氧化應(yīng)激對宰后獺兔肉肌肉品質(zhì)、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)氧化的影響

陳煉紅，王琳琳，張巖，簡文素，汪平*

1(西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都，610041)2(西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都，610041)3(四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都，610000)

獺兔是一種草食性皮肉兼用型經(jīng)濟動物，其肉質(zhì)蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸含量高，脂肪含量低，其他微量元素也較豐富，可預(yù)防心腦血管疾病，是一種營養(yǎng)較全面的動物性食品，市場應(yīng)用前景較好[1-2]。宰后成熟過程中肌肉內(nèi)部所發(fā)生的各種復(fù)雜生理生化反應(yīng)導(dǎo)致肌肉品質(zhì)和理化性質(zhì)等發(fā)生改變，使動物胴體逐漸由肌肉轉(zhuǎn)變成可食用肉，是一種有效改善肉品質(zhì)量的途徑[3]，獺兔肉與牛羊肉類似也可通過宰后成熟過程改善肌肉品質(zhì)[4]。

本實驗以四川草業(yè)科學(xué)研究所培育的川白獺兔肉為實驗對象，用H2O2和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)對宰后獺兔肉進行處理，建立肌肉氧化和還原模型，研究處理組和空白組獺兔肉食用品質(zhì)、脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)氧化在成熟過程中的變化規(guī)律，并探究肌肉中ROS的積累、清除和對照組之間脂質(zhì)氧化和蛋白氧化之間的差異，最終明確氧化應(yīng)激影響獺兔肉肌肉品質(zhì)形成的可能機制，為提高獺兔肉品質(zhì)及精深加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品處理及采集：選取150日齡獺兔，由四川草業(yè)科學(xué)研究所自主培育。以宰后獺兔后腿肉為試驗材料，剔除脂肪、筋和膜后，分割切塊。將肉塊隨機分成3組，做3種處理(50 mmol/L H2O2，50 mmol/L NAC，0.9%的鹽水)，按肉液比(10∶1,g∶mL)均勻注射，在冷藏條件下分別成熟6、12、24、72、120、168 h后在相應(yīng)時間點取樣，測定相關(guān)指標。

試劑：硫代巴比妥酸、三氯乙酸、氯仿、丙酮、石油醚、硫酸亞鐵、H2O2、N-乙酰半胱氨酸、亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、濃鹽酸、濃硫酸、溴酚藍、乙酸乙酯、尿素、2，4-二硝基苯肼、5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，以上均為分析純，成都市科龍化工試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

pHS-3型pH計，上海日島儀器廠；CR-400型色差儀，日本Konica Minolta公司；U2800紫外分光光度計，日本日立高技術(shù)公司；DS-1高速組織搗碎機，上海標本模型廠；22K高速真空離心機，長沙英泰儀器有限公司；UV-6100型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.3 指標及測定方法

1.3.1 氧化應(yīng)激水平

ROS水平：參照張玉林[15]的方法測定肌肉ROS含量。

超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性用SOD活性檢測試劑盒測定[16]。用酶標儀在波長550 nm處測定吸光度值，以無添加肉樣的溶液為對照組；測定樣品的蛋白濃度，根據(jù)公式(1)計算酶活性。

(1)

1.3.2 食用品質(zhì)

pH值參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。

肉色參照文獻[4]方法測定。選取肉樣的3個不同位置作為測量點，測定每個肉樣的紅色度a*值。

蒸煮損失參照李婉竹[17]方法。割掉肉中的筋、膜與脂肪，切成3 cm厚，稱重，質(zhì)量記為m1，裝入保鮮袋中，將電子溫度計插入肉塊中心后扎緊袋口，80 ℃水浴加熱，溫度計顯示溫度達到70 ℃時取出冷卻至室溫，肉樣表面水分吸干，稱重記為m2。計算如公式(2)所示：

(2)

剪切力參照戴四發(fā)等[18]方法。將整塊肉裝袋，浸入溫度為80 ℃的恒溫水浴鍋中，溫度計插入肉塊中心，到溫度為70 ℃時取出，冷卻至室溫，吸干表面殘余水分。將肉塊用剪切力儀測定剪切力值。

1.3.3 肌肉新鮮度

過氧化值(peroxide value，POV)參照GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》。

硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)含量參照FAUSTMAN等[19]方法測定。

揮發(fā)性鹽基氮(total volatile base nitrogen，TVB-N)參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》。

1.3.4 蛋白氧化程度

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)提取參照XIONG等[20]的方法。

濁度參照韓敏義等[21]的方法。取MP沉淀溶入磷酸鹽緩沖液(0.6 mol/L NaCl，50 mmol/L Na2HPO4，pH 6.25)中，制成蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的溶液，在室溫下放置20 min后，以磷酸緩沖液為空白溶液，在340 nm處測定吸光值，該吸光度值即為肌原纖維蛋白的濁度。

