耐鹽植物乳桿菌的選育及其對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油品質(zhì)的影響

張偉，楊俊文，余冰艷，林琛，謝夢(mèng)雪，羅曉明，周尚庭，蔣雪薇,3*

1(長(zhǎng)沙理工大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410114)2(長(zhǎng)沙理工大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙，410114)3(湖南省調(diào)味品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙，410600)4(加加食品集團(tuán)股份有限公司，湖南 長(zhǎng)沙，410600)

醬油釀造是以微生物生命活動(dòng)為基礎(chǔ)的復(fù)雜生物化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，有益微生物的相互協(xié)同作用是決定醬油風(fēng)味與品質(zhì)的重要因素[1-2]。目前，我國(guó)規(guī)模化的醬油釀造多采用現(xiàn)代高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝，其主要特征是發(fā)酵醬醪鹽分含量高，通常能達(dá)到16%左右，水分含量高，溫度較低，發(fā)酵周期長(zhǎng)至6個(gè)月及以上；設(shè)備上則采用圓盤制曲機(jī)、發(fā)酵罐等封閉式設(shè)備替代了開(kāi)放式制曲箱及發(fā)酵池?，F(xiàn)代高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝使醬油釀造由間歇開(kāi)放式工藝升級(jí)為連續(xù)封閉式工藝，該工藝較好地防控了開(kāi)放式工藝帶來(lái)的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)[3]，但自然接種的風(fēng)味菌也隨之減少，致使醬香形成緩慢，醬油釀造周期延長(zhǎng)[4-5]。因此，要想在封閉的發(fā)酵系統(tǒng)及高鹽濃度的發(fā)酵條件下獲得品質(zhì)上乘的醬油，加快選育耐高鹽的風(fēng)味菌是最主要的解決途徑。醬油釀造過(guò)程中的常見(jiàn)風(fēng)味菌主要有酵母和乳酸菌，由于對(duì)醬油釀造酵母的研究及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)展得較早，目前已有商業(yè)化的醬油釀造酵母[6]，而對(duì)乳酸菌等風(fēng)味細(xì)菌的研究起步較晚，導(dǎo)致其在醬油中的商業(yè)化應(yīng)用一直滯后于釀造酵母。

植物乳桿菌是發(fā)酵食品中常見(jiàn)的乳酸菌[7]，常應(yīng)用于發(fā)酵泡菜中，是異型乳酸發(fā)酵菌株，除代謝生成乳酸外，還能生成乙醇、乙酸，可以賦予發(fā)酵食品愉悅的風(fēng)味[8-9]。植物乳桿菌代謝的乳酸、乙酸等有機(jī)酸能與乙醇等醇類物質(zhì)酯化生成乳酸乙酯、乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)，豐富發(fā)酵食品的香氣[10-11]；還能提高發(fā)酵體系的總酸，抑制雜菌的污染。醬油發(fā)酵中的食鹽質(zhì)量濃度可以從低鹽的100 g/L達(dá)到高鹽的160 g/L及以上，泡菜發(fā)酵用的植物乳桿菌需要耐鹽馴化才能應(yīng)用于醬油發(fā)酵，這使得在高鹽的醬油發(fā)酵中植物乳桿菌的發(fā)酵性能受到制約。為了促進(jìn)植物乳桿菌在醬油發(fā)酵中的應(yīng)用，本文以發(fā)酵泡菜中篩選得到的耐鹽植物乳桿菌L04(可耐受160 g/L NaCl)為出發(fā)菌株，利用紫外誘變選育耐鹽穩(wěn)定、產(chǎn)酸性能良好的突變株，并在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，分析發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量、理化指標(biāo)與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化，結(jié)合感官評(píng)分，以期獲得能應(yīng)用于高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中的優(yōu)良菌株，提升釀造醬油的風(fēng)味。

1 材料與方法

1.1 菌種與主要材料

菌種：植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)L04，長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院調(diào)味品發(fā)酵研究室篩選并保藏，可耐受160 g/L NaCl。

