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    青狗尾草RNAi途徑相關(guān)基因的全基因組鑒定和表達(dá)分析

    2023-02-02 06:46:44羅皓天王龍王禹茜王月李佳禎楊夢(mèng)珂張杰鄧欣王紅艷
    生物技術(shù)通報(bào) 2023年1期
    關(guān)鍵詞:狗尾草同源谷子

    羅皓天 王龍 王禹茜 王月 李佳禎 楊夢(mèng)珂 張杰 鄧欣 王紅艷

    (遼寧大學(xué)生命科學(xué)院,沈陽(yáng) 110036)

    RNA 介導(dǎo)的DNA 甲基化(RNA-directed DNA Methylation,RdDM),是生物體內(nèi)DNA 甲基化從頭構(gòu)建的主要途徑[1]。在植物中分為典型的RdDM 途徑和非典型的RdDM 途徑,其中非典型的RdDM 途徑還包括轉(zhuǎn)錄后沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS),即RNA 干擾(RNA interference,RNAi)途徑[2]。RNAi 途徑首先利用 DNA 或 RNA 合成雙鏈 RNA(double-stranded RNA,dsRNA),RNase 會(huì)將 dsRNA 切割成小 RNA(small RNA,sRNA),這些小 RNA 可對(duì)目標(biāo)序列的 mRNA 進(jìn)行降解,從而特異性地沉默或抑制該基因表達(dá)[3]。這一途徑在對(duì)抗病毒RNA、轉(zhuǎn)座子的沉默等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2]。在RNAi 途徑中有3 種蛋白質(zhì)發(fā)揮主要作用,分別是識(shí)別并結(jié)合sRNA 序列的Argonaute(AGO)、切割dsRNA 成為sRNA 的Dicer-like(DCL)和RNA依賴的RNA 聚合酶(RDR)。AGO 家族蛋白可以與21-24 nt 的小RNA(small RNA,sRNA)相結(jié)合,并通過(guò)與SPT5L、NRPE1 和IDN2-IDP 復(fù)合物的相互作用和幫助下,將DRM2 招募到DNA 中[3-5]。不同AGO 蛋白功能也有不同,例如AGO1 可結(jié)合21-22 nt 的sRNA,AGO4 和AGO6 可結(jié)合24 nt 的sRNA;AGO9 可在生殖組織中發(fā)揮作用;AGO18 為禾本科特有的一類AGO 蛋白,最早在水稻中被發(fā)現(xiàn),主要與病毒外源RNA 入侵的防御有關(guān)[3,6]。DCL 家族是一類具有核酸內(nèi)切酶活性的蛋白質(zhì),它們可以將雙鏈小RNA(dsRNA)剪切成21-24 nt 的sRNA[5]。DCL1 可切割miRNA 前體或具有反向重復(fù)序列的mRNA,如轉(zhuǎn)座元件,并產(chǎn)生21 nt 的sRNA[7-10]。DCL2 可切割mRNA 并產(chǎn)生22 nt 的sRNA[5]。DCL3會(huì)優(yōu)先靶向Pol Ⅳ-RDR2 復(fù)合物產(chǎn)生的dsRNA,切割并產(chǎn)生24 nt 的sRNA,但也可以切割其他dsRNA底物[5,7-8]。DCL4 可產(chǎn)生21 nt 的sRNA,在禾本科中SHO 為DCL4 的同源蛋白[7-8]。DCL1/2/3/4 之間會(huì)互相競(jìng)爭(zhēng)底物,當(dāng)DCL2/4 參與的PTGS 通路飽和時(shí),DCL3 可以介入并處理DCL2/4 的dsRNA 底物,觸發(fā)PTGS 向RdDM 介導(dǎo)的TGS 轉(zhuǎn)換[7-8,11]。RDR家族是一類RNA 依賴型RNA 聚合酶[5]。RDR2 可以與Pol Ⅳ結(jié)合,將Pol Ⅳ產(chǎn)生的單鏈RNA 產(chǎn)物加工成雙鏈RNA[12]。RDR6 可將AGO1 產(chǎn)生的單鏈sRNA 加工成dsRNA,從而導(dǎo)致PTGS[5,13]。