溶解度參照AGYARE等[22]的方法。取肌原纖維蛋白溶液在4 ℃條件下放置60 min后取出，在4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，留上清液，測定其蛋白濃度，未加入蛋白的磷酸鹽緩沖溶液作空白組。溶解度計算如公式(3)所示：

(3)

羰基含量參照李學(xué)鵬等[23]方法測定;巰基含量按照THANNHAUSER等[24]方法測定。

表面疏水性參照CHELH等[25]方法。取1 mL 2.5 mg/mL蛋白質(zhì)溶液和200 mL 1.0 mg/mL溴酚藍，加入離心管中，同時設(shè)置對照(0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液1.0 mL，1.0 mg/mL溴酚藍200 μL于離心管中)，室溫下振蕩10 min，在8 000 r/min條件下離心10 min，取400 μL上清液稀釋10倍，在波長595 nm處測定吸光度值，記作A樣品，空白為0.02 mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，吸光度記作A空白。表面疏水基含量計算如公式(4)所示：

(4)

二硫鍵含量參照THANNHAUSER等[24]方法作適當(dāng)修改。取0.5 mL 4.0 mg/mL的混合蛋白溶液，加入3.0 mL新配NTSB(2-nitro-5-thiosulfobenzoate)檢測溶液(pH 9.5)，混勻后在暗處反應(yīng)25 min，波長412 nm處測定吸光值。二硫鍵含量按公式(5)計算：

(5)

式中：B,稀釋倍數(shù)，此處為1.46；ρ,混合蛋白溶液質(zhì)量濃度,mg/mL。

1.4 統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)測定的平均值，結(jié)果用平均值±標準差表示。利用SPSS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析獲得平均值和標準差，采用Duncan多重比較進行顯著性方差分析，顯著性水平P<0.05。采用Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中氧化應(yīng)激水平的影響

如圖1-a所示，H2O2處理組ROS水平呈先顯著上升后下降趨勢(P<0.05)；NAC處理組和空白組ROS水平呈先下降后上升趨勢，并分別在120 h和72 h達到最大值隨后顯著下降(P<0.05)。6～168 h，H2O2處理組ROS水平均顯著高于其他2組，空白組ROS水平也顯著高于NAC處理組(P<0.05)，此結(jié)果與張玉林[15]研究相一致，均說明H2O2處理可提高宰后肌肉ROS水平，而NAC作為一種ROS自由基清除劑使處理組ROS水平降低。

a-ROS水平；b-SOD活性圖1 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中氧化應(yīng)激水平的影響Fig.1 Effects of H2O2 and NAC treatment on oxidative stress levels of rex rabbit meat注：不同小寫字母代表差異顯著，P<0.05(下同)

SOD的活性反應(yīng)肌肉中的抗氧化能力，SOD通過將自由基轉(zhuǎn)化為H2O2，再被過氧化氫酶和氧化酶轉(zhuǎn)化為水，起到減少自由基保護細胞的作用[26]。由圖1-b可知，H2O2處理組SOD活性呈顯著下降趨勢(P<0.05)，原因可能是肌肉經(jīng)處理后產(chǎn)生的過量ROS自由基，使其內(nèi)部抗氧化系統(tǒng)遭到破壞并失去平衡，從而提高了肌肉的氧化應(yīng)激水平；同時，整個成熟過程，H2O2處理組SOD活性均顯著低于空白組和NAC處理組；空白組和NAC處理組SOD活性均在24 h達到最大值，并存在顯著差異(P<0.05)。綜上所述，H2O2處理顯著提高了肌肉ROS水平，降低SOD活性，減弱了肌肉抗氧化能力，進而提高了肌肉的氧化應(yīng)激水平，并可能進一步影響肌肉品質(zhì)。

2.2 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中肌肉食用品質(zhì)的影響

由圖2-a可知，3個處理組pH均呈先顯著下降后上升趨勢，原因是糖原的無氧酵解產(chǎn)生了乳酸以及能量降解反應(yīng)產(chǎn)生了一些酸性離子，最終導(dǎo)致肌肉pH下降。6～24 h，H2O2處理組pH顯著下降，并顯著低于空白組和NAC處理組(P<0.05)，與文獻[27]報道類似。6～24 h，NAC處理組pH均顯著高于空白組(P<0.05)，但在72～120 h無顯著差異，說明NAC通過抑制肌肉的氧化，抑制了糖酵解反應(yīng)減少乳酸產(chǎn)生從而提高了肌肉的pH。由圖2-b可知，3個處理組a*值整體均呈顯著下降趨勢(P<0.05)，原因是宰后肌肉中氧合肌紅蛋白不穩(wěn)定，慢慢氧化成高鐵肌紅蛋白而使a*下降。6～168 h，NAC處理組和空白組a*值均高于H2O2處理組，并在6～72 h差異顯著(P<0.05)，說明H2O2處理介導(dǎo)的氧化應(yīng)激不利于肌肉色澤穩(wěn)定；12～ 24 h，NAC處理組a*值顯著高于空白組(P<0.05)，但在成熟后期無顯著差異，說明NAC的抗氧化作用在一定程度上對肉色起到保護作用。

a-pH；b-a*值；c-蒸煮損失；d-剪切力圖2 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中食用品質(zhì)的影響Fig.2 Effects of H2O2 and NAC treatment on edible quality of rex rabbit meat

