石蠟切片改良技術及其在懷山藥干燥中的應用

張樂道，曹世英，王國澤，程立坤，云月英，盧俊

(內蒙古科技大學 生命科學與技術學院，內蒙古 包頭，014010)

石蠟切片技術是觀察植物組織結構最重要的技術之一[1-2]。該技術可以很好地將石蠟與植物組織結合，經過固定、脫水、透明、染色等一系列特殊的方法制成透明的薄片，在顯微鏡或電子顯微鏡下觀察，可如實地反映細胞組織的結構和形態(tài)變化，定量地測定物料中組織結構的大小、數(shù)量及所含物質的量的多少[3-4]。

石蠟切片結合圖像處理技術可以定量地對細胞結構的變化指標進行測定。近年來，越來越多的人關注果蔬干燥過程中微觀結構的變化。常劍等[5]運用石蠟切片技術獲得了馬鈴薯、蘋果、胡蘿卜薄壁組織細胞結構圖像，通過Motic Images Plus 2.0軟件測量細胞的面積、周長，計算出細胞當量直徑和圓度，分析熱風干燥對果蔬薄壁組織結構的變化，建立了微觀參數(shù)與宏觀參數(shù)(水分比)的數(shù)學模型。郭徽[6]利用石蠟切片技術獲得了不同干燥方法三七主根組織微觀圖像，運用圖像處理技術計算出面積分形維數(shù)以及迂曲分形維數(shù)，建立了三七主根內部傳質的數(shù)學模型。韋玉龍等[7-8]利用石蠟切片結合圖像處理技術獲得了熱風干制過程中棗果細胞、空腔等結構隨含水率變化的分布曲線，建立了非線性模型，預測了干制過程中細胞、空腔等結構的變化情況。楊佳琪[9]運用石蠟切片技術獲得了熱風干燥蜜桃和胡蘿卜的組織微觀結構圖像，運用MATLAB和Photoshop等圖像處理軟件獲得相關微觀參數(shù)，以含水率為指標進行分析，進一步得到了干燥過程中物料的微觀與宏觀結構參數(shù)的關系。ONG等[10]利用掃描電鏡獲取了熱燙預處理后不同干燥方法的水果果實微觀結構，表明不同干燥溫度對水果果實薄壁細胞形狀和完整度有顯著的影響。MOREIRA等[11]使用刀片徒手切片后甲苯胺酮溶液染色，獲取了新鮮、滲透脫水、風干和復水后板栗的微觀結構，通過UTHSCSA Image Tool v.2.0等軟件計算出板栗細胞大小和形狀參數(shù)，對比了新鮮板栗和不同脫水處理后板栗微觀結構的變化。

與掃描電鏡相比，石蠟切片技術具有廉價、實時監(jiān)測、制作簡單等優(yōu)點。目前，傳統(tǒng)石蠟切片技術多數(shù)針對新鮮果蔬物料，本文針對干制懷山藥硬度較大、含水率較低的特點，在傳統(tǒng)的石蠟切片技術基礎上進行改良，探索出適合干制懷山藥的石蠟切片技術。利用改良技術觀察了熱風干燥、真空干燥和微波真空冷凍干燥懷山藥的微觀結構，該技術為研究干燥物料微觀結構提供良好的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮懷山藥產自河南焦作溫縣，2021年4月在中國特產溫縣館采購，所選懷山藥外形完整、粗細均勻、表皮無酶、無病蟲害、肉質潔白，置于4 ℃冰箱備用。

1.2 設備與試劑

HistoCore MULTICUT輪轉式切片機，徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司；ZXRD-B5110熱風干燥箱，上海智城分析儀器制造有限公司；DZF-6050B真空干燥箱，上海一恒科學有限公司；DK-90-II電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；Nikon Eclipse Ti倒置熒光顯微鏡，尼康映像儀器銷售(中國)有限公司；SQP-QUINTIX124-1CN電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；DHS16-A多功能紅外水分測定儀，上海精密科學儀器有限公司；微波真空冷凍干燥機，自制(設備原理參考文獻[12])；GR-B2471PKF冰箱，泰州樂金電子冷機有限公司。