    目前已知的所有動(dòng)植物中均存在AGO、DCL 和RDR 基因的多個(gè)拷貝,并且部分基因的功能已被闡明[14]。以禾本科為例,水稻(Oryza sativa)中含有19 種AGO 蛋白,8 個(gè)DCL 類蛋白和5 個(gè)RDR 蛋白[14]。在谷子(Setaria italica)中鑒定出AGO 蛋白13 個(gè),DCL 蛋白7 個(gè)以及RDR 蛋白4 個(gè)[15]?;蚩截悢?shù)的多樣性為基因功能的變化提供了空間,有利于物種的進(jìn)化[16]。青狗尾草(Setaria viridis)是谷子的野生近緣種,為禾本科2 倍體(2n=2x=18)C4植物,廣泛分布在世界各地。大約在9 000-6 000年前,青狗尾草被馴化成為谷子[17]。在作物馴化與改良過(guò)程中,落粒性和株高是兩個(gè)重要的目標(biāo)性狀。對(duì)青狗尾草群體測(cè)序,人們發(fā)現(xiàn)控制落粒性狀的基因SiLes1由于轉(zhuǎn)座元件的插入使其發(fā)生了突變,從而使得青狗尾草喪失了落粒性,并重現(xiàn)了青狗尾草馴化的初始階段[18]??梢娢锓N馴化的過(guò)程是極其復(fù)雜的,但表觀遺傳修飾基因是否受到馴化影響還有待研究。

    因此,本研究通過(guò)生物信息學(xué)和比較基因組學(xué)方法,對(duì)青狗尾草的RNAi 途徑相關(guān)的3 種主要基因家族進(jìn)行全基因組的挖掘和鑒定,并對(duì)其亞細(xì)胞位置、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、染色體位置、Ka/Ks 比值以及基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。同時(shí)比較了各家族成員在青狗尾草和谷子間的異同。本研究為上述基因在調(diào)控青狗尾草的表觀遺傳修飾中的功能和作用提供初步的理論依據(jù),為青狗尾草與谷子之間的馴化和基因進(jìn)化的分子機(jī)制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 青狗尾草RNAi途徑相關(guān)基因的鑒定

    青狗尾草基因組下載自Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。利用已知的谷子RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列作為參考序列[15],在青狗尾草的蛋白質(zhì)序列中做blastp,得到的結(jié)果送至Pfam(https://pfam.xfam.org/)做進(jìn)一步驗(yàn)證。

    1.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位

    將得到的青狗尾草RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列上傳至ExPASy(https://web.expasy.org/protparam/)和BUSCA(http://busca.biocomp.unibo.it/)得到其蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和預(yù)測(cè)的亞細(xì)胞定位。

    1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析、保守結(jié)構(gòu)域和染色體定位

    利用MEGA X(v5.1.1)對(duì)擬南芥、水稻、谷子和青狗尾草的RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)全長(zhǎng)分別構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹,使用Bootstrap 測(cè)試和1 000個(gè)重復(fù)來(lái)評(píng)估每個(gè)節(jié)點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)一致性。

    將青狗尾草的RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列上傳至Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析,得到序列的保守結(jié)構(gòu)域信息。

    根據(jù)青狗尾草和谷子的基因組信息,利用在線軟件MapGene2Chrom(http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/)定位青狗尾草和谷子的RNAi 途徑相關(guān)基因的染色體位置。

    1.4 Ka/Ks和跨膜結(jié)構(gòu)分析

    利用TBtools(v1.082)分析青狗尾草和谷子的RNAi 途徑相關(guān)基因的CDS 序列的Ka/Ks[19]。

    1.5 轉(zhuǎn)錄組分析

    青狗尾草和谷子的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)下載自Phytozome(PRJNA633601,SRX116346-SRX116357)[18,20]。

    2 結(jié)果

    2.1 青狗尾草RNAi途徑相關(guān)基因的全基因組鑒定、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位

