因素，以提高PGT患者輔助生殖的活產(chǎn)率。