主要材料：成品曲，湖南某醬油廠。

1.2 培養(yǎng)基

MRS(de Man,Rogosa Sharpe)培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10，蛋白胨10，酵母膏3，檸檬酸氫二銨2，葡萄糖40，乙酸鈉5，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，吐溫-80 1 mL，瓊脂粉20，121 ℃滅菌20 min。不添加瓊脂粉為MRS液體培養(yǎng)基。

高錳酸鉀-溴化鉀-MRS培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基，2.0 g/L K2MnO4，2.5 g/L KBr，115 ℃滅菌30 min。

1.3 儀器與設(shè)備

ARZ-200游標(biāo)卡尺，青島美吉特精密儀器工具有限公司；722S可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；ZWY-2102C恒溫振蕩培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；436 GC/EVOQ TQ/PAL氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)布魯克科技有限公司；DB-5 MS氣相色譜柱、ZORBAX Eclipse XDB-C18液相色譜柱，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；65 μm PDMS/DVB固相微萃取針，美國(guó)色譜科公司；Waters 2695型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 紫外誘變致死率曲線的測(cè)定

將菌種接種至NaCl質(zhì)量濃度為100 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、150 r/min培養(yǎng)48 h，取菌體離心洗滌3次后制成108CFU/mL的菌懸液備用；吸取10 mL菌懸液于15 W的紫外燈下距離45 cm照射0、15、30、45、60、90、120 s后分別取樣稀釋涂平板，37 ℃避光培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)，繪制致死率曲線。致死率按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：A，對(duì)照菌落數(shù)；B，紫外照射后的菌落數(shù)。

1.4.2 突變株篩選

誘變后的菌懸液涂布于高錳酸鉀-溴化鉀-MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d后觀察產(chǎn)生的透明圈，游標(biāo)卡尺精準(zhǔn)測(cè)量透明圈直徑(D)及菌落直徑(d)，挑選D/d>2.0的菌株，耐鹽馴化后接入含有160 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)60 h后測(cè)定發(fā)酵液中乳酸的含量，篩選乳酸含量最高的2株出發(fā)菌株的突變株進(jìn)入后續(xù)試驗(yàn)。

1.4.3 突變株的耐鹽穩(wěn)定性

將篩選得到的突變株接續(xù)接種5代至160 g/L的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min培養(yǎng)60 h，測(cè)定每代菌株發(fā)酵液的凈增OD600值，并以出發(fā)菌株為對(duì)照，確定突變株的耐鹽穩(wěn)定性。

1.4.4 高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵工藝

將成品曲與230 g/L的鹽水按1∶2(質(zhì)量比)混合制成高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪，28 ℃發(fā)酵120 d。將篩選得到的突變株和出發(fā)菌株制成107CFU/mL的菌懸液，于發(fā)酵第45天分別添加至高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中[12]，添加量為5%[13]，以不添菌的醬醪為對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)束后，利用300目濾布?jí)赫メu醪獲得醬油。

1.4.5 乳酸菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)測(cè)定

醬醪中細(xì)菌總數(shù)測(cè)定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》；醬醪中乳酸菌總數(shù)參考MRS平板計(jì)數(shù)法[14]測(cè)定。

1.4.6 醬油感官評(píng)分

由10名經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的人員(5名男性和5名女性，年齡25～45歲)組成感官評(píng)分小組，小組每位成員均至少有150 h以上的感官評(píng)分經(jīng)驗(yàn)。對(duì)醬油色澤、香氣、滋味、體態(tài)4個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)分，滿分為100分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考GB/T 18186—2000《釀造醬油》中感官特性進(jìn)行擬定，見(jiàn)表1。

表1 醬油的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of soy sauce

1.4.7 分析方法

1.4.7.1 乳酸含量的測(cè)定

取2 mL發(fā)酵液或醬油，5 mL 30 g/L ZnSO4溶液，5 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀混合定容至100 mL，靜置30 min后離心取上清液，0.22 μm水系膜過(guò)濾后，液相色譜進(jìn)樣分析；液相色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為0.1%磷酸-甲醇(95∶5,V∶V)，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30 ℃。