    為了鑒定出青狗尾草RNAi 途徑相關(guān)基因,利用已知的谷子AGO、DCL 和RDR 蛋白質(zhì)序列在青狗尾草中進(jìn)行同源探尋,并鑒定保守結(jié)構(gòu)域。每個(gè)谷子AGO、DCL 和RDR 蛋白質(zhì)均能在青狗尾草基因組中找到同源蛋白。結(jié)果共得到青狗尾草的13 個(gè)AGO、7 個(gè)DCL 和4 個(gè)RDR 蛋白質(zhì)序列,它們與谷子同源蛋白的相似度在95%-100%之間(表1),蛋白質(zhì)長(zhǎng)度在313(SvDCL1b)-1 933(SvDCL1a)氨基酸之間,相對(duì)分子質(zhì)量在35 044.76(SvDCL1b)-216 220.21(SvDCL1a)Mw/Da 之間,理論等電點(diǎn)5.01(SvDCL1b)-9.55(SvAGO1c) 之間。此外,SvDCL1b(38.74)、SvDCL1c(29.3)、SvAGO2(38.85)和SvRDR1(39.69)的不穩(wěn)定指數(shù)小于40,說(shuō)明其為穩(wěn)定蛋白,其余為不穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示SvDCL3b 和SvAGO1b 被定位在細(xì)胞間隙;SvMEL1 定位在葉綠體類囊體腔;SvRDR2 定位在葉綠體類囊體膜,其余均定位在細(xì)胞核中,說(shuō)明同一家族的不同成員可能在不同細(xì)胞組分內(nèi)發(fā)揮作用(表2)。

    表1 青狗尾草與谷子的基因序列信息Table 1 Gene sequence information of S.viridis and S.italica

    表2 青狗尾草的蛋白質(zhì)序列信息Table 2 Protein sequence information of S.viridis

    2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

    為了了解青狗尾草RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,利用3 個(gè)單子葉植物水稻、谷子和青狗尾草(O.sativa,S.italica,S.viridis)和一個(gè)雙子葉植物擬南芥(A.thaliana)共94 個(gè)RNAi 途徑相關(guān)基因的蛋白質(zhì)序列繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。13 個(gè)SvAGO 家族蛋白被分成6 個(gè)亞組(AGO1,AGO2/7,AGO4/16,AGO10,AGO12/13/14,AGO18)。其中SvPNH1 在AGO10 亞組;SvMEL 在AGO12/13/14亞組;SvSHL4 在AGO2/7 亞組。AGO18 為禾本科植物特有的一類AGO 蛋白,被單獨(dú)分為一組。7個(gè)SvDCL 家族蛋白被分成4 個(gè)亞組(DCL1,DCL2,DCL3,DCL4)。其中SvSHO1 分到DCL4 亞組中。4個(gè)SvRDR 家族蛋白被分成4 個(gè)亞組(RDR1,RDR2,RDR3,RDR6)。其中SvSHL2 與RDR6 分到一組。作為谷子的野生近緣種,青狗尾草的蛋白質(zhì)序列與谷子的同源蛋白質(zhì)親緣關(guān)系最近,因而在同一亞組中它們總是聚在一起的,其次是水稻,外類群雙子葉植物擬南芥的蛋白質(zhì)序列總會(huì)單獨(dú)聚在一起。

    圖1 擬南芥、水稻、谷子和青狗尾草的蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Protein phylogenetic tree of A.thaliana,O.sativa,S.italica and S.viridis

    2.3 基因結(jié)構(gòu)的比較分析

    為了初步了解這些基因在青狗尾草和谷子之間的進(jìn)化關(guān)系,對(duì)青狗尾草和谷子RNAi 途徑相關(guān)同源基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了比較分析(圖2)。研究發(fā)現(xiàn),雖然大部分基因在青狗尾草和谷子中的結(jié)構(gòu)相似度很高,但有兩個(gè)基因AGO1b和RDR3在青狗尾草和谷子間有明顯差異。具體表現(xiàn)為,SiAGO1b比SvAGO1b的第一個(gè)外顯子內(nèi)插入了一個(gè)6 974 bp 的內(nèi)含子序列;SiRDR3與SvRDR3相比,SiRDR3的基因結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜,其在5 176-31 746 bp 多了11 個(gè)內(nèi)含子和外顯子,導(dǎo)致編碼的蛋白質(zhì)更長(zhǎng)。結(jié)構(gòu)差異必然會(huì)導(dǎo)致功能差異,因此,在后續(xù)分析中我們對(duì)這兩對(duì)基因進(jìn)行了深入分析。

    圖2 青狗尾草(A)和谷子(B)的基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of S.viridis(A)and S.italica(B)

