全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性與致畸效應(yīng)

劉笑楠，吳 昊，鄭麗利，許 佳，高雪忠，高斐斐，江 敏,2

( 1.上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306； 2.上海海洋大學(xué)，上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306； 3.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 4.上海市奉賢區(qū)水產(chǎn)技術(shù)推廣站，上海 201419 )

全氟辛烷磺酸作為一種全氟烷基化合物，具有較高的生物、化學(xué)和熱穩(wěn)定性[1]，被廣泛應(yīng)用于紡織、航空、造紙等行業(yè)。其具有難降解性、生物累積性、半揮發(fā)性和高毒性等特性，在2009年被增列為新的持久性有機(jī)污染物[2]。研究顯示，目前世界各地水域中均存在不同程度的全氟辛烷磺酸污染[3-4]，如：德國萊茵河流域中全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度可達(dá)28 ng/L[5]；美國田納西州河水域中其質(zhì)量濃度范圍為16.8～54.1 ng/L[6]；日本東京灣水域和印度恒河水域中均檢測(cè)到較高含量的全氟辛烷磺酸[7-8]。我國太湖附近水域中全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度為9.8～121.0 ng/L[9]，海河流域檢測(cè)到的最高質(zhì)量濃度可達(dá)127 ng/L[10]。全氟辛烷磺酸具有很強(qiáng)的生物毒性，易在生物體內(nèi)蓄積[11]。Sinclair等[12]研究表明，美國紐約州加拉河地區(qū)野生鯽(Carassiusauratus)肝胰臟中全氟辛烷磺酸的質(zhì)量濃度達(dá)315 ng/g，而其在食肉性鳥類體內(nèi)的含量比非食肉性鳥類高2.5倍。研究者在白魚(Anabarilius)魚卵中亦檢測(cè)到了全氟辛烷磺酸，證明其能夠在卵生魚類的胚胎中進(jìn)行轉(zhuǎn)移，危害胚胎健康發(fā)育[13]。魚類是人類社會(huì)重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，也是生物鏈的重要環(huán)節(jié)[14]。近年來，隨著全氟辛烷磺酸在水環(huán)境中的廣泛檢出，其對(duì)魚類的多種毒性效應(yīng)也愈發(fā)受到人們關(guān)注。胚胎作為魚類發(fā)育的重要階段，易受到環(huán)境中有害物質(zhì)的影響而造成發(fā)育異常，因此開展全氟辛烷磺酸的魚類胚胎毒性試驗(yàn)對(duì)研究其生態(tài)毒理效應(yīng)具有重要意義。

斑馬魚(Daniorerio)作為常用的模式生物之一，其胚胎具有發(fā)育周期短、透明易觀察和用量少等特點(diǎn)，常被用于魚類毒理學(xué)研究。斑馬魚胚胎發(fā)育分為卵裂期(0.6～2.2 h)、囊胚期(2.7～6.0 h)、原腸胚期(6.6～10.6 h)、分裂期(12.1～23.8 h)、成形期(23.8～52.1 h)、孵化期(54.0～80.0 h)[15]。已有研究表明，全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎具有致死和致畸效應(yīng)，但對(duì)其致死及致畸的質(zhì)量濃度以及不同時(shí)期胚胎產(chǎn)生的畸形現(xiàn)象尚缺少更細(xì)致的數(shù)據(jù)。筆者在實(shí)驗(yàn)室條件下，分析全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性和畸形效應(yīng)，探究其發(fā)育毒性，為全氟辛烷磺酸的環(huán)境安全評(píng)價(jià)及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

全氟辛烷磺酸(C8HF17O3S)，純度98.7%，購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的斑馬魚購自上海某養(yǎng)殖基地，體長(zhǎng)(2.0±0.2) cm。正式試驗(yàn)前，將雌、雄斑馬魚分開，分別置于30 cm×30 cm×30 cm的玻璃魚缸中馴養(yǎng)，養(yǎng)殖用水為曝氣48 h的自來水，用加熱棒控制水溫在(26±2) ℃，每日8：00、12：00、17：00定時(shí)投喂開口飼料。馴養(yǎng)1個(gè)月后，選取健康雌、雄魚交配產(chǎn)卵，在顯微鏡下篩選正常受精的健康胚胎用于急性毒性試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)所用斑馬魚胚胎為自行培育所得，收集魚卵前12 h分別在馴養(yǎng)雌、雄斑馬魚的魚缸中，選取魚齡相當(dāng)、性特征發(fā)育明顯的健康斑馬魚，按雌、雄比例1∶2放入斑馬魚產(chǎn)卵繁殖盒中，并用格柵將雌、雄魚隔開，放入恒溫培養(yǎng)箱過夜。次日天亮后更換養(yǎng)殖水，再將產(chǎn)卵盒內(nèi)的格柵抽出，讓雌、雄魚正常交配產(chǎn)卵，斑馬魚交配產(chǎn)卵2 h后，將雌、雄魚分別放回原馴養(yǎng)缸中，使用消毒滅菌后的一次性吸管收集產(chǎn)卵盒底部的斑馬魚胚胎并在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行篩選，取正常受精、發(fā)育狀況良好的斑馬魚胚胎用于毒性脅迫試驗(yàn)。在胚胎卵裂期結(jié)束后進(jìn)行染毒，觀察全氟辛烷磺酸脅迫下，斑馬魚胚胎在不同時(shí)期的發(fā)育情況。

