泛素C末端水解酶-L1的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

丁 浩,徐 輝,龔晨虎,張志宏

蘇州大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院胸外科，江蘇蘇州 215600

肺癌是目前全球發(fā)病率居于首位的惡性腫瘤,也是導(dǎo)致患者癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-3]。由于生活方式與環(huán)境的改變，肺癌的總體發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已成為威脅人類(lèi)健康的重大問(wèn)題。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是最常見(jiàn)的肺癌組織學(xué)類(lèi)型，腫瘤生長(zhǎng)速度快，腫瘤細(xì)胞容易從原發(fā)部位擴(kuò)散并轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔器官，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[4-5]。目前依然缺乏典型的分子標(biāo)志物用于NSCLC患者的早期診斷與預(yù)后評(píng)估。因此，尋找新的分子標(biāo)志對(duì)有效識(shí)別肺癌高危人群，深入了解NSCLC的生物學(xué)機(jī)制，對(duì)加快腫瘤的治療、研究意義重大。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是真核細(xì)胞維持細(xì)胞正常功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要組成部分，其通過(guò)泛素連接酶與靶蛋白結(jié)合，參與蛋白的降解與功能修飾[6-7]。另一方面，泛素-蛋白酶體也可以通過(guò)去泛素化酶(DUBs)使從其靶點(diǎn)上分離[8]。與泛素連接酶類(lèi)似，DUBs參與了細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程，目前已在許多人類(lèi)疾病中發(fā)現(xiàn)了DUBs的突變或表達(dá)水平失調(diào)[9-10]。泛素C末端水解酶-L1(UCH-L1)是去泛素化酶家族成員之一，研究表明它主要在腦組織中表達(dá)，在神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11-13]。盡管UCH-L1在其他組織中的表達(dá)水平較低，但在乳腺癌[14-15]、結(jié)直腸癌[16]、鼻咽癌[17-18]等癌癥中卻發(fā)現(xiàn)了UCH-L1的過(guò)表達(dá)，提示其可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。就生物學(xué)功能而言，有研究報(bào)道UCH-L1可能在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及化療耐藥中發(fā)揮促癌作用[19-22]。然而，目前尚不清楚UCH-L1在NSCLC中的表達(dá)水平及其預(yù)后意義。本研究利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)了UCH-L1基因在NSCLC組織中的表達(dá)情況，分析了其表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系，旨在揭示UCH-L1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其作為潛在預(yù)后標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2017年2月至2019年10月于本院胸外科接受根治性手術(shù)治療的112例NSCLC患者為研究對(duì)象，收集患者手術(shù)切除后的腫瘤組織與匹配的癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均行肺葉或肺段切除+區(qū)域淋巴結(jié)清掃，經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)證實(shí)為原發(fā)性NSCLC；(2)術(shù)前未接受放、化療、靶向治療等任何抗腫瘤措施。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前影像學(xué)或穿刺活檢已證實(shí)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或鎖骨上淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、有其他器官共存腫瘤者；(2)臨床病理資料缺失或失訪者。本研究經(jīng)本院倫理審核委員會(huì)批準(zhǔn)，組織樣本與臨床數(shù)據(jù)的使用在手術(shù)前均以書(shū)面形式獲得所有患者或其家屬的知情同意。

通過(guò)本院電子病例數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)收集所有研究對(duì)象的一般資料與臨床病理特征，包括：患者年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)類(lèi)型、組織學(xué)分級(jí)、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理學(xué)TNM分期等。肺癌TNM分期根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)制定的第8版分期手冊(cè)進(jìn)行分類(lèi)[23]。

1.2免疫組化染色與結(jié)果判讀 所有組織樣本在取材收集后立即置于福爾馬林緩沖液中固定，常規(guī)石蠟包埋，制成3～5 μm厚度的組織切片。二甲苯中脫蠟、梯度乙醇脫水后，將組織切片置于檸檬酸鹽緩沖液(pH=7.4)中進(jìn)行抗原修復(fù)；使用3%過(guò)氧化氫溶液抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，5%胎牛血清降低非特異性結(jié)合，按照說(shuō)明書(shū)以1∶100比例稀釋抗UCH-L1的小鼠單克隆抗體(產(chǎn)品編號(hào)：sc-100340，Santa技術(shù)公司，美國(guó))，室溫下孵育一抗過(guò)夜。PBS緩沖液清洗切片3次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(產(chǎn)品編號(hào)：PV-9001，中杉金橋，中國(guó))，于室溫下孵育30 min。最后，使用二氨基聯(lián)苯胺對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行可視化，蘇木素復(fù)染，依次經(jīng)過(guò)梯度乙醇進(jìn)行脫水處理、二甲苯透明化，中性樹(shù)膠封片固定。