    2.4 保守結(jié)構(gòu)域分析

    本研究進(jìn)一步分析了青狗尾草AGO、DCL、RDR 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域,并將青狗尾草與課題組前期已報(bào)道的谷子同源蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比較(圖3)[15]。研究表明,青狗尾草的AGO 家族中,全部AGO 家族成員都帶有ArgoN(PF16486)結(jié)構(gòu)域、ArgoL1(PF08699)結(jié)構(gòu)域、PAZ(PF02170)結(jié)構(gòu)域和Piwi(PF02171)結(jié)構(gòu)域,此外SvAGO1b/SiAGO1b 和SvAGO1d/SiAGO1d 帶有Gly-rich_Ago1(PF12764)結(jié)構(gòu)域,個(gè)別成員還帶有ArgoMid(PF16487)結(jié)構(gòu)域。除了SvSHL4/SiSHL4,其他AGO 成員還帶有ArgoL2(PF16488) 結(jié)構(gòu)域。說(shuō)明AGO 家族蛋白功能較為保守,且各成員之間功能可能相同或相似。與SiAGO12/14/18 相比,SvAGO12/14/18 的AgoN 結(jié)構(gòu)域較短可能不完整,且功能可能受損。而SiAGO12/14/18 具有更加完整的AgoN 結(jié)構(gòu)域,意味著它們具有完整的AGO 蛋白的功能。

    在DCL 家族中,DCL1a、DCL3a、DCL3b 和SHO1 具有相似的結(jié)構(gòu)域(圖3),包括Helicase_C(PF00271)結(jié)構(gòu)域、Dicer_dimer(PF03368)結(jié)構(gòu)域、PAZ 結(jié)構(gòu)域和Ribonuclease_3/3_3(PF00636)結(jié)構(gòu)域。另外,SvDCL1a/SiDCL1a 和SvDCL3a/SiDCL3a和SiDCL3b 還帶有Res Ⅲ(PF04851)結(jié)構(gòu)域,而SvDCL3b 不帶有Res Ⅲ結(jié)構(gòu)域。青狗尾草和谷子的DCL1a 和SHO1 帶有dsrm(PF00035) 結(jié)構(gòu)域和DND1_DSRM(PF14709) 結(jié)構(gòu)域。但是,青狗尾草和谷子的DCL1b 和DCL1c 蛋白質(zhì)喪失了大部分DCL 蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域,只包含一個(gè)Ribonuclease_3_3 結(jié)構(gòu)域,以及一個(gè)dsrm 結(jié)構(gòu)域或DND1_DSRM 結(jié)構(gòu)域。

    RDR 家族蛋白都包含一個(gè)RdRP(PF05183)結(jié)構(gòu)域(圖3)。但相較于其他青狗尾草RDR 蛋白,SvRDR3 的RdRP 結(jié)構(gòu)域較短,表明SvRDR3 的功能可能受損,無(wú)法正常結(jié)合和復(fù)制單鏈RNA。不同于青狗尾草的是在谷子RDR 蛋白中,SiRDR3 的RdRP結(jié)構(gòu)域更長(zhǎng),可能發(fā)揮正常的RDR 蛋白的功能。

    圖3 青狗尾草和谷子的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved protein domains of S.viridis and S.italica

    2.5 染色體定位

    為了探明青狗尾草到谷子馴化過(guò)程中,RNAi 途徑相關(guān)基因在染色體定位是否有變化,我們分別確定了青狗尾草和谷子RNAi 途徑相關(guān)基因在各自染色體上的位置(圖4)。青狗尾草各基因分布在7 條染色體上,與谷子的同源基因在染色體上的位置也基本一致。說(shuō)明在物種分化后,青狗尾草/谷子的自然選擇/馴化過(guò)程中,RNAi 途徑相關(guān)基因的共線性并未發(fā)生明顯改變。

    圖4 谷子和青狗尾草基因的染色體位置Fig.4 Chromosomal locations of genes of S.italica and S.viridis

    2.6 進(jìn)化選擇壓力(Ka/Ks)分析

    為了了解青狗尾草到谷子的馴化過(guò)程是否影響了同源基因的變化,我們計(jì)算了青狗尾草和谷子RNAi 途徑基因之間的Ka/Ks(表3)。DCL1b、AGO16 和PNH1 的Ka/Ks=1,即Ka=Ks,說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化上受中性選擇。AGO1b 的Ka>Ks,即Ka/Ks>1,說(shuō)明SvAGO1b到SiAGO1b進(jìn)化過(guò)程中受到正向選擇,說(shuō)明這個(gè)基因在青狗尾草與谷子分化過(guò)程中具有重要作用,可能對(duì)物種的形成有影響。其余基因均為Ka