根據(jù)GB/T 13267—1991《水質(zhì) 物質(zhì)對(duì)淡水魚(斑馬魚)急性毒性測(cè)定方法》，采用靜水式試驗(yàn)，在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)1個(gè)對(duì)照組和6個(gè)試驗(yàn)組(1.00、1.58、2.51、3.98、6.31、10.00 μg/mL)。取消毒殺菌后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，選取7行，自上而下依次為對(duì)照組和6個(gè)試驗(yàn)組，每行選取10個(gè)孔，每孔1枚健康胚胎，試驗(yàn)設(shè)3組平行。染毒6、12 h后在熒光體式顯微鏡下觀察胚胎的發(fā)育情況，之后每隔12 h觀察1次，直至96 h。

試驗(yàn)以胚胎細(xì)胞的損毀、卵凝結(jié)、胚胎渾濁和無心跳等現(xiàn)象為死亡標(biāo)志，記錄不同時(shí)間胚胎死亡個(gè)數(shù)、孵化個(gè)數(shù)和平均心率值；使用熒光體式顯微鏡觀察胚胎發(fā)育過程中的畸形現(xiàn)象。

按照改良寇氏法[16]，計(jì)算24、48、72、96 h時(shí)全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的半致死質(zhì)量濃度：

m=X-i(∑p-0.5)

(1)

(2)

式中，m為半致死質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值，X為最大劑量的對(duì)數(shù)值，i為相鄰兩劑量組對(duì)數(shù)劑量差值，∑p為各劑量組死亡率之和，q為存活率，Sm為半致死質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，n為每組胚胎數(shù)量。

使用Excel 2010處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，通過最小極差法多重比較對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，使用Prism 8.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響

全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度結(jié)果見表1，其中96 h半致死質(zhì)量濃度為2.67 μg/mL，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式[17]得到全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的安全質(zhì)量濃度為0.27 μg/mL。隨著全氟辛烷磺酸暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，胚胎死亡數(shù)逐漸增多；相同暴露時(shí)間時(shí)，不同質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸導(dǎo)致胚胎死亡率也有顯著差異；暴露72 h時(shí)，10 μg/mL的全氟辛烷磺酸試驗(yàn)組胚胎死亡率達(dá)100%(圖1)。

圖1 不同質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響

表1 全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的半致死質(zhì)量濃度

2.2 全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎孵化具有明顯的抑制作用(圖2)。當(dāng)胚胎發(fā)育至96 h，除低質(zhì)量濃度組(1.00、1.58 μg/mL)外，中高質(zhì)量濃度組(2.51、3.98 μg/mL)和高質(zhì)量濃度組(6.31、10.00 μg/mL)胚胎孵化率均低于50%。其中高質(zhì)量濃度組在60 h后，不再孵化仔魚。全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度為10 μg/mL時(shí)，胚胎孵化率僅10%，且均在孵化破膜后12 h內(nèi)死亡。

圖2 不同質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

2.3 全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

暴露于全氟辛烷磺酸中的斑馬魚胚胎心率會(huì)明顯加快(圖3)。胚胎發(fā)育至84 h，心臟功能趨于成熟，胚胎心率達(dá)到峰值，此時(shí)各試驗(yàn)組胚胎的心率均高于對(duì)照組。中高質(zhì)量濃度組(2.51、3.98 μg/mL)全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚心率的提升作用最強(qiáng)，低質(zhì)量濃度組(1.00、1.58 μg/mL)與高質(zhì)量濃度組(6.31 μg/mL)對(duì)斑馬魚胚胎心率的提升作用則弱于中高質(zhì)量濃度組。

圖3 不同質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

2.4 全氟辛烷磺酸誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育產(chǎn)生的畸形現(xiàn)象