二甲苯、冰乙酸、固綠，上海麥克林生化科技有限公司；甲醛、無水乙醇、95%乙醇，天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；鹽酸，北京化工廠；石蠟48～50 ℃，北京索萊寶科技有限公司；中性樹膠，美侖生物科技有限公司；番紅，上海源葉生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計

本實驗分別選用熱風干燥(hot-air drying, HAD)：溫度45、50、55 ℃；真空干燥(vacuum drying, VD)：溫度50、55、60 ℃，壓強0.9×105Pa；微波真空冷凍干燥(microwave vacuum freeze drying, MFD)：微波功率0.225、1、1.5 W/g，壓強50、100、150、200 Pa。每個干燥條件下裝載量為(50.000±0.050) g，含水率≤10%(濕基含水率)時干燥結束。每個干燥條件的物料被分為2組，第1組取4/5懷山藥，用于測量懷山藥干制過程中的含水率。第2組取1/5懷山藥，用于制作石蠟切片觀察，尺寸約為5 mm×5 mm×4 mm的薄塊，放入甲醛-乙醇-冰乙酸固定液(formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative, FAA)中保存。

1.3.2 初始含水率的測定

開啟顯示器預熱30 min，同時進行功能自檢，在預熱期間將待測的懷山藥切碎(2 mm)，待預熱結束，設定加熱溫度105 ℃、加熱時間120 min，稱量切碎的物料10 g，開始工作。待測定結束，點擊功能鍵查看物料含水率。

1.3.3 濕基含水率的測定

干燥試驗過程中物料濕基含水率[13]的計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ωt,任意干燥t時刻物料濕基含水率，%；ω0,物料初始濕基含水率，%；mt,任意干燥t時刻的質量，g；m0,物料初始質量，g。

1.3.4 傳統(tǒng)石蠟切片技術

傳統(tǒng)的石蠟切片技術是選用新鮮的物料[14]，進行FAA或多聚甲醛固定液固定，梯度乙醇脫水，V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1、二甲苯、二甲苯按順序透明，舊蠟液40 ℃恒溫箱過夜、純蠟換3次，切片，展片，二甲苯脫蠟，番紅-固綠二重染色，封片，拍照觀察。

1.3.5 改良石蠟切片技術

干制懷山藥的特點是硬度較大、含水率較低[15-16]，造成溶液不宜滲透，固定、脫水、透明、浸蠟等過程難度大，且切出的薄片容易斷裂，染色效果較差。有研究表明，針對干、硬物料制作石蠟切片需因材制宜，因此本文參考文獻[14,17]在傳統(tǒng)石蠟切片基礎上增加了軟化預處理的過程、加長固定時間以達到良好的切片效果。

1.3.5.1 取材、軟化、固定

物料尺寸5 mm×5 mm×4 mm，在體積分數(shù)20%的鹽酸中浸泡12 h，將浸泡好的物料瀝干投入FAA固定液中固定，放入搖床，溫度設置為室溫，待36 h后將固定好的物料流水沖洗過夜。

1.3.5.2 脫水、透明

梯度乙醇脫水：50%→70%→85%→95%→100%→100%→V(乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1→二甲苯→二甲苯，各1.5 h

透明、脫水的過程在室溫下進行。

1.3.5.3 浸蠟、包埋

V(二甲苯)∶V(蠟液)=2∶8→新蠟液→新蠟液→包埋

V(二甲苯)∶V(蠟液)=2∶8浸蠟過夜、新蠟液分別浸蠟2 h、包埋需在浸蠟結束后立即進行。浸蠟的過程在恒溫箱中進行，恒溫箱的溫度不宜太高，應設置高于石蠟熔點2～3 ℃。

1.3.5.4 切片、展片、烤片

將包埋好的蠟塊修成梯形→設置切片厚度(10～12 μm)→切片→展片(水浴鍋溫度40 ℃)→撈片→烤片(恒溫干燥箱溫度40 ℃)