    表3 青狗尾草和谷子的Ka/KsTable 3 Ka/Ks of S.viridis and S.italica

    進(jìn)一步對(duì)SvAGO1b和SiAGO1b的序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)在SvAGO1b 蛋白質(zhì)的N 端存在一個(gè)22 nt的信號(hào)肽結(jié)構(gòu),而在SiAGO1b 中則不存在這種結(jié)構(gòu)。說(shuō)明在青狗尾草/谷子的自然選擇/馴化過(guò)程中,AGO1b 的N 端的結(jié)構(gòu)可能受到了不同程度的選擇壓力。

    2.7 基因表達(dá)分析

    基因結(jié)構(gòu)和功能域的變化往往預(yù)示著表達(dá)水平的變化。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn),利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),分析了青狗尾草和谷子RNAi 途徑相關(guān)基因在16 種不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同生長(zhǎng)條件下各基因的表達(dá)量(圖5)。在青狗尾草的AGO 家族中,除了SvAGO1b/c、SvAGO4b和SvPNH1,其余多數(shù)AGO 成員表達(dá)量則較低。SvAGO1b的表達(dá)水平普遍高于SvAGO1c,而SvAGO1d則幾乎不表達(dá)。具體表現(xiàn)為,SvAGO1b在6 天齡的芽、葉片、不同處理?xiàng)l件下的根和紅光處理的地上部分中均有著較高的表達(dá)水平(TPM>40);SvAGO1c在6 天齡的芽、藍(lán)光、黑暗和遠(yuǎn)紅光處理的地上組織中表達(dá)水平較高(TPM>40)。表明SvAGO1b在多數(shù)生長(zhǎng)發(fā)育階段可能發(fā)揮著重要作用,尤其在葉片和不同處理下的根中;SvAGO1c響應(yīng)光變化,在功能上可能與SvAGO1b有著一定差異;SvAGO1d則可能不發(fā)揮作用或在特定時(shí)期發(fā)揮功能。SvAGO4b則在6 天齡的芽、10 天齡的根、藍(lán)光、黑暗和遠(yuǎn)紅光處理的地上組織中表達(dá)量較高(TPM>40),且SvAGO4b的表達(dá)水平均略高于SvAGO4a,不同于前者的是SvAGO4a與SvAGO4b在不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

    圖5 青狗尾草和谷子RNAi 相關(guān)基因組織特異性表達(dá)分析Fig.5 Tissue-specific expression analysis of RNAi-related genes in S.viridis and S.italica

    青狗尾草的DCL 家族中,SvDCL1a在光處理下有著較高的表達(dá)水平,并在暗處理下的地上組織中表達(dá)量最高(TPM=64.46)。表明在地上組織中,DCL 家族的SvDCL1a可能發(fā)揮主要作用,其他成員則可能存在著時(shí)空特異性表達(dá)。此外,相比于不同處理,SvDCL2僅在暗處理和遠(yuǎn)紅光處理下的地上部分中有較高的表達(dá)水平(TPM=101.89),表明SvDCL2可能是潛在的光響應(yīng)基因。其他DCL 成員則表達(dá)量較低或幾乎不表達(dá)(TPM<20)。

    青狗尾草的RDR 家族中,整體表達(dá)水平也較低,但相比于不同處理,SvRDR1在暗處理的地上部分中表達(dá)量相對(duì)較高(TPM=31.34)。此外,SvRDR2在不同組織、不同處理?xiàng)l件下的表達(dá)量則略高于SvRDR3。結(jié)果表明,青狗尾草RDR 家族成員的表達(dá)模式基本一致,但在葉中幾乎不表達(dá)。不同于青狗尾草,SiRDR3在6 天齡的芽和不同光處理的地上組織中表達(dá)量較高。說(shuō)明青狗尾草RDR 家族蛋白功能類似,SvRDR1可能在根中和暗處理的地上部分發(fā)揮著主要作用,且SvRDR3和SiRDR3在功能上可能有分化。

    我們通過(guò)比對(duì)SvAGO1b和SiAGO1b的表達(dá)量,分析N 端的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的差異是否對(duì)AGO1b 的轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生了影響。發(fā)現(xiàn)在多數(shù)時(shí)期和處理下,SiAGO1b和SvAGO1b的表達(dá)模式相似。說(shuō)明N 端的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)的有無(wú)幾乎不影響AGO1b 的跨膜能力及其功能。