在全氟辛烷磺酸影響下，不同發(fā)育階段的胚胎呈現(xiàn)不同的畸形現(xiàn)象，且畸變程度與全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度正相關(guān)(圖4)。當(dāng)脅迫試驗(yàn)進(jìn)行至48 h后，中高質(zhì)量濃度組(2.51、3.98 μg/mL)和高質(zhì)量濃度組(6.31 μg/mL)胚胎畸形率顯著升高(P<0.05)，且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，畸變現(xiàn)象愈發(fā)明顯。發(fā)生畸變的胚胎在破膜后也出現(xiàn)活力較差、游動(dòng)和覓食能力下降等現(xiàn)象，最終在破膜后一段時(shí)間內(nèi)死亡。

圖4 不同質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎畸形率的影響

囊胚期：3.98 μg/mL及以上各試驗(yàn)組斑馬魚胚胎胚層細(xì)胞分裂異常，出現(xiàn)卵黃細(xì)胞隆起不顯著和卵凝結(jié)等現(xiàn)象(圖5)。

圖5 全氟辛烷磺酸脅迫6 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

原腸胚期：3.98 μg/mL及以上各試驗(yàn)組斑馬魚胚胎前后體軸形成受阻，胚層發(fā)育緩慢，出現(xiàn)了卵黃外突和原腸外突等畸形現(xiàn)象(圖6)。

圖6 全氟辛烷磺酸脅迫12 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

分裂期：全氟辛烷磺酸暴露使胚胎肌節(jié)發(fā)育緩慢，2.51 μg/mL組胚胎胚軸末端生長(zhǎng)被抑制，出現(xiàn)了明顯的尾部畸變和卵黃囊異?，F(xiàn)象，3.98 μg/mL及以上各試驗(yàn)組胚胎發(fā)育緩慢甚至出現(xiàn)萎縮(圖7)。

圖7 全氟辛烷磺酸脅迫24 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

成形期：胚胎在全氟辛烷磺酸脅迫下所產(chǎn)生的畸變程度加強(qiáng)，2.51 μg/mL及以上各試驗(yàn)組可觀察到胚胎的心率不穩(wěn)并且后靜脈血流速度也相應(yīng)減慢，出現(xiàn)心包腔腫大、脊椎彎曲和尾部萎縮等現(xiàn)象(圖8、圖9)。

圖8 全氟辛烷磺酸脅迫36 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

圖9 全氟辛烷磺酸脅迫48 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

孵化期：斑馬魚胚胎受全氟辛烷磺酸影響表現(xiàn)出更明顯的尾部萎縮和曲折、色素沉積減少、脊椎彎曲、心包腔腫大等現(xiàn)象(圖10、圖11)。

圖10 全氟辛烷磺酸脅迫60 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

圖11 全氟辛烷磺酸脅迫72 h的斑馬魚胚胎發(fā)育情況

3 討 論

3.1 全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎死亡率的影響

Yang等[18]研究發(fā)現(xiàn)，全氟辛烷磺酸對(duì)魚類的96 h半致死質(zhì)量濃度為4.20～81.18 μg/mL，陳藝紅等[19]將斑馬魚胚胎暴露于10～90 μg/mL的全氟辛烷磺酸中，胚胎死亡率隨其質(zhì)量濃度升高而逐漸升高。郭晉姝等[17]發(fā)現(xiàn)，全氟辛烷磺酸暴露下的斑馬魚成魚在24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為26.09、9.08、3.91、2.58 μg/mL。本試驗(yàn)中，全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為7.81、6.58、3.44、2.67 μg/mL，安全質(zhì)量濃度為0.27 μg/mL，根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的毒性為高毒。比較可知，全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的24、48 h半致死質(zhì)量濃度明顯低于成魚，說明胚胎比成魚對(duì)全氟辛烷磺酸更為敏感。

3.2 全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率的影響

Shi等[20]發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚胚胎暴露在5 μg/mL的全氟辛烷磺酸溶液中，胚胎孵化率顯著降低；本試驗(yàn)中，3.98、6.31 μg/mL組的胚胎孵化率分別為43.3%和26.7%，均顯著低于對(duì)照組。胡芹[21]發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚胚胎暴露于0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/mL的全氟辛烷磺酸溶液中，其孵化率會(huì)隨質(zhì)量濃度加大而顯著降低，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。另有研究表明，全氟辛烷磺酸會(huì)造成斑馬魚胚胎細(xì)胞膜損傷，抑制胚胎的孵化[22]；本試驗(yàn)亦觀察到相似現(xiàn)象，各試驗(yàn)組胚胎均出現(xiàn)孵化延緩現(xiàn)象，高質(zhì)量濃度的6.31、10.00 μg/mL組部分胚胎未能孵化即死亡。

