Necroptosis 抑制劑及相關(guān)病癥的研究進(jìn)展

易宏婷，曾宣銘，張玉珂，顏蓉，雷彬，陳鐘文，劉華

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌，330004）

0 引言

Necroptosis 稱為程序性細(xì)胞壞死或壞死性凋亡，是先由受體相互作用蛋白激酶1/3（Receptor-Interacting Protein Kinase 1/3，RIPK1/3）發(fā)動(dòng)，再由下游的混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（Mixed Lineage Kinase Domain-Like Protein，MLKL）來(lái)執(zhí)行的一種細(xì)胞死亡方式［1］。其中，RIPK1/3 是necroptosis 的關(guān)鍵酶，受caspase 通路和泛素化調(diào)控［2］。RIPK1 是促生存的NF-κB 信號(hào)通路與腫瘤壞死因子TNF 信號(hào)通路響應(yīng)的細(xì)胞死亡之間的細(xì)胞決策關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。RIPK3通過(guò)其獨(dú)特的C 端段與RIPK1 的結(jié)合，抑制RIPK1 和TNFR1 介導(dǎo)的NF-kB 激活；MLKL 被鑒定為RIPK3的下游靶點(diǎn)和necroptosis 的最終執(zhí)行器［3］。RIPK3 和MLKL 的表達(dá)都是誘導(dǎo)necroptosis 的必要條件。該文主要從與necroptosis 相關(guān)的疾病和necroptosis 兩類主要的抑制劑進(jìn)行綜述，期望為中醫(yī)藥類necroptosis 抑制劑的科學(xué)研究和臨床提供參考。

1 necroptosis 與疾病

1.1 腫瘤

研究表明，necroptosis 相關(guān)激酶 RIPK1、RIPK3和 MLKL 與放射治療（放療）后的腫瘤再增殖息息相關(guān)［4］。

RIPK1 能通過(guò)NF-κB 依賴途徑促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞增殖，并且能夠延緩黑色素瘤異種移植在體內(nèi)的生長(zhǎng)，抑制黑色素瘤細(xì)胞在體外增殖［10］。RIPK3 與MLKL 的表達(dá)在癌癥中發(fā)揮抗炎和抗腫瘤的作用。乳腺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、 慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系白血病、肺癌和黑素瘤、膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、骨髓瘤和淋巴瘤等癌癥患者的樣本中RIPK3 表達(dá)降低［6，7］。在攜帶突變急性髓系白血病驅(qū)動(dòng)基因的骨髓細(xì)胞移植的小鼠中，敲除RIPK3 后，白血病發(fā)生明顯加快，RIPK3敲除小鼠的存活率也低于野生型小鼠。并且，RIPK3敲除小鼠發(fā)生結(jié)腸炎相關(guān)結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)更高，并產(chǎn)生了更多的促炎或促腫瘤因子［8］。同樣，RIPK3 低表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后較差［6］。而敲除MLKL 可防止腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞類型的壞死［5］。MLKL 的不正常表達(dá)亦會(huì)對(duì)諸多癌癥造成影響，其若表達(dá)偏低會(huì)導(dǎo)致胃癌、食管癌、卵巢癌和結(jié)腸癌的預(yù)后不良，其若表達(dá)偏高則會(huì)影響宮頸鱗癌的總體存活率的改善［6］。

1.2 炎癥性疾病

細(xì)胞發(fā)生necroptosis 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物流出，引發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)又會(huì)導(dǎo)致necroptosis。關(guān)節(jié)炎、敗血癥、急性胰腺炎、腸炎和肺炎等都是與necroptosis 相關(guān)的炎癥性疾?。?0］。研究表明，促炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放使得程序性細(xì)胞壞死的細(xì)胞可以調(diào)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生［16］，這為治療炎癥性疾病提供了新的思路。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以累及周圍關(guān)節(jié)為主的慢性、系統(tǒng)性和炎癥性自身免疫性疾病。慢性增生性滑膜炎是導(dǎo)致RA 的基本病理改變以及關(guān)節(jié)破壞的罪魁禍?zhǔn)?。文獻(xiàn)報(bào)道［9］，膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎鼠關(guān)節(jié)滑膜中程序性細(xì)胞壞死的標(biāo)志性蛋白p-MLKL 的表達(dá)水平明顯升高。此外，RA 關(guān)節(jié)滑膜中p-MLKL 和MLKL 的表達(dá)水平顯著增高［9］，p-MLKL 在誘導(dǎo)壞死中顯著增加14-3-3η 蛋白的釋放［11］。此外，p-MLKL 的表達(dá)水平與紅細(xì)胞沉降率、Krenn 總分及襯里下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)亞分呈正相關(guān)。RA 患者關(guān)節(jié)中的中性粒細(xì)胞在跨膜黏附糖蛋白CD44 和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的影響下激活RIPK1、RIPK3 和MLKL，引起程序性細(xì)胞壞死，此時(shí)可通過(guò)應(yīng)用成纖維細(xì)胞激活蛋白-α（FAP-α）來(lái)阻止壞死［12］，這突出了FAP-α 作為治療RA 有效藥物的重要性。