由圖2-c可知，3個處理組蒸煮損失均呈先增大后減小趨勢(P<0.05)。6～168 h，H2O2處理組蒸煮損失均顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)；同時，空白組蒸煮損失也顯著高于NAC處理組(P<0.05)，與文獻[28]報道相一致，均說明氧化會加重肌肉蒸煮損失。原因可能是H2O2通過加劇肌肉的氧化應(yīng)激，提高糖酵解速度而降低pH值，加快蛋白質(zhì)的變性進而減弱了其對水分的結(jié)合力，加之肌肉中的骨架蛋白被慢慢降解，肌原纖維間隙增加，細胞外水重新滲入細胞內(nèi)，使肌肉的持水力提高[29]。如圖2-d所示，3個處理組肌肉剪切力值均呈先增大后減小趨勢。成熟24 h時，H2O2處理組剪切力達到最大2 164.52 gf，顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)，說明H2O2處理組獺兔肉比NAC處理組和空白組提前進入僵直階段；72～168 h，H2O2處理組剪切力值均顯著小于NAC處理組，且72～168 h時，NAC處理組剪切力值均顯著小于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理可在一定程度上促進肌肉成熟，而抗氧化劑NAC起相反作用。

2.3 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中肌肉新鮮度的影響

由圖3-a可知，12～168 h，3個處理組POV總體均呈顯著上升變化(P<0.05)，且H2O2處理組POV的變化最為明顯，說明宰后成熟過程中肌肉中脂質(zhì)氧化逐漸加大。6～168 h，H2O2處理組POV均顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)；12～168 h(24 h除外)，NAC處理組POV均顯著低于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理明顯提高了肉中POV，促進肌肉脂質(zhì)氧化程度，原因在于ROS的促氧化作用，而NAC的抗氧化作用則顯著降低了肌肉的脂質(zhì)氧化程度。

a-POV值；b-TBARS值；c-TVB-N值圖3 H2O2、NAC處理對宰后獺兔肉成熟過程中新鮮度的影響Fig.3 Effects of H2O2 and NAC treatment on freshness of rex rabbit meat

如圖3-b所示，6～24 h，3個處理組TBARS值均呈緩慢上升趨勢，72 h后顯著上升(P<0.05)。6～168 h，H2O2處理組TBARS值顯著高于NAC處理組和空白組(P<0.05)；同時，NAC處理組TBARS值顯著低于空白組。新鮮肉和肉制品的脂肪酸敗臨界值是0.5 μg/g，6～72 h H2O2處理組TBARS值在臨界值內(nèi)；6～120 h NAC處理組TBARS值在臨界值內(nèi)，說明ROS促進了脂肪的氧化，加快了脂肪的酸敗，而抗氧化劑NAC則與之相反，此結(jié)果與李興艷[30]研究相一致。

如圖3-c所示，24～120 h，H2O2處理組TVB-N值上升緩慢且與空白組接近；120 h后，3個處理組TVB-N值均明顯上升并顯著高于6～72 h的值(P<0.05)；6～168 h，H2O2處理組和空白組TVB-N值均顯著高于NAC處理組(P<0.05)，由于H2O2為弱酸性，促進了肉中蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的降解以及含氮物質(zhì)的產(chǎn)生，進而提高了TVB-N值；但24 h時H2O2處理組和空白組TVB-N值無顯著差異，并在72～120 h，H2O2處理組TVB-N值顯著低于空白組(P<0.05)。以上結(jié)果說明，H2O2不僅加劇了脂質(zhì)氧化程度還在一定程度上促進蛋白質(zhì)和氨及氨類物質(zhì)的分解，造成肌肉新鮮度的下降。