3.3 全氟辛烷磺酸暴露對(duì)斑馬魚胚胎心率的影響

趙雪松等[23]研究表明，將斑馬魚胚胎分別暴露于5、10 μg/mL的全氟辛烷磺酸溶液中，48 h時(shí)胚胎心率與對(duì)照組無明顯差異，而84 h時(shí)顯著高于對(duì)照組；另有研究表明，暴露在1.00、10.00 μg/mL全氟辛烷磺酸中的斑馬魚仔魚心率在96 h時(shí)高于對(duì)照組，并且仔魚心率在一定范圍內(nèi)會(huì)隨全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度的增加而加快[24]。本試驗(yàn)中，當(dāng)斑馬魚胚胎心率達(dá)到峰值時(shí)，與對(duì)照組相比，中高質(zhì)量濃度組(2.51、3.98 μg/mL)的胚胎心率增加最明顯，低質(zhì)量濃度組(1.00、1.58 μg/mL)和高質(zhì)量濃度組(6.31 μg/mL)則弱于中高質(zhì)量濃度組。這可能是由于高質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸會(huì)抑制胚胎心臟的發(fā)育，造成心房水腫，加大心臟對(duì)血液的傳導(dǎo)壓力，使全氟辛烷磺酸對(duì)胚胎心率的誘導(dǎo)作用減弱[25]。

3.4 全氟辛烷磺酸誘導(dǎo)斑馬魚胚胎發(fā)育產(chǎn)生的畸形現(xiàn)象

全氟辛烷磺酸對(duì)幼體發(fā)育具有明顯的致畸效應(yīng)[26]。有研究表明：全氟辛烷磺酸可以干擾多種信號(hào)蛋白通路進(jìn)而擾亂細(xì)胞間隙的連接通信，以此破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，造成細(xì)胞分裂異常[27-28]；全氟辛烷磺酸暴露使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性增加，使細(xì)胞易受到污染物質(zhì)影響而產(chǎn)生凋亡[29]；并且高質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸暴露會(huì)導(dǎo)致斑馬魚胚胎出現(xiàn)卵凝結(jié)，影響原腸胚的形成[22]。筆者發(fā)現(xiàn)，在囊胚期和原腸胚期，全氟辛烷磺酸暴露下斑馬魚胚胎細(xì)胞也出現(xiàn)卵裂不規(guī)則、原腸外突和卵凝結(jié)等畸形。Dasgupta等[30]研究發(fā)現(xiàn)，全氟辛烷磺酸可通過影響斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝平衡來影響幼體肝臟功能，造成幼體畸形，這也被認(rèn)為是造成胚胎尾部畸變和卵黃囊異常的誘因之一。本試驗(yàn)中，在發(fā)育分裂期也觀察到斑馬魚胚胎明顯的尾部畸變和卵黃囊異?，F(xiàn)象，包括尾部曲折、尾部發(fā)育萎縮和卵黃囊異常腫脹等，并且全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度越高，畸形越明顯。Harada等[31-32]研究發(fā)現(xiàn)，全氟辛烷磺酸會(huì)影響心肌細(xì)胞的膜電位和鈣離子通道，加速Ca2+的內(nèi)流，造成幼體心肌腫大，影響心臟發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)，損壞心臟功能。筆者亦觀察到高質(zhì)量濃度全氟辛烷磺酸暴露下的胚胎心肌和心包腔腫大、心率不穩(wěn)等現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)以斑馬魚為研究對(duì)象，開展全氟辛烷磺酸對(duì)其胚胎的急性毒性和畸形效應(yīng)試驗(yàn)，確定全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為7.81、6.58、3.44、2.67 μg/mL，安全質(zhì)量濃度為0.27 μg/mL，對(duì)斑馬魚胚胎為高毒性。成形期(23.8～52.1 h)的斑馬魚胚胎比成魚對(duì)全氟辛烷磺酸更加敏感；全氟辛烷磺酸暴露下的斑馬魚胚胎出現(xiàn)死亡率升高、心率增加和孵化延遲現(xiàn)象。全氟辛烷磺酸會(huì)誘導(dǎo)斑馬魚胚胎在不同發(fā)育時(shí)期發(fā)生畸變，1.00～1.58 μg/mL的全氟辛烷磺酸對(duì)胚胎的致畸作用相對(duì)較弱；全氟辛烷磺酸質(zhì)量濃度為2.51～10.00 μg/mL時(shí)，胚胎出現(xiàn)顯著畸變，正常發(fā)育受到影響。筆者通過分析全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎的急性毒性和致畸效應(yīng)，表明全氟辛烷磺酸對(duì)斑馬魚胚胎具有顯著的發(fā)育毒性，可為全氟辛烷磺酸的環(huán)境安全評(píng)價(jià)及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考。