    可以看出,除RDR3 外的青狗尾草和谷子的RNAi 途徑相關(guān)基因在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期下各基因的表達(dá)模式基本一致,且基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域存在差異的同源基因間表達(dá)水平也沒有發(fā)生明顯的變化,說(shuō)明在青狗尾草和谷子中,RNAi 途徑相關(guān)基因行駛的功能相對(duì)重要和穩(wěn)定,自然選擇和馴化過(guò)程并沒有使其結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生大的變化,因而其表達(dá)水平也相對(duì)穩(wěn)定。

    3 討論

    馴化是人類最偉大的發(fā)明之一,馴化可以使野生物種在強(qiáng)大的人工選擇壓力下獲得對(duì)人類有利的優(yōu)良性狀變成栽培/家養(yǎng)品種[21]。人類對(duì)農(nóng)作物的馴化歷史悠久,例如9 000年前野生水稻被馴化為栽培稻[22],8 000年前野生棉被馴化成為栽培棉[23]。又有大芻草馴化成玉米[24],野生大豆馴化成栽培大豆[25],萵苣馴化成生菜等[26]。自青狗尾草和谷子基因組信息公布以來(lái),越來(lái)越多的研究集中于青狗尾草到谷子的馴化過(guò)程的分子機(jī)制。因此,研究青狗尾草基因組中表觀遺傳修飾相關(guān)基因家族的序列和結(jié)構(gòu)特征及其表達(dá)水平,并與谷子同源基因進(jìn)行進(jìn)化比較分析,將有助于加深理解表觀遺傳修飾在青狗尾草和谷子馴化過(guò)程中的功能和作用。

    表觀遺傳學(xué)中的 RNAi 途徑在DNA 甲基化[2,27]、轉(zhuǎn)錄后沉默[13,28]、抵抗病原微生物入侵[29-30]和調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育[31-33]等方面發(fā)揮重要作用。本研究利用同源比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域探尋方法在青狗尾草全基因組水平鑒定到13 個(gè)AGO、7 個(gè)DCL 和4 個(gè)RDR 蛋白。它們與谷子同源蛋白的相似度在95%-100%之間,說(shuō)明在馴化或進(jìn)化過(guò)程中青狗尾草和谷子的這些同源基因間是保守和穩(wěn)定的。進(jìn)一步對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn),在青狗尾草中SvAGO12/14/18、SvDCL3b 和SvRDR3 的蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)與谷子相比有差異。Res Ⅲ和RdRP 結(jié)構(gòu)域分別是DCL 家族和RDR 家族中極其重要的結(jié)構(gòu)域,這些結(jié)構(gòu)域的變化可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的改變。此外,青狗尾草和谷子的DCL1b 和DCL1c 只包含極少的保守結(jié)構(gòu)域,而在水稻中,與OsDCL1a相比,OsDCL1b和OsDCL1c丟失了大部分外顯子及其對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)域,被認(rèn)為是假基因不發(fā)揮功能[14],說(shuō)明DCL1b 和DCL1c 的結(jié)構(gòu)域或功能喪失可能是在禾本科物種中普遍存在的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果顯示,SvAGO1b在葉片和不同處理下的根中發(fā)揮著重要作用,其中TPM 值最高可達(dá)103.75;SvAGO1c在不同光處理下的地上組織樣品中表達(dá)量較高,SvDCL1a在葉片中和光處理下地上組織中表達(dá)量較高,且SvRDR1在多數(shù)處理下的根組織中和暗處理的地上組織中表達(dá)量相對(duì)較高,而各家族的其他成員表達(dá)量較低或幾乎不表達(dá),暗示各家族僅需要個(gè)別成員表達(dá)以發(fā)揮主要作用,其他成員則低表達(dá)作為補(bǔ)充,或與時(shí)空性表達(dá)有關(guān)。我們發(fā)現(xiàn),SvAGO1b和SvRDR1在根中表達(dá)量相對(duì)較高,暗示其在青狗尾草應(yīng)對(duì)土壤微生物是可能發(fā)揮重要作用。此外,我們的研究結(jié)果還表明,除RDR3 外各同源基因在青狗尾草和谷子中表達(dá)模式相似,說(shuō)明谷子在馴化過(guò)程中,其各同源基因在功能上與青狗尾草相比未發(fā)生明顯分歧。

    4 結(jié)論

    本研究利用比較基因組學(xué)在青狗尾草中鑒定到13 個(gè)AGO 蛋白、7 個(gè)DCL 蛋白和4 個(gè)RDR 蛋白。SvDCL3b 和SvRDR3 的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域有缺失。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),SvAGO1b、SvDCL1a和SvRDR1在各家族中表達(dá)量較高。

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