1.3.5.5 脫蠟、染色

二甲苯20 min→二甲苯20 min→V(無水乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1 10 min→100%乙醇20 min→95%乙醇10 min→浸入番紅染液中1 h→85%乙醇1 min(去浮色)→固綠染色液5～10 s→95%乙醇1 min→100%乙醇1 min→二甲苯10 min→二甲苯10 min

1.3.5.6 封片、鏡檢

封片是將蓋玻片一側放置在滴有中性樹膠的組織切片上，隨后緩慢放下并將空氣完全排除，避免水蒸氣進入，封片后將樣片轉于37 ℃恒溫箱中烘干，即可長久保存。鏡檢是使用倒置熒光顯微鏡與NIS-Elements成像系統(tǒng)觀察與拍照。

2 結果與分析

2.1 改良技術對干制懷山藥石蠟切片效果的影響

改良前后石蠟切片效果的對比如圖1所示。

圖1 改良前后石蠟切片效果的對比Fig.1 Comparison of paraffin section before and after improvement

因為干制懷山藥干、硬的特點，運用傳統(tǒng)石蠟切片技術制作時物料不易滲透溶液，導致切片局部碎裂，無法進行展片、染色等步驟。傳統(tǒng)石蠟切片制作的微波真空冷凍干燥懷山藥的橫縱切片均出現(xiàn)局部碎裂的情況，不利于后續(xù)石蠟切片制作。與傳統(tǒng)石蠟切片比較，改良石蠟切片技術可以制出完整連續(xù)的薄片，組織容易滲透溶液，后續(xù)染色效果很好，適用于熱風干燥、真空干燥、微波真空冷凍干燥的干制懷山藥石蠟切片制作。

2.2 不同干燥方法對懷山藥微觀結構的影響

石蠟切片技術與掃描電鏡均可以觀察果蔬組織微觀結構。本文運用改良石蠟切片技術對新鮮懷山藥和干制懷山藥進行橫切和縱切，橫、縱截面懷山藥的微觀結構圖像如圖2所示。

圖2 不同干燥方法下懷山藥改良石蠟切片截面圖(×400)Fig.2 Cross-section of paraffin sections of Diosocorea opposita with different drying methods (×400)

熱風干燥的懷山藥微觀結構細胞壁破壞嚴重，組織結構致密，真空干燥的懷山藥微觀結構存在一定的水分蒸發(fā)通道，熱風干燥與真空干燥微觀結構變化較為相似，都是使物料的細胞壁失去了飽滿而立體的狀態(tài)，皺縮嚴重，與淀粉顆粒包裹在一起，但細胞結構框架依稀可辨，該現(xiàn)象與文獻[18]觀察到的一致，表明溫度是導致細胞壁皺縮的首要因素；微波真空冷凍干燥的懷山藥微觀結構輪廓較清晰，細胞具有明顯的蜂窩狀結構，該現(xiàn)象與文獻[19]觀察到的一致，表明微波真空冷凍干燥在冷凍階段已經形成了多孔的細胞結構，這個孔道在后續(xù)的微波真空干燥過程中得到了保持。與鮮樣相比干制懷山藥的細胞組織結構變化很大，鮮樣的組織細胞結構松散，具有均勻的多孔結構，經過干燥處理之后，細胞壁皺縮、組織結構變得致密，由于干燥方法不同，去除水分的原理不同，造成懷山藥細胞中水分遷出分布不同，淀粉與水之間的結合力改變，導致懷山藥細胞結構發(fā)生變化。

2.3 熱風干燥溫度對懷山藥微觀結構的影響

熱風干燥的懷山藥微觀結構橫、縱截面如圖3所示。溫度45 ℃時橫截面木質纖維破壞嚴重、縱截面孔道結構致密且淀粉粒分布收縮；溫度50 ℃時橫截面木質纖維破壞嚴重但是淀粉粒具有蜂窩狀結構、縱截面孔道結構致密且淀粉粒分布收縮；溫度55 ℃時橫截面木質纖維破壞嚴重且具有空洞，縱截面孔道結構致密且淀粉粒分布收縮。說明干燥溫度越高對物料的細胞壁破壞程度、皺縮程度影響越大。

