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    AtERF49在擬南芥應(yīng)答鹽堿脅迫中的作用

    2023-02-02 06:46:40阮航多浩源范文艷呂清晗姜述君朱生偉
    生物技術(shù)通報 2023年1期
    關(guān)鍵詞:鹽堿突變體擬南芥

    阮航 多浩源 范文艷 呂清晗 姜述君 朱生偉

    (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院,大慶 163316;2.中國科學(xué)院植物研究所植物分子生理學(xué)重點(diǎn)實驗室,北京 100093)

    土壤鹽堿化是影響植物生長、產(chǎn)量和品質(zhì)的主要環(huán)境條件之一[1]。據(jù)聯(lián)合國教科文組織(UNESCO)和糧農(nóng)組織(FAO)的不完全統(tǒng)計,世界上大約有9.5×109km2的鹽堿地,其中我國占9.9×106km2,土壤鹽堿化造成生態(tài)環(huán)境惡化,嚴(yán)重威脅我國糧食生產(chǎn)安全[2]。為了適應(yīng)土壤鹽堿脅迫,植物會通過改變抗逆相關(guān)基因表達(dá)以及自身的生理生化等響應(yīng)逆境脅迫[3]。

    植物AP2/ERF(APELATA2/ethylene response factors)轉(zhuǎn)錄因子家族,在植物生長發(fā)育及其非生物逆境脅迫響應(yīng)過程中具有重要作用[4-5]。擬南芥(Arabidopsis thaliana)中含有147 個成員,根據(jù)其蛋白結(jié)構(gòu),將AP2/ERF 家族分為5 組,即AP2 亞家族、RAV 亞家族、CBF/DREB 亞家族、ERF 亞家族以及一個特異蛋白AL079349[6]。研究表明,一些ERFs參與植物對干旱、高鹽以及滲透等