2.4 H2O2、NAC處理對獺兔肉宰后成熟過程中蛋白氧化程度的影響

由圖4-a可知，H2O2、NAC處理組和空白組MP濁度均呈先上升后緩慢下降變化并分別在24、72、72 h達到最大值，此時肉的pH接近MP的等電點，蛋白質(zhì)容易發(fā)生變性聚集，致使溶液變渾濁，反之遠離等電點的MP濁度變小。成熟過程中(除72 h)，H2O2處理組蛋白質(zhì)濁度整體顯著高于空白組，并顯著高于NAC處理組(P<0.05)。說明ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激促進了蛋白質(zhì)的氧化降解，使其發(fā)生變性聚集，蛋白顆粒增大，溶液變渾濁，而NAC則抑制了蛋白質(zhì)的聚集，減小了蛋白質(zhì)濁度。如圖4-b所示，6～24 h，3個處理組MP溶解度呈顯著下降趨勢(P<0.05)，這與pH變化相似，均在24 h前呈顯著下降變化，原因是此過程中蛋白質(zhì)因缺乏靜電相互作用而聚集和沉淀；成熟后期蛋白質(zhì)溶解度緩慢下降的原因是pH回升導(dǎo)致靜電相互作用增大，產(chǎn)生了親水性和水合作用，蛋白質(zhì)疏水基團發(fā)生聚集，減少了與水的接觸，而使蛋白質(zhì)溶解度變化不明顯[5]。

a-濁度；b-溶解性；c-羰基含量；d-巰基含量；e-表面疏水性；f-二硫鍵含量圖4 H2O2、NAC處理對獺兔肉宰后成熟過程中蛋白氧化程度的影響Fig.4 Effects of H2O2 and NAC treatment on protein oxidation levels of rex rabbit meat

由圖4-c可知，3個處理組MP羰基含量呈顯著上升趨勢(P<0.05)。同時，6～168 h，H2O2處理組的MP羰基含量顯著高于空白組和NAC處理組(P<0.05)，且NAC處理組MP羰基含量顯著低于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理會導(dǎo)致羰基含量的增加；而NAC則通過清除肌肉中的·OH，抑制肌肉蛋白質(zhì)羰基的產(chǎn)生，從而減緩蛋白質(zhì)氧化。此研究結(jié)果與崔文斌[5]研究相一致。如圖4-d所示，3個處理組MP巰基含量顯著下降(P<0.05)，說明隨著成熟進行肌肉內(nèi)部MP發(fā)生降解，蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象發(fā)生改變，活性巰基暴露而被氧化成二硫鍵，從而導(dǎo)致活性巰基數(shù)量減少。6～168 h，H2O2處理組MP巰基含量均顯著低于空白組和NAC處理組(P<0.05)，說明H2O2產(chǎn)生的自由基進攻含硫氨基酸的巰基，使其被氧化形成二硫鍵，導(dǎo)致巰基含量減少，而NAC通過清除一部分自由基，減緩了宰后肌肉中MP巰基的氧化。

由圖4-e可知，3個處理組MP表面疏水性呈先上升后平穩(wěn)變化的趨勢，并分別在24、72、72 h時達到最大值(P<0.05)，原因是當(dāng)肌肉pH值下降接近蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)容易發(fā)生聚集變性，引起疏水基團的暴露；同時因宰后肌肉僵直收縮，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，溶解度下降，蛋白質(zhì)內(nèi)部疏水基團暴露，最終使疏水性增加。6～168 h，H2O2處理組MP疏水性整體顯著高于空白組(P<0.05)，NAC處理組MP疏水性顯著低于空白組(P<0.05)，說明H2O2處理后顯著促進了MP的氧化，NAC則發(fā)揮相反作用。由圖4-f可知，3個處理組MP二硫鍵含量均隨著成熟時間的延長呈上升趨勢(P<0.05)。且在整個成熟過程中，H2O2處理組MP二硫鍵含量顯著高于NAC處理組和空白組(P<0.05)，NAC處理組MP二硫鍵含量最低，說明氧化修飾可顯著提高肌肉MP的氧化程度，并可能對肌肉品質(zhì)造成影響。綜上所述，H2O2處理導(dǎo)致ROS水平增加并進一步介導(dǎo)肌肉發(fā)生氧化應(yīng)激，并對MP氧化起促進作用，并可能進一步影響肌肉品質(zhì)。

3 結(jié)論

H2O2處理顯著提高了肌肉ROS水平并降低SOD活性，從而降低了肌肉的抗氧化能力，并進一步提高了肌肉的氧化應(yīng)激水平；成熟過程中，H2O2處理組pH值迅速下降，并顯著低于空白組和NAC處理組；H2O2處理后導(dǎo)致的氧化應(yīng)激對肌肉色澤、保水性均產(chǎn)生不利影響，但對肌肉嫩化有一定積極作用。同時，H2O2介導(dǎo)的氧化應(yīng)激顯著提高了肌肉的脂質(zhì)過氧化，造成肌肉新鮮度下降，還對MP的氧化起促進作用。

綜上所述，宰后缺血缺氧環(huán)境導(dǎo)致獺兔肉內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，可能通過促進肌肉的脂質(zhì)氧化和蛋白氧化最終導(dǎo)致獺兔肉食用品質(zhì)的下降。