RIPK3 依賴型necroptosis 亦能促成慢性炎性疾病。例如在Ripk3-/-、ApoE-/-和Ldl-/-的動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的斑塊中的壞死巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著減少［9］。敲除 RIPK3 基因的小鼠能有效阻止腸炎的發(fā)生。RIPK1 與心臟缺血再灌注損傷有關(guān)［13］，而RIPK3 與心肌梗死誘導(dǎo)的心肌壞死和重塑有關(guān)。在RIPK1 缺失的情況下，RIP3 會(huì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生壞死［14］。此外，由RIPK3 引起的心肌壞死是通過(guò)CaMKII 的激活介導(dǎo)的，因此心肌細(xì)胞中RIPK3 依賴性的壞死與許多其他細(xì)胞類型的壞死明顯不同，在其他細(xì)胞類型中它需要RIPK1 和MLKL［13］。這些發(fā)現(xiàn)揭示了一種以前未被重視的壞死模式，并為缺血和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心臟損傷、適應(yīng)不良重構(gòu)和心力衰竭提供了新的治療靶點(diǎn)。

1.3 神經(jīng)退行性疾病

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）、多發(fā)性硬化（Multiple Scalerosis，MS）、肌萎縮側(cè)束硬化（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）和阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s Disease，AD）等神經(jīng)退行性疾病的病理進(jìn)程都受到 necroptosis 的影響［16］。

最新研究［13］表明TNF-α 可以通過(guò)RIPK1-FADD-Caspase-8 軸誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)RIPK3-MLKL 信號(hào)通路誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生necroptosis，進(jìn)而引起PD。PD 的病理性細(xì)胞死亡過(guò)程與RIPK1 磷酸化激活有關(guān)。在MS 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，促炎細(xì)胞因子——TNF- α，在caspase-8 缺乏的情況下，會(huì)激活 RIPK1 和RIPK3 介導(dǎo)的necroptosis 通路，引起神經(jīng)元的退行性病變，誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞的變性死亡。此外，研究表明，在MS 病理的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，抑制RIPK1 可防止TNF-α 誘導(dǎo)的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡，故而MS 可以采取靶向RIPK1 抑制劑的治療。在 ALS病理發(fā)展過(guò)程中，RIPK1、RIPK3 和 MLKL 信號(hào)通路在脊髓神經(jīng)組織內(nèi)被激活，進(jìn)而影響進(jìn)行性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元死亡和神經(jīng)軸突的退化［16］。此外，隨著腦內(nèi) RIPK/MLKL 信號(hào)通路活性的降低，AD 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元死亡和認(rèn)知功能也會(huì)降低［17］。

1.4 其他疾病

創(chuàng)傷性腦損傷（TBI）致殘及死亡的元兇之一是大量細(xì)胞壞死。腦組織的損傷及功能障礙與necroptosis密切相關(guān)。研究表明，通過(guò)誘導(dǎo)致死性氧化應(yīng)激來(lái)活化Akt/mTOR 會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元necroptosis，抑制necroptosis 有可能為TBI 提供一種新的治療策略。此外，necroptosis 還是腦血管疾病，例如腦缺血、再灌注損傷的重要死亡途徑；缺血性腦損傷與細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)缺乏導(dǎo)致necroptosis 誘導(dǎo)產(chǎn)生有關(guān)［18］。