根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性染色范圍對(duì)UCH-L1的表達(dá)水平進(jìn)行半定量分析，具體方法如下：光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性染色細(xì)胞<5%計(jì)0分，>5%～25%計(jì)1分，>25%～50%計(jì)2分，>50%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)染色計(jì)0分，呈淡黃染色計(jì)1分，呈黃染色計(jì)2分，呈棕黃染色計(jì)3分。陽(yáng)性染色細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度得分的乘積即為免疫組化染色的總分，≤4分定義為陰性表達(dá)，>4分定義為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3觀察結(jié)局 術(shù)后對(duì)所有接受手術(shù)治療的NSCLC患者進(jìn)行定期隨訪，通過(guò)查閱門(mén)診或住院病例及電話探訪等方式了解患者的生存狀態(tài)。研究以總體生存率(OS)作為主要觀察結(jié)局，將其定義為患者自手術(shù)之日起至術(shù)后因任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間段。截至末次隨訪，研究隊(duì)列無(wú)失訪病例，中位隨訪時(shí)間為26.7(15.5～39.0)個(gè)月。

2 結(jié) 果

2.1研究對(duì)象的基本特征 本研究系統(tǒng)收集了112例接受手術(shù)治療的NSCLC患者的一般資料與臨床病理特征，包括男67例(59.8%)和女45例(40.2%)，平均年齡(61.8±9.6)歲，59.8%(67/112)的患者有長(zhǎng)期吸煙史；根據(jù)組織學(xué)類(lèi)型，共有鱗癌52例(46.4%)，腺癌60例(53.6%)；全組患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為57.1%(64/112)，根據(jù)第8版肺癌病理學(xué)TNM分期，共有Ⅰ期患者31例(27.7%)、Ⅱ期25例(22.3%)、Ⅲ期56例(50.0%)。

2.2UCH-L1在NSCLC樣本中的表達(dá)及其與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系 免疫組化染色顯示，UCH-L1蛋白在腫瘤組織中呈廣泛陽(yáng)性表達(dá)或高表達(dá)，但在癌旁組織中呈陰性表達(dá)或低表達(dá)，見(jiàn)圖1。通過(guò)分析UCH-L1在112例配對(duì)NSCLC組織中的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UCH-L1在66.1%(74/112)的腫瘤組織中呈不同程度的陽(yáng)性表達(dá)。

表1 UCH-L1蛋白在NSCLC及癌旁組織中的表達(dá)(免疫組化染色×200)

根據(jù)UCH-L1在NSCLC樣本中的表達(dá)水平，將所有患者分為高表達(dá)組(n=74)與低表達(dá)組(n=38)。UCH-L1表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系見(jiàn)表1。UCH-L1高表達(dá)組的組織學(xué)分級(jí)(G3:64.9%vs.44.7%,χ2=4.177,P=0.041)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率(64.9%vs.42.1%,χ2=5.311,P=0.021)較低表達(dá)組更高，而腫瘤分期更為進(jìn)展(TNM Ⅲ期:59.5%vs.31.6%,χ2=7.925,P=0.019)。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者在年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)類(lèi)型及T分期等變量分布上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

注：A為NSCLC；B為癌旁組織。圖1 UCH-L1表達(dá)與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3UCH-L1表達(dá)在NSCLC患者中的預(yù)后意義 112例NSCLC患者均被納入生存分析，隨訪期內(nèi)共37例(33.0%)患者觀察到主要結(jié)局事件，3年OS為54.5%。Kaplan-Meier生存曲線顯示，UCH-L1高表達(dá)組的3年OS顯著低于UCH-L1低表達(dá)組，分別為39.1%和78.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.181,P=0.002)。見(jiàn)圖2。

圖2 UCH-L1高表達(dá)與低表達(dá)者的Kaplan-Meier生存曲線

單因素分析的結(jié)果顯示，組織學(xué)分級(jí)(P=0.013)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.013)和UCH-L1表達(dá)(P=0.004)與NSCLC患者不良預(yù)后具有顯著相關(guān)性，見(jiàn)表2。