1.4.7.2 理化指標(biāo)的測(cè)定

還原糖含量測(cè)定參照GB 5009.7—2016《食品中的還原糖測(cè)定》；總酸含量測(cè)定參照GB 12456—2021《食品中總酸的測(cè)定》；氨態(tài)氮含量測(cè)定參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》。

1.4.7.3 SPME-GC-MS分析

樣品準(zhǔn)備：取5 mL醬油和5 μL 2-甲基-3-庚酮甲醇溶液(0.816 μg/μL，內(nèi)標(biāo)物)于20 mL的頂空進(jìn)樣瓶中，在振蕩器中50 ℃加熱振蕩25 min后，利用固相微萃取針吸附20 min后進(jìn)樣；GC條件：進(jìn)樣口溫度250 ℃，解析時(shí)間為5 min；程序升溫為40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min，載氣為高純氦氣，載氣流速為1.0 mL/min，不分流。MS條件：EI離子源電子能量為70 eV，發(fā)射電流200 μA，離子源和傳輸線溫度為250 ℃，掃描模式為全掃描，掃描時(shí)間為1～45 min，m/z掃描范圍30～500。揮發(fā)性化合物定性分析：采用NIST 14譜庫(kù)檢索比對(duì)，再根據(jù)保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜比對(duì)來(lái)確定物質(zhì)結(jié)構(gòu)。

揮發(fā)性物質(zhì)含量計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：ρ1,揮發(fā)性物質(zhì)質(zhì)量濃度，μg/L；ρ0，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，0.816 μg/μL；A1，揮發(fā)性物質(zhì)峰面積；A0，內(nèi)標(biāo)物峰面積；V1，醬油的體積，mL；V0，添加內(nèi)標(biāo)物的體積，μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22及SIMCA 14軟件進(jìn)行相關(guān)性分析及多元統(tǒng)計(jì)分析；利用Excel 2019及Origin 2021 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌耐鹽產(chǎn)乳酸突變株的選育

植物乳桿菌L04是從發(fā)酵泡菜中篩選并鑒定的1株能產(chǎn)乳酸的細(xì)菌，經(jīng)過(guò)耐鹽馴化后，在含160 g/L NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中可以較好地生長(zhǎng)和產(chǎn)乳酸，其發(fā)酵60 h后乳酸的積累量為3.18 g/L，有較好的耐鹽產(chǎn)乳酸能力，適合作為選育醬醪發(fā)酵耐鹽乳酸菌的出發(fā)菌株。

采用不同的照射時(shí)間處理L04菌懸液，繪制致死率曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1-a。

a-紫外誘變致死率曲線；b-高錳酸鉀-溴化鉀-MRS平板篩選；c-耐鹽產(chǎn)乳酸能力篩選；d-菌株耐鹽穩(wěn)定性測(cè)試圖1 耐鹽產(chǎn)乳酸突變株的篩選Fig.1 Screening of salt-tolerant lactic acid-producing mutants

研究發(fā)現(xiàn)紫外誘變致死率為70%～80%能獲得較高的正突變率[15]，故選擇誘變時(shí)間為40 s處理菌株L04。誘變后的菌株涂布于高錳酸鉀-溴化鉀-MRS培養(yǎng)基，乳酸可以使高錳酸鉀-溴化鉀-MRS平板褪色形成透明圈[16]，以透明圈與菌落直徑比值(D/d值)為指標(biāo)進(jìn)行初篩，獲得20株D/d值大于L04的菌株，將其編號(hào)為L(zhǎng)04-1～L04-20(圖1-b)，將初篩得到的20株菌經(jīng)耐鹽馴化后接種至160 g/L NaCl的MRS液體培養(yǎng)基靜置發(fā)酵60 h，測(cè)定發(fā)酵液中積累的乳酸含量，其中乳酸積累量最高的兩株菌為L(zhǎng)04-1和L04-2(圖1-c)，其發(fā)酵液中乳酸含量分別為3.69和3.49 g/L，相比L04提升了16.03%和9.75%；L04-1和L04-2經(jīng)5次傳代及保藏，其在160 g/L NaCl下均有穩(wěn)定的耐鹽生長(zhǎng)能力(圖1-d)，故選擇這2株菌進(jìn)入后續(xù)研究。

2.2 耐鹽植物乳桿菌突變株對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油的影響

2.2.1 醬油釀造過(guò)程中乳酸菌總數(shù)及細(xì)菌總數(shù)的變化

如圖2所示，發(fā)酵0～45 d，4組醬醪中乳酸菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)由于還未添加乳酸菌而無(wú)明顯差異，但在未添菌醬醪中也檢測(cè)到了乳酸菌，這是由于成品曲中帶入了乳酸菌。

a-乳酸菌總數(shù)的變化；b-細(xì)菌總數(shù)的變化圖2 醬油發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)的變化Fig.2 Changes in total number of lactic acid bacteria and total bacteria during soy sauce fermentation

發(fā)酵45～75 d，添加L04、L04-1、L04-2的醬醪中乳酸菌的總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)明顯高于對(duì)照組，且均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在發(fā)酵第75天達(dá)到最大值，其乳酸總數(shù)分別為3.31×106、2.75×106、2.04×106CFU/g，分別比發(fā)酵45 d的醬醪增加了2.80×106、2.24×106、1.65×106CFU/g，其中由于出發(fā)菌株的耐鹽生長(zhǎng)能力比突變株好，使得醬醪中乳酸菌總數(shù)稍高于添加突變株的醬醪；細(xì)菌總數(shù)分別為9.77×106、1.32×107、8.71×106CFU/g，分別比發(fā)酵45 d的醬醪增加了2.37×106、2.06×106、1.47×106CFU/g，可見(jiàn)細(xì)菌總數(shù)的增加量小于乳酸菌的增加量，說(shuō)明耐鹽植物乳桿菌的加入抑制了醬醪中其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。發(fā)酵75～120 d，由于發(fā)酵體系的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)大量被利用，生長(zhǎng)條件受限，使得添加3株耐鹽植物乳桿菌的醬醪中乳酸菌總數(shù)和細(xì)菌總數(shù)均呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

2.2.2 耐鹽植物乳桿菌突變株對(duì)高鹽稀態(tài)醬油理化指標(biāo)的影響

醬油發(fā)酵過(guò)程中與醬油品質(zhì)相關(guān)的重要理化指標(biāo)有氨態(tài)氮、還原糖、總酸和乳酸[17]。為了考察添加突變株L04-1、L04-2及出發(fā)菌株L04發(fā)酵對(duì)醬油品質(zhì)的影響，對(duì)比分析添加耐鹽植物乳桿菌發(fā)酵的醬油與未添菌發(fā)酵的醬油在理化指標(biāo)方面的差異，結(jié)果見(jiàn)圖3。

a-氨態(tài)氮含量變化；b-還原糖含量變化；c-總酸含量變化；d-乳酸含量變化圖3 醬油發(fā)酵過(guò)程中的理化指標(biāo)變化Fig.3 Changes in physicochemical indicators during soy sauce fermentation

0～45 d，此發(fā)酵階段未添加耐鹽植物乳桿菌，各樣品均為同樣條件下釀造，4組醬油中氨態(tài)氮、還原糖和總酸含量無(wú)明顯差異。發(fā)酵45 d后，添加3株菌發(fā)酵的醬油中氨態(tài)氮的積累速率、還原糖的消耗速率以及總酸的積累速率均高于對(duì)照組，其中添加突變株L04-1和L04-2發(fā)酵的醬油中還原糖消耗速率和總酸的積累速率比L04更快，但其對(duì)應(yīng)的醬醪中乳酸菌總數(shù)相差不大，說(shuō)明選育得到的突變株在發(fā)酵產(chǎn)酸上性能更好。耐鹽植物乳桿菌在此階段內(nèi)產(chǎn)生有機(jī)酸可降低發(fā)酵體系的pH，有助于醬醪中酸性蛋白酶發(fā)揮作用，能促進(jìn)蛋白質(zhì)原料的水解，從而使得醬油中氨態(tài)氮的含量高于對(duì)照組。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，添加L04-1和L04-2發(fā)酵醬油的氨態(tài)氮和總酸含量均高于L04及對(duì)照組，其氨態(tài)氮含量分別為12.64、12.61 g/L，比L04高3.61%、2.53%；總酸含量分別為22.70和22.50 g/L，比L04高2.53%、1.63%，可見(jiàn)2株耐鹽植物乳桿菌突變株在促進(jìn)醬油總酸及氨態(tài)氮的積累上均優(yōu)于出發(fā)菌株，其中突變株L04-1性能更好。

發(fā)酵第45天添加L04-1、L04-2后，所發(fā)酵醬油的乳酸積累速率明顯高于L04及對(duì)照組，但添加耐鹽植物乳桿菌發(fā)酵的醬醪中乳酸菌總數(shù)相差不大，說(shuō)明選育得到的突變株在醬醪發(fā)酵中有更好的乳酸積累能力；發(fā)酵90 d時(shí)，乳酸含量達(dá)到最高值，分別為4.65和4.25 g/L；發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乳酸含量分別降低至4.31和4.12 g/L，比L04高13.12%和8.14%，較對(duì)照組提升了57.88%及50.92%，發(fā)酵后期乳酸含量的減少可能是與醇類物質(zhì)酯化形成了乳酸酯類物質(zhì)。乳酸是醬油中重要的有機(jī)酸，具有柔和適口的酸感，是醬油酸味的重要來(lái)源，同時(shí)還是乳酸酯類物質(zhì)的前體物，能促進(jìn)醬油香氣的形成，添加突變株和出發(fā)菌株均能促進(jìn)乳酸積累，其中添加突變株L04-1和L04-2發(fā)酵的醬油中乳酸含量提升更為明顯。

2.2.3 耐鹽植物乳桿菌突變株對(duì)高鹽稀態(tài)醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

為進(jìn)一步探明選育的耐鹽植物乳桿菌在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵中對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)形成的影響，利用固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析發(fā)酵120 d的3組添菌發(fā)酵醬油及未添菌的對(duì)照組醬油中揮發(fā)性物質(zhì)的種類及含量，其結(jié)果見(jiàn)表2及圖4。4組醬油中共檢測(cè)出65種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中添加突變株L04-1及L04-2發(fā)酵的醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類分別為48及43種，相比出發(fā)菌株無(wú)太大差異，但相比對(duì)照組分別增加了11種及6種；添加L04-1和L04-2發(fā)酵醬油的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量分別為7 104.04和6 073.53 μg/L，比出發(fā)菌株高31.33%和12.28%，較對(duì)照組分別提高了58.15%及35.21%。突變株L04-1添加發(fā)酵對(duì)醬油在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及含量的提升最明顯，主要對(duì)酯類和醇類物質(zhì)的貢獻(xiàn)較大。

表2 醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析結(jié)果Table 2 The results of various volatile flavor compounds in soy sauce

a-酯類；b-醇類；c-醛類；d-酮類；e-酸類；f-酚類；g-吡嗪類圖4 醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類熱圖Fig.4 Clustering heatmap of volatile flavor compounds in soy sauce

酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)是醬油中主要的香氣物質(zhì)。由表2可知，添加菌株L04-1、L04-2發(fā)酵的醬油中檢出的酯類物質(zhì)含量分別為1 463.75及1 247.92 μg/L，比出發(fā)菌株高36.60%和16.46%，較對(duì)照組分別提升了89.48%及61.54%；2株突變株添加發(fā)酵的醬油中檢出的醇類物質(zhì)種類數(shù)與L04及對(duì)照組相比差別不大，但總含量較L04及對(duì)照組有明顯增加，分別為4 209.80和3 777.16 μg/L，比出發(fā)菌株高23.24%和10.58%，相比對(duì)照組提升了41.74%及27.18%；添加突變株L04-1發(fā)酵的醬油中酯類和醇類物質(zhì)的種類最多且總含量最高，對(duì)醬油酯類香氣的貢獻(xiàn)最明顯。由圖4-a可知，L04-1發(fā)酵的醬油中增加的酯類物質(zhì)主要為乳酸乙酯、乙酸乙酯、異戊酸乙酯等12種乙酯類物質(zhì)，其含量占酯類總含量的70.95%，其中乳酸乙酯含量的增加與L04-1的發(fā)酵產(chǎn)乳酸相關(guān)，其代謝生成的乳酸可與乙醇酯化促進(jìn)乳酸乙酯的形成。此外，添加L04-1、L04-2發(fā)酵醬油中乙醇含量明顯高于L04及對(duì)照組，這可能是由于誘變后菌株的異型乳酸發(fā)酵相關(guān)代謝途徑的代謝流增強(qiáng)，使其在醬醪發(fā)酵中可代謝積累更多的乙醇，乙醇含量的提升促進(jìn)乙醇與有機(jī)酸的酯化反應(yīng)，使得醬油中的乙酯類物質(zhì)含量增加。

醛類物質(zhì)主要來(lái)源于氨基酸的降解和微生物的發(fā)酵轉(zhuǎn)化，具有調(diào)和香氣的作用[18]。圖4-c顯示，一共檢測(cè)到9種醛類物質(zhì)，添加3株突變株發(fā)酵的醬油中醛類物質(zhì)的含量均比L04和對(duì)照組高，其中添加L04-1發(fā)酵對(duì)醛類物質(zhì)的提升作用最明顯，可促進(jìn)苯乙醛、3-甲基丁醛、2-苯基巴豆醛及乙縮醛的積累。檢測(cè)到的揮發(fā)性酸類共有6種，3株菌分別促進(jìn)了不同酸類物質(zhì)的增加，L04添加發(fā)酵增加的酸類為2-甲基庚酸；L04-1添加發(fā)酵增加的酸類為乙酸、2-乙基庚酸和對(duì)芐氧基苯甲酸；L04-2添加發(fā)酵增加的酸類為硫代乙酸和乙酰氧基乙酸。酮類物質(zhì)共檢測(cè)到6種，僅L04-1促進(jìn)了酮類物質(zhì)的積累，其可明顯提升3-羥基-2-丁酮(奶油香)、3-庚酮(油脂香)、3-辛酮(果香)的含量[19]，豐富醬油的香氣。酚類和吡嗪類是構(gòu)成醬油特征香氣的重要物質(zhì)[20]，L04和L04-2的添加發(fā)酵對(duì)酚類和吡嗪類物質(zhì)影響不大，而L04-1可促進(jìn)4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-甲氧基苯酚、2,6-二甲基吡嗪、2-甲基吡嗪和2-乙基-3,6-二甲基吡嗪的積累，有助于醬油特征醬香的形成。由此可見(jiàn)，3株耐鹽植物乳桿菌均有提升醬油香氣的作用，其中突變株L04-1在醬油酯香、醇香及醬香的形成上相比其他2株菌具有一定的優(yōu)勢(shì)。

利用偏最小二乘法(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)分析2株突變株和出發(fā)菌株發(fā)酵的醬油與對(duì)照組醬油之間的差異風(fēng)味物質(zhì)，其結(jié)果見(jiàn)圖5。圖5-a顯示，2株突變株的添加發(fā)酵與多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)積累的呈現(xiàn)正相關(guān)，其中與突變株L04-1呈現(xiàn)正相關(guān)的物質(zhì)更多，主要為醇類和酯類物質(zhì)，說(shuō)明添加L04-1發(fā)酵對(duì)醬油酯類和醇類物質(zhì)的生成貢獻(xiàn)較大；VIP值分析顯示，VIP值大于1的差異風(fēng)味物質(zhì)為5種酯類、6種醇類、1種酮類、3種酸類和1種酚類。圖5-b中物質(zhì)點(diǎn)偏離坐標(biāo)軸原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明耐鹽植物乳桿菌的添加發(fā)酵對(duì)其影響越大[21]，酯類物質(zhì)中VIP值較大的是花生酸乙酯(花生香氣)、乳酸乙酯(奶油香)和辛酸乙酯(花果香)[22]，添加L04-1和L04-2發(fā)酵的醬油中這3種酯類的含量均明顯高于L04；醇類物質(zhì)中VIP值較大的是3-甲基-1-丁醇(麥芽香)、2-甲基丁醇(果香)[23-24]，添加L04-2發(fā)酵的醬油中這2種醇類和L04無(wú)明顯區(qū)別，但添加L04-1發(fā)酵的醬油這2種醇的含量顯著高于L04，說(shuō)明添加L04-1發(fā)酵有利于促進(jìn)醬油形成花果香為特征的前香和主體香。

a-Biplot圖；b-VIP值分析圖5 四組醬油中差異揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析Fig.5 Analysis of differential volatile flavor compounds of four groups of soy sauce

2.2.4 醬油感官評(píng)分

感官評(píng)分是評(píng)價(jià)醬油的重要指標(biāo)，可直觀地反映醬油的風(fēng)味及品質(zhì)[25]。通過(guò)感官評(píng)分對(duì)比分析添加突變株L04-1、L04-2發(fā)酵的醬油與L04及對(duì)照組醬油的感官差異，考察其對(duì)醬油整體風(fēng)味及品質(zhì)的影響，其結(jié)果見(jiàn)圖6。添加L04-1和L04-2發(fā)酵的醬油在香氣、滋味及總分上均比L04及對(duì)照組高，香氣評(píng)分比L04分別提升了5.62%和2.85%，較對(duì)照組提升了9.10%和6.01%，其感官香氣特征為更加濃郁的酯香且前香飽滿、豐富，與揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析的結(jié)論一致；滋味評(píng)分相比L04提升了4.75%及1.78%，較對(duì)照組提升了14.04%和11.17%，其滋味感受表現(xiàn)為酸鮮適口，相比對(duì)照組醬油以及添加L04發(fā)酵的醬油口感更加清爽。感官評(píng)分的結(jié)果表明篩選得到的2株耐鹽植物乳桿菌突變株對(duì)醬油的香氣、滋味及整體風(fēng)味有著明顯的增益效果，其中突變株L04-1的效果最佳，有較好的醬油釀造應(yīng)用潛力。

圖6 添加3株耐鹽植物乳桿菌發(fā)酵醬油的感官評(píng)分Fig.6 Sensory scoring of soy sauce added with the three salt-tolerant L.plantarum

3 結(jié)論

本研究以耐鹽植物乳桿菌L04為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變選育獲得了2株耐鹽穩(wěn)定、產(chǎn)酸性能較好的突變菌株L04-1和L04-2，其在160 g/L NaCl的MRS中發(fā)酵60 h后乳酸積累量分別可達(dá)3.69和3.49 g/L。在高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵45 d分別添加3株耐鹽植物乳桿菌進(jìn)行為期120 d的發(fā)酵，結(jié)果表明耐鹽植物乳桿菌加入可提升醬醪中乳酸菌的數(shù)量并抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)；2株耐鹽植物乳桿菌突變株均可促進(jìn)醬油的乳酸、總酸及氨態(tài)氮的積累，其中突變株L04-1的發(fā)酵性能最好，其添加發(fā)酵醬油的乳酸、總酸和氨態(tài)氮含量均要高于對(duì)照組和出發(fā)菌株L04，其乳酸含量為4.31 g/L，在醬油滋味評(píng)分較高的乳酸含量范圍內(nèi)。此外，2株突變株的添加發(fā)酵還可促進(jìn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成，其中突變株L04-1的作用最明顯。添加L04-1發(fā)酵的醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總含量為7 104.04 μg/L，比對(duì)照組和L04分別增加了58.15%和31.33%，增加的主要是酯類和醇類物質(zhì)，有利于醬油前香及主體香氣的形成。此外，感官評(píng)分的結(jié)果也表明L04-1對(duì)醬油的香氣、滋味有著明顯的增益效果。綜上，本研究選育的耐鹽植物乳桿菌有應(yīng)用于高鹽稀態(tài)醬油釀造產(chǎn)乳酸、增風(fēng)味的潛力。