氧化應(yīng)激對宰后初期牛肉嫩度的影響研究：基于蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞凋亡途徑

黃琳琳，張一敏，董鵬程，梁榮蓉，王新怡，齊婷婷，羅欣，張新軍，郝劍剛，毛衍偉*

1(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)2(國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系中衛(wèi)實驗站，寧夏 中衛(wèi)，755000)3(國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系烏拉蓋站，內(nèi)蒙古 烏拉蓋，026321)

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是細(xì)胞中廣泛分布的具有生理活性的代謝產(chǎn)物。正常情況下，動物體內(nèi)的ROS處于動態(tài)平衡狀態(tài)，抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)節(jié)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和代謝[1]。動物屠宰后，由于機(jī)體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)被破壞，ROS不斷積累，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，導(dǎo)致蛋白質(zhì)氧化、細(xì)胞凋亡等一系列反應(yīng)，影響肉的嫩度。有研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激造成的蛋白質(zhì)氧化可以通過增加蛋白質(zhì)分子的交聯(lián)聚合，減弱鈣蛋白酶(calpain)活性等途經(jīng)，影響骨架蛋白的降解，從而降低肉的嫩度[2]。CHEN等[3]發(fā)現(xiàn)高氧氣調(diào)包裝會導(dǎo)致豬背最長肌中發(fā)生氧化應(yīng)激，蛋白質(zhì)氧化程度增加，抑制μ-calpain的活性從而影響肌原纖維蛋白的降解，導(dǎo)致豬肉的嫩度降低。但同時有研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度宰前應(yīng)激導(dǎo)致羅非魚體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激，使魚肉的嫩度提高[4]。李孟孟[5]也發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激處理后的羊肉中細(xì)胞凋亡酶(caspase)活性和肌原纖維小片化指數(shù)顯著增加。CHEN等[6]通過體外實驗證明，氧化應(yīng)激處理后的肌間線蛋白(desmin)的構(gòu)象改變，更易被caspases降解。

目前氧化應(yīng)激對肉嫩度的影響暫不明確，且多從蛋白質(zhì)氧化或細(xì)胞凋亡等途徑單方面進(jìn)行解釋。因此本實驗采用H2O2浸泡處理牛背最長肌，人為創(chuàng)造氧化應(yīng)激條件，探究在牛肉宰后初期氧化應(yīng)激途徑中蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞凋亡的變化，并闡述其調(diào)控牛肉嫩度的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實驗隨機(jī)選取6頭20月齡飼養(yǎng)方式、生長環(huán)境一致的西門塔爾雜交閹割公牛(山東菏澤曹縣商都恒昌清真肉類有限公司，胴體質(zhì)量約為360 kg，pH24為5.4～5.8)作為實驗樣本。

H2O2、三氯乙酸、2,4-二硝基苯肼(dinitrophenylhydrazine，DNPH)，天津凱通化學(xué)試劑有限公司；N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)，上海麥克林生化科技有限公司；生理鹽水，辰欣藥業(yè)股份有限公司；BCA試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；2,7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)、desmin一抗，Sigma-Aldrich；EDTA、SDS、鹽酸胍、溴酚藍(lán)(bromophenol blue，BPB)，北京索萊寶科技有限公司；鈣測試盒(C004-2-1)，南京建成生物工程研究所有限公司；TUNEL檢測試劑盒、蛋白免疫印跡二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司。

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro System公司；JXFSTPRP-Ⅱ型冷凍研磨儀，中國凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；SpectraMax M5型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