圖3 不同溫度下熱風干燥的改良石蠟切片截面圖(×400)Fig.3 Cross-section of paraffin sections blast drying at different temperatures (×400)

2.4 真空干燥溫度對懷山藥微觀結構的影響

真空干燥懷山藥的微觀結構橫、縱截面見圖4。

圖4 不同溫度下真空干燥的改良石蠟切片截面圖(×400)Fig.4 Cross-section of paraffin sections vacuum drying at different temperatures (×400)

溫度50 ℃，壓強0.9×105Pa時橫截面木質纖維被破壞、出現(xiàn)較大空洞，縱截面孔道結構松散、淀粉粒具有蜂窩狀結構；溫度55 ℃，壓強0.9×105Pa時橫縱截面木質纖維均破壞嚴重，出現(xiàn)較大空洞，淀粉粒收縮，縱截面孔道結構致密；溫度60 ℃，壓強0.9×105Pa時橫截面木質纖維均破壞嚴重，出現(xiàn)空洞，縱截面出現(xiàn)大面積空洞。說明真空干燥與熱風干燥對懷山藥組織的微觀結構破壞程度相似，但是在壓強的作用和溫度越高時更容易出現(xiàn)大面積的空洞。

2.5 微波真空冷凍干燥的功率、壓強對懷山藥微觀結構的影響

微波真空冷凍干燥的懷山藥微觀結構橫、縱截面如圖5所示。

圖5 不同微波功率、壓強下微波真空冷凍干燥的石蠟切片截面圖(×400)Fig.5 Cross-section of paraffin section microwave vacuum freeze-drying at different microwave power and vacuum degree (×400)

壓強200 Pa，微波功率0.225 W/g時橫截面空腔結構致密、縱截面木質纖維破壞較小；壓強150 Pa，微波功率0.225 W/g時橫截面木質纖維破壞較小、縱截面淀粉粒具有蜂窩狀結構；壓強100 Pa，微波功率0.225 W/g時橫縱截面木質纖維破壞、空腔結構致密；壓強50 Pa，微波功率0.225 W/g時橫截面空腔結構、木質纖維保持最完整；壓強100 Pa，微波功率1 W/g時橫截面具有蜂窩狀結構、縱截面木質纖維保持較好且淀粉粒分布具有蜂窩狀結構；壓強200 Pa，微波功率1.5 W/g時橫截面結構致密但是出現(xiàn)水分通道、縱截面出現(xiàn)空洞。說明微波真空冷凍干燥可以很好地保持多孔介質的組織結構，相對壓強越高時越容易出現(xiàn)結構致密和水分通道的現(xiàn)象，壓強一定時微波功率的影響很小。

3 結論

改良石蠟切片技術溶液滲透效果較好，原有細胞形態(tài)保持良好，脫水透明時組織不易發(fā)脆，浸蠟時不會引起材料變脆、變硬而收縮，切片時可以形成完整的蠟帶，不易碎裂，染色效果好、不易發(fā)生掉片現(xiàn)象。

運用改良石蠟切片技術觀察懷山藥的微觀結構，其中熱風干燥的懷山藥溫度越高，木質纖維破壞越嚴重；真空干燥的懷山藥壓強與溫度越高越容易出現(xiàn)大面積空洞；微波真空冷凍干燥的懷山藥壓強越高越容易出現(xiàn)結構致密的現(xiàn)象和空洞，壓強一定時微波功率的影響較小。

綜合來看，改良石蠟切片技術結合顯微成像技術可以得到組織完整的石蠟切片圖像，能夠清楚地分析干燥后物料組織的細胞及細胞與細胞之間的孔道網絡，為干燥物料觀察微觀結構提供了一套具體的操作步驟。