表2 NSCLC患者預(yù)后因素的Cox單因素分析

通過(guò)多因素分析調(diào)整潛在的混雜因素，本研究發(fā)現(xiàn)，UCH-L1高表達(dá)(HR=3.024,95%CI：1.311～6.973，P=0.009)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=2.092,95%CI：1.012～4.327，P=0.046)和組織學(xué)分級(jí)(HR=2.153,95%CI：1.062～4.363，P=0.033)仍然是3個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的預(yù)后變量，是NSCLC患者不良OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。見(jiàn)表3。

表3 NSCLC患者預(yù)后因素的Cox多因素分析

3 討 論

作為一種去泛素化酶，UCH-L1的異常高表達(dá)已在多種惡性腫瘤中被報(bào)道，被認(rèn)為是乳腺癌、前列腺癌的促瘤蛋白[21,24-25]。然而，也有研究在卵巢癌、胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤等其他樣本中發(fā)現(xiàn)了UCH-L1表達(dá)水平的下調(diào)[26-28]。因此，UCH-L1在人類(lèi)癌癥中的表達(dá)水平及功能作用可能具有一定組織特異性。目前，尚不完全清楚UCH-L1在NSCLC樣本中的表達(dá)水平、臨床意義及其在惡性進(jìn)展中的生物學(xué)功能。在本研究中，筆者應(yīng)用免疫組化染色法檢測(cè)了UCH-L1在112例NSCLC組織樣本中的表達(dá)情況，分析了其表達(dá)水平與腫瘤臨床病理特征的相關(guān)性，探討了UCH-L1作為NSCLC患者預(yù)后標(biāo)志物的臨床價(jià)值。結(jié)果顯示UCH-L1蛋白在大多數(shù)NSCLC腫瘤樣本中呈陽(yáng)性表達(dá)，并與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級(jí)顯著相關(guān)。這些研究表明UCH-L1或許在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中起著決定性的作用，可能是腫瘤具有高侵襲性生物學(xué)行為的標(biāo)志。生存分析進(jìn)一步證實(shí)，UCH-L1高表達(dá)組的OS顯著低于低表達(dá)組，UCH-L1高表達(dá)水平是NSCLC患者預(yù)后不佳的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。因此，醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)在隨訪期間和制訂治療方案對(duì)這些患者予以特別關(guān)注。

SCHRODER等[14]通過(guò)組織微陣列技術(shù)證實(shí)了UCH-L1蛋白在1622例乳腺癌患者樣本中的高表達(dá)，并與雌、孕激素受體陰性及不良預(yù)后顯著相關(guān)，該研究與本文數(shù)據(jù)一致。JIN等[29]報(bào)道了UCH-L1表達(dá)在肝門(mén)部膽管癌中的表達(dá)及臨床意義，結(jié)果表明UCH-L1在62.1%的組織樣本中呈明顯過(guò)表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和血清CA19-9水平等腫瘤的侵襲性特征呈明顯正相關(guān)，是肝門(mén)膽管癌患者的預(yù)后預(yù)測(cè)因素。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示，沉默UCH-L1表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖。還有研究證實(shí)，沉默UCH-L1的表達(dá)通過(guò)阻止上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲性[25]。盡管鮮有研究報(bào)道UCH-L1在NSCLC中的表達(dá)水平，但在一項(xiàng)之前的研究中，KIM等[30]通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)UCH-L1可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與侵襲，表明UCH-L1可能作為一種癌蛋白在肺癌中發(fā)揮促癌作用。屈肖杰等[31]通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染下調(diào)UCH-L1表達(dá)水平后，也發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞系H157在體外的增殖能力明顯受限，細(xì)胞凋亡顯著增加。最近，有研究人員發(fā)現(xiàn)在缺氧環(huán)境下，人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中UCH-L1的表達(dá)水平顯著提升，同時(shí)增強(qiáng)了TGF-β/SMAD誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)肺癌的發(fā)生[32]。這些發(fā)現(xiàn)均表明，具有去泛素化活性的UCH-L1是肺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，以UCH-L1作為靶點(diǎn)或許是一種有價(jià)值的肺癌治療策略。

綜上所述，這項(xiàng)研究證實(shí)了UCH-L1在可切除NSCLC患者中的異常高表達(dá)水平，這與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤組織學(xué)分級(jí)等侵襲性特征顯著相關(guān)。更為重要的是，UCH-L1水平可作為NSCLC患者的獨(dú)立預(yù)后分子標(biāo)志。這些發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步探索UCH-L1在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制提供了依據(jù)，也為臨床醫(yī)生篩選高危人群、制訂治療方案提供了參考。