肉牛經(jīng)商業(yè)流程屠宰后，在放血30 min內(nèi)取左半胴體背最長肌，立即使用液氮冷凍約30 g肉樣作為0 h樣本，并將剩余肉樣迅速切分為2.5 cm厚的牛排(用于剪切力的測定)和1 cm×1 cm×0.5 cm大小均勻的肉塊，隨機(jī)分為3組。按照肉液比1∶1(g∶mL)，將肉樣分別浸泡在20 mmol/L H2O2(氧化應(yīng)激組)、20 mmol/L NAC(ROS清除劑，抑制應(yīng)激組)和0.9%的生理鹽水(對照組)中，在16 ℃下孵育至6 h后(避免冷收縮)，繼續(xù)在4 ℃下孵育至12、24、72和168 h。在相應(yīng)時間點(diǎn)測定剪切力，將部分肉樣在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定，用于末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL)的測定，并留取約30 g肉樣在液氮冷凍后于-80 ℃保存，用于后續(xù)肌原纖維蛋白降解、蛋白質(zhì)氧化等指標(biāo)的測定。

1.2.2 ROS相對含量的測定

參考張玉林[7]的方法并稍作修改。將0.5 g肉樣加入5 mL Tris-HCl緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.008 g/mL NaCl，10 mmol/L 蔗糖，pH 7.4)中，使用冷凍研磨儀研磨3次(4 ℃，45 Hz，每次45 s)，于4 ℃下4 000×g離心15 min收集上清液，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。將100 μL上清液與100 μL反應(yīng)緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，0.008 g/mL NaCl，10 mmol/L 蔗糖，15 μmol/L DCFH-DA，pH 7.4)混合，迅速用酶標(biāo)儀測定0 min的熒光值。在37 ℃下孵育30 min后再次測定熒光值。ROS的相對含量按照公式(1)計算：

ROS相對含量/[熒光強(qiáng)度·(mg protein)-1]=

(1)

1.2.3 剪切力的測定

參考HOU等[8]的方法，將宰后0、1、3、7 d的牛排置于真空包裝袋中，牛排的中心部位插入溫度計，于80 ℃水浴加熱至中心溫度70 ℃，牛排在室溫下冷卻后放置于4 ℃過夜。用直徑為1.27 cm的空心取樣器沿著肌纖維方向取出肉柱(避開脂肪和筋腱)，使用質(zhì)構(gòu)儀測定肉柱的剪切力(測前速度2.0 mm/s；測中速度1.0 mm/s；測后速度5.0 mm/s；觸發(fā)力0.098 N；下壓距離23.0 mm；探頭類型：HDP/BSW)，牛排的剪切力值(N)為該牛排各個肉柱測定結(jié)果的平均值。

1.2.4 全蛋白質(zhì)的提取

將0.5 g肉樣加入5 mL 10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含2% SDS，pH 7.0)中，使用冷凍研磨儀研磨3次(4 ℃，45 Hz，每次45 s)，于4 ℃下12 000×g離心20 min，上清液即為全蛋白提取物。用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，用上述磷酸鹽緩沖液調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至10 mg/mL。將蛋白質(zhì)溶液與等體積的上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-base，4% SDS，20% 甘油，5 mmol/L EDTA，體積分?jǐn)?shù)0.8% β-巰基乙醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.005% BPB，pH 7.0)充分混合，95 ℃金屬浴5 min，室溫冷卻后分裝樣品，-80 ℃儲存用于蛋白質(zhì)免疫印跡的測定。

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

采用5%的濃縮膠和10%的分離膠進(jìn)行電泳。濃縮膠恒壓90 V電泳30 min，分離膠恒壓120 V電泳至BPB跑至分離膠底部。凝膠在恒壓90 V冰浴轉(zhuǎn)印90 min，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(poly vinylidene fluoride，PVDF)膜上。轉(zhuǎn)印后將PVDF膜在含有5%脫脂奶粉的洗膜緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)(20 mmol/L Tris-base，137 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和0.1% 吐溫-20)中室溫封閉1.5 h。desmin一抗按體積比1∶500用TBST稀釋，將封閉后的膜置于一抗溶液中，在搖床上4 ℃孵育過夜。孵育結(jié)束后用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。之后將膜放入用TBST稀釋的二抗溶液(1∶5 000)中室溫孵育1.5 h，再用TBST溶液洗膜3次，每次10 min。將ECL顯影液避光與膜反應(yīng)2 min，用凝膠成像儀拍照觀察。