除此之外，necroptosis 還參與到病毒、細(xì)菌和寄生蟲(chóng)等病原微生物感染，以及腎臟、肝臟和免疫性等疾病的病程中，會(huì)加重細(xì)胞或組織損傷［10］。

2 necroptosis 的抑制劑

necroptosis 既能促進(jìn)某些疾病的發(fā)生，又能成為治療腫瘤的潛在方式。因此，necroptosis 的誘導(dǎo)劑和抑制劑的研究是一場(chǎng)具有重大意義的持久戰(zhàn)。necroptosis 抑制劑針對(duì)作用靶點(diǎn)的不同，分為RIPK1 抑制劑、RIPK3 抑制劑和 MLKL 抑制劑。PIPK1 抑制劑有Nec-1、Nec-1s、Nec-3、Nec-4、Nec-5、 GSK963、TAK-632、B31j；RIPK3 抑制劑有Dabrafenib、GSK840、GSK843、GSK872、HS-1371、KongensinA、TAK-632、B31j、C1m；MLKL抑制劑有Necrosulfonamide（NSA）、Thioredoxin-1、TC13172、GW806742X［7，33］。 其中，Nec-1 和NSA是研究較為深入的兩種。

2.1 特異性抑制劑Nec-1

Nec-1 是一種小分子生物堿，是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的necroptosis 特異性小分子抑制劑。Nec-1 不僅能阻止程序性細(xì)胞壞死，也能抑制細(xì)胞凋亡［19］。

Nec-1 能顯著縮小心肌梗死的梗死面積，并通過(guò)抑制 RIPK1 的表達(dá)減少心肌細(xì)胞丟失，來(lái)保護(hù)心肌、改善心肌重構(gòu)和心臟功能［21，24］；還能改善腦水腫、減少顱內(nèi)損傷以及提高腦神經(jīng)功能［22］；也能緩解急性肝衰竭、急性腎衰竭和缺血再灌注等的疾病進(jìn)展，提高生存期和疾病預(yù)后［7］。

此外，研究表明，Nec-1 能顯著抑制 ROS 的生成［23］；還能提高因缺氧引起的細(xì)胞損傷的細(xì)胞活性，也能緩解急性肝衰竭小鼠模型線粒體功能障礙，并抑制 ROS 生成及其對(duì)細(xì)胞的損傷［24，25］。盡管Nec-1對(duì)諸多疾病具有抑制作用，但因其半衰期很短 （t1/2<5 min），造成其成藥性較差。研究繼而發(fā)現(xiàn)Nec-1s 具有較好的活性，且其半衰期也有明顯提升［26］，這便為RIPK1 抑制劑的進(jìn)一步研究提供了新思路。

2.2 necroptosis 抑制劑NSA

NSA 是由美國(guó)科學(xué)院院士王曉東教授的團(tuán)隊(duì)通過(guò)建模抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29 死亡，篩選20 萬(wàn)個(gè)化合物得到的一種MLKL 小分子抑制劑，證明NSA 可以有效防止HT-29 的necroptosis［27］。

NSA 具有物種特異性。Sun L 等人［28］研究發(fā)現(xiàn)，人類MLKL 中被NSA 共價(jià)修飾的半胱氨殘基cys86 在小鼠MLKL 中被色氨酸殘基所取代，導(dǎo)致NSA 具有物種特異性，其能有效阻斷人類細(xì)胞的壞死，但不能阻斷小鼠細(xì)胞的壞死。

單獨(dú)處理的NSA 雖然能顯著增強(qiáng)Caspase 抑制劑（z-VAD.fmk）對(duì)小分子Smac 模擬物（BV6）或去甲基化劑（5AC）誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，但不能阻止細(xì)胞死亡。此外，NSA 與 MLKL 基因在誘導(dǎo)necroptosis 的情況下被敲減，也均能使管狀線粒體保持正常形態(tài)［29］。 當(dāng)存在NSA 時(shí)，僅能觀察到離散的RIPK3，故而NSA 可以通過(guò)作用于壞死的特定途徑，來(lái)阻止necroptosis［30］。另外，NSA 可以抑制髓核（NP）細(xì)胞凋亡和necroptosis 來(lái)預(yù)防NP 降解［31］，還可以抑制NCM460 細(xì)胞磷酸化MLKL 的表達(dá)和necroptosis，最終緩解腸道炎癥等［31］。