1.2.6 蛋白質(zhì)羰基含量及表面疏水性的測定

將0.5 g肉樣加入5 mL試劑Ⅰ(100 mmol/L Tris-base，10 mmol/L EDTA，pH 8.3)中，使用冷凍研磨儀研磨3次(4 ℃，45 Hz，每次45 s)，于4 ℃下13 000×g離心40 min后倒掉上清液。向沉淀中加入5 mL試劑Ⅱ(20 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，0.6 mol/L NaCl，pH 6.5)，研磨2次(4 ℃，35 Hz，每次30 s)，于4 000×g下離心10 min，上清液即為肌原纖維蛋白提取物，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度。

蛋白質(zhì)羰基含量的測定參考SOYER等[9]的方法并稍作修改。取3份肌原纖維蛋白各30 μL，2份作為實驗組各加入1 mL 10 mmol/L DNPH溶液(2 mol/L HCl溶液溶解)，1份作為對照組加入1 mL 2 mol/L的HCl溶液?；靹蚝笾糜?7 ℃避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)期間每隔20 min取出樣品振蕩混勻。反應(yīng)結(jié)束后，實驗組和對照組各加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的三氯乙酸溶液，混勻后于4 ℃下10 000×g離心15 min。沉淀用1 mL無水乙醇和乙酸乙酯的混合液(1∶1，mL∶mL)于4 ℃下12 000×g離心洗滌10 min，重復(fù)洗滌步驟3次并吹干。將洗滌后的沉淀溶解在1.5 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液(試劑Ⅱ溶解)中，于370 nm處測定吸光度。蛋白質(zhì)羰基含量(nmol/mg protein)使用摩爾吸光系數(shù)22 000 M-1cm-1計算。

蛋白質(zhì)表面疏水性的測定參考CHELH等[10]的方法并稍作修改。用試劑Ⅱ調(diào)整肌原纖維蛋白的濃度至3 mg/mL，取2份1 mL肌原纖維蛋白溶液作為實驗組，并以試劑Ⅱ作為對照組，各加入200 μL 1 mg/mL的BPB溶液，混勻后室溫反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后，于4 ℃下5 000×g離心15 min。用試劑Ⅱ?qū)⑸锨逡合♂?0倍后于595 nm處測定吸光值，以結(jié)合態(tài)BPB作為蛋白質(zhì)表面疏水性指數(shù)，結(jié)合態(tài)BPB按照公式(2)計算：

(2)

1.2.7 肌漿內(nèi)Ca2+濃度的測定

參考POMPONIO等[11]的方法并稍作修改。稱取2 g肉樣，切碎后在冰上孵育20 min，于4 ℃下13 000×g離心30 min收集肌漿上清液，并用雙縮脲法測定蛋白濃度。用鈣測試盒(C004-2-1)檢測肌漿內(nèi)Ca2+濃度。取10 μL肌漿上清液與250 μL檢測工作液混勻，靜置5 min后立即在610 nm處測定吸光值，同時以1 mmol/L的鈣標(biāo)準(zhǔn)液作為標(biāo)準(zhǔn)(C標(biāo)準(zhǔn))，以去離子水作為空白。肌漿內(nèi)Ca2+濃度按照公式(3)計算：

肌漿內(nèi)Ca2+濃度/(mmol·g-1)=

(3)

1.2.8 細(xì)胞凋亡率的測定

根據(jù)TUNEL檢測試劑盒方法進(jìn)行測定。對4%多聚甲醛溶液中固定的肉樣進(jìn)行石蠟包埋、切片、脫蠟處理。將切片浸于1×PBS緩沖液(pH 7.4)中漂洗3次，每次5 min。向切片上滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37 ℃反應(yīng)20 min；使用1×PBS浸洗。向每個切片上滴加破膜液(0.1% triton)覆蓋組織，常溫下孵育20 min；使用1×PBS浸洗。切片稍甩干后滴加緩沖液覆蓋組織，常溫下孵育10 min。根據(jù)組織切片大小滴加適量反應(yīng)液至覆蓋組織，切片于濕盒內(nèi)37 ℃孵育2 h；孵育結(jié)束后再次浸洗。切片稍甩干后滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液，避光室溫孵育10 min；再次浸洗。用抗熒光淬滅封片劑封片，切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Quantity One 4.6.2軟件對蛋白質(zhì)免疫印跡條帶進(jìn)行分析，使用Image-Pro Plus 6.0軟件對TUNEL結(jié)果中的熒光細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，使用SAS 9.0軟件中的混合模型對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，使用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。試驗結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期ROS相對含量的影響

ROS作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號因子，廣泛參與細(xì)胞凋亡信號傳遞等生理生化過程。動物屠宰后，機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的能力逐漸降低，機(jī)體不能及時清除ROS而造成其不斷積累，導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平增加。

如圖1所示，在整個實驗過程中，與對照組相比，氧化應(yīng)激組的ROS相對含量顯著升高(P<0.05)，抑制應(yīng)激組的ROS相對含量顯著降低(P<0.05)，說明H2O2處理顯著提高了宰后牛肉細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，而ROS清除劑NAC處理顯著抑制了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。氧化應(yīng)激組的ROS相對含量隨著宰后時間的延長而不斷增加，在宰后6～24 h增長趨勢較為平緩；抑制應(yīng)激組的ROS相對含量在宰后6 h顯著下降(P<0.05)，在宰后12～24 h內(nèi)變化不顯著(P>0.05)；同樣，對照組的ROS相對含量在宰后6～24 h內(nèi)變化不顯著(P>0.05)。與本研究結(jié)果相似，張玉林[7]也發(fā)現(xiàn)在鵝肉早期成熟過程中ROS相對含量變化不顯著，NAC處理導(dǎo)致鵝肉早期成熟過程中ROS相對含量顯著下降。這可能是由于宰后早期，肌肉細(xì)胞中的抗氧化物質(zhì)仍在發(fā)揮作用，清除了部分ROS，在一定程度上減緩了氧化應(yīng)激的進(jìn)程，而隨著宰后成熟時間的延長，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)被耗盡，氧化應(yīng)激程度顯著增加。

圖1 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期ROS相對含量的影響Fig.1 Effect of oxidative stress on ROS relative content of beef in early postmortem注：a～e表示同一處理方式不同貯藏時間差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；x～z表示同一貯藏時間不同處理方式差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)

2.2 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期剪切力的影響

由表1可以看出，貯藏時間與處理方式對剪切力無交互作用(P>0.05)，但處理方式與貯藏時間的主效應(yīng)分別影響顯著(P<0.05)。牛肉剪切力值呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在宰后1 d達(dá)到最大值(107.31 N)。氧化應(yīng)激組的剪切力值顯著低于抑制應(yīng)激組(P<0.05)，在宰后成熟第3天和第7天，氧化應(yīng)激組的剪切力值分別是抑制應(yīng)激組的83.32%和87.97%，說明H2O2處理引起的氧化應(yīng)激顯著加快了牛肉宰后成熟過程中的嫩化速度。與本研究結(jié)果相似，WANG等[12]也發(fā)現(xiàn)H2O2處理后的牦牛肉剪切力值顯著降低，并證明氧化應(yīng)激可以通過激活細(xì)胞線粒體凋亡通路，增強(qiáng)caspase的活性，進(jìn)而提高嫩度。

表1 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期剪切力的影響Table 1 Effect of oxidative stress on Warner-Bratzler shear force of beef in early postmortem

2.3 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期desmin降解程度的影響

Desmin作為重要的肌原纖維蛋白，是嫩度的標(biāo)志蛋白之一，其降解是肉宰后成熟過程中嫩化的必要條件[13]。SMUDER等[14]研究發(fā)現(xiàn)，肌原纖維蛋白暴露在不同程度的H2O2氧化條件下，都不會自發(fā)的降解，表明肌原纖維蛋白的降解程度并不依賴于H2O2處理的直接作用。從圖2和表2中可以看出，desmin在宰后前6 h的降解程度變化不顯著(P>0.05)，而后降解程度隨著成熟時間的延長而不斷增加。

圖2 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期desmin降解程度的影響Fig.2 Effect of oxidative stress on the degradation of desmin of beef in early postmortem注：H2O2表示氧化應(yīng)激組，NAC表示抑制應(yīng)激組，Control表示對照組(下同)

表2 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期desmin降解程度的影響Table 2 Effect of oxidative stress on the degradation of desmin of beef in early postmortem

與抑制應(yīng)激組相比，氧化應(yīng)激組desmin的降解程度顯著增加(P<0.05)，表明氧化應(yīng)激處理導(dǎo)致肌原纖維蛋白降解程度增加，從而加速了牛肉的嫩化進(jìn)程。與剪切力值結(jié)果相一致，這也表明氧化應(yīng)激處理加速肌原纖維降解是牛肉嫩化加速的主要原因。

2.4 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期蛋白質(zhì)羰基含量及表面疏水性的影響

羰基含量的增加是蛋白質(zhì)氧化最顯著的變化之一，是檢測蛋白質(zhì)氧化最常用的指標(biāo)。蛋白質(zhì)表面疏水性在維持蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)方面起著重要作用，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被氧化時，其構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白質(zhì)分子內(nèi)被包埋的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致表面疏水性增加[15]。

如表3所示，3個處理組的蛋白質(zhì)羰基含量和表面疏水性均隨著成熟時間的延長而不斷增加，但在宰后6～12 h變化不顯著(P>0.05)，與ROS相對含量相對應(yīng)。氧化應(yīng)激組與其他2組相比，蛋白質(zhì)羰基含量和表面疏水性顯著升高(P<0.05)，表明氧化應(yīng)激處理顯著提高了牛肉宰后成熟過程中蛋白質(zhì)氧化水平，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變。與本研究結(jié)果相似，崔文斌等[16]發(fā)現(xiàn)隨著H2O2處理濃度的增加，牦牛肉肌原纖維蛋白氧化應(yīng)激水平增加，蛋白質(zhì)羰基含量也隨之增加。張玉林等[17]研究發(fā)現(xiàn)色氨酸殘基具有很強(qiáng)的疏水性，H2O2處理會促使色氨酸殘基從被包埋狀態(tài)中暴露出來，從而增加蛋白質(zhì)的表面疏水性。

表3 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期蛋白質(zhì)羰基含量及表面疏水性的影響Table 3 Effect of oxidative stress on protein carbonyl content and surface hydrophobicity of beef in early postmortem

MALHEIROS等[18]研究發(fā)現(xiàn)安格斯雜交牛的嫩度與氧化應(yīng)激造成的蛋白質(zhì)氧化程度呈正相關(guān)關(guān)系，推測ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激會在細(xì)胞凋亡過程中誘導(dǎo)產(chǎn)生caspase，caspase與calpain協(xié)同降解肌原纖維蛋白，且蛋白質(zhì)氧化修飾會使肌原纖維蛋白更易被蛋白酶識別降解。FU等[19]也研究發(fā)現(xiàn)，體外氧化后的肌球蛋白氧化位點(diǎn)暴露，更容易被μ-calpain和caspase-3降解。因此，氧化應(yīng)激引起的氧化修飾，以及構(gòu)象改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子部分展開、酶解位點(diǎn)暴露，可能會使肌原纖維蛋白的酶水解敏感性更高，從而加速嫩化過程。

2.5 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期肌漿內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡率的影響

Ca2+是細(xì)胞凋亡的始動信號分子，其濃度的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。ROS造成的氧化應(yīng)激能夠破壞細(xì)胞膜、線粒體膜以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，使細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流，肌漿內(nèi)Ca2+濃度增加，導(dǎo)致線粒體鈣超載，線粒體膜通透性增加，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素c和凋亡因子，誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[20]。

圖3中，藍(lán)色熒光和綠色熒光總數(shù)為總細(xì)胞數(shù)，綠色熒光為凋亡細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率即為凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。如表4所示，隨著成熟時間的延長，肌漿內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，在宰后168 h，細(xì)胞凋亡率達(dá)到44.02%。與對照組相比，氧化應(yīng)激組的肌漿內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，而抑制應(yīng)激組的肌漿內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。在宰后成熟過程中，氧化應(yīng)激組的細(xì)胞凋亡率相比于抑制應(yīng)激組增加了29.10%，相比于對照組增加了15.62%，表明氧化應(yīng)激處理顯著提高了牛肉宰后成熟過程中細(xì)胞凋亡程度。與本研究結(jié)果相似，趙培等[21]研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理會使小鼠胚胎細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著增加，H2O2可通過Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表4 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期肌漿內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡率的影響Table 4 Effect of oxidative stress on Ca2+ concentration in sarcoplasm and apoptosis rate of beef in early postmortem

圖3 氧化應(yīng)激處理對牛肉宰后初期細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of oxidative stress on cell apoptosis rate of beef in early postmortem

通常認(rèn)為，細(xì)胞凋亡可從Ca2+信號傳導(dǎo)、caspase激活等方面高度參與宰后初期肌肉的嫩化過程[22]。研究發(fā)現(xiàn)，牦牛的3個部位肉在宰后成熟過程中剪切力值與細(xì)胞凋亡率均呈極顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.001)，隨著細(xì)胞凋亡率的增加，剪切力值不斷下降，牦牛肉的嫩度提高[23]。DANG等[24]抑制僵直前牛背最長肌中線粒體對鈣的攝取，導(dǎo)致肌漿內(nèi)Ca2+濃度升高，細(xì)胞凋亡增加，牛肉嫩度提高。周昌瑜等[25]向宰后鵝胸肉中注射CaCl2，發(fā)現(xiàn)處理組中的caspase-3以及calpain活性顯著升高，同時肌原纖維蛋白降解程度顯著增加，剪切力值顯著降低，推測CaCl2注射增加了肌漿內(nèi)Ca2+濃度，激活了內(nèi)源酶活性，促進(jìn)肌原纖維蛋白的降解，進(jìn)而提高了嫩度。

3 結(jié)論

蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞凋亡是牛肉宰后氧化應(yīng)激過程中不可避免的變化，且都與嫩度相關(guān)。本研究結(jié)果表明，在宰后早期階段，牛肉細(xì)胞內(nèi)留存的抗氧化物質(zhì)仍會發(fā)揮一定作用，清除了部分ROS，進(jìn)而延緩了蛋白質(zhì)羰基含量、表面疏水性和肌漿內(nèi)Ca2+濃度的升高。與對照組和抑制氧化應(yīng)激處理組相比，氧化應(yīng)激處理使蛋白質(zhì)羰基含量與表面疏水性顯著增加，表明蛋白質(zhì)氧化程度增加；肌漿內(nèi)Ca2+濃度顯著上升，造成鈣穩(wěn)態(tài)失衡，細(xì)胞凋亡率顯著升高，表明細(xì)胞凋亡程度增加；同時desmin降解程度增大，剪切力值降低，牛肉的嫩度增加。因此，相比于蛋白質(zhì)氧化對嫩度造成的不利影響，氧化應(yīng)激對肌原纖維蛋白的氧化修飾和對蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變可能會暴露更多的酶切位點(diǎn)，而氧化應(yīng)激造成Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，可能會誘導(dǎo)caspase級聯(lián)反應(yīng)并通過與calpain協(xié)同作用等途徑，促使肌原纖維蛋白降解，進(jìn)而加速了牛肉宰后成熟過程中嫩化的進(jìn)程。然而蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞凋亡通路錯綜復(fù)雜，蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞凋亡共同影響嫩度的具體通路還需要進(jìn)一步研究。