最新研究發(fā)現(xiàn)，NSA 在嚙齒動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型中具有治療窗口期，除了抑制MLKL 活性外，還能通過(guò)提高脊髓損傷小鼠模型的抗氧化能力來(lái)改善神經(jīng)功能損傷，減輕AD 大鼠模型中的淀粉樣變性和牛頭病變［32］。此外，NSA 通過(guò)誘導(dǎo)MLKL 泛素化和降解，在小鼠缺血性腦損傷后表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用并通過(guò)抑制炎癥和壞死來(lái)減輕小鼠腦出血模型的急性腦損傷［33］，對(duì)在帕金森?。≒D）亞急性MPTP 小鼠模型中類似PD 的行為缺陷和病理生理，如壞死、神經(jīng)炎癥和α-突觸核蛋白寡聚化有治療作用［34］。這些研究結(jié)果均為necroptosis 在疾病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用增加了證據(jù)。

靶向MLKL 的NSA 雖然在對(duì)necroptosis 的特異性上非常具有優(yōu)勢(shì)，但是對(duì)其構(gòu)效關(guān)系的研究并沒(méi)有得到活性提升的衍生化合物，因此難以作為藥物開(kāi)發(fā)的前提［35］。

綜上，最具代表性的nec-1 和NSA 抑制劑均存在各自的不足，并未能上市成為necroptosis 抑制劑，而天然產(chǎn)物具有多種生理活性，包括抗腫瘤、抗氧化、抗炎等，同時(shí)還具有副作用小、安全性高等優(yōu)勢(shì)，在藥品、食品及日化等領(lǐng)域存在著巨大的開(kāi)發(fā)潛力。最新研究表明，紫草中的紫草素不僅能誘導(dǎo)卵巢癌［36］、鼻咽癌［37］細(xì)胞與三陰性乳腺癌細(xì)胞［38］產(chǎn)生大量的活性氧、上調(diào)RIPK1 和RIPK3 蛋白的表達(dá)，以激活necroptosis 進(jìn)程，明顯抑制卵巢癌SKOV3 和A2780 細(xì)胞、鼻咽癌CNE2 和HNE2 細(xì)胞與三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的增殖，還能抑制炎癥并通過(guò)提高抗氧化能力發(fā)揮防治血熱證的藥理作用［39］，也能通過(guò)增加抗氧化酶基因表達(dá)及抑制ERK1/2-NFκB 信號(hào)通路改善T2DM 肝損傷［40］等。

3 總結(jié)與展望

2022 年9 月，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的報(bào)告顯示，心臟病、癌癥、糖尿病等非傳染性疾病 （NCDs）已超過(guò)傳染病，成為“全球頭號(hào)殺手”，每?jī)擅腌娋陀幸幻?0 歲以下的人死于非傳染性疾病，每年約占全球死亡人數(shù)的四分之三死于該類疾病。necroptosis 與非傳染性疾病息息相關(guān)，近年來(lái)，與necroptosis 相關(guān)的研究成了一個(gè)廣泛和迅速發(fā)展的領(lǐng)域。但從上市藥物中篩選得到的抗necroptosis 抑制劑靶點(diǎn)不僅選擇性較差，而且可能會(huì)引起大量不良反應(yīng)。此外，迄今為止發(fā)現(xiàn)的各種抑制劑均存在成藥性較差、分子量或毒性較大等問(wèn)題，因此很難成藥。天然產(chǎn)物正好能彌補(bǔ)現(xiàn)有抑制劑的不足，這不僅是對(duì)于成為necroptosis 抑制劑，還是對(duì)于中醫(yī)藥的發(fā)展都具有很深遠(yuǎn)的價(jià)值與意義。該綜述查閱了近幾年的相關(guān)文獻(xiàn)，以necroptosis的主要通路—TNF-α-RIP1/3-MLKL 展開(kāi)，將蛋白與疾病、抑制劑聯(lián)系起來(lái)，旨在從已知突破未知，能夠克服necroptosis 抑制劑的種種缺陷，為研發(fā)高效、高選擇性、代謝穩(wěn)定性好和低毒性的necroptosis 抑制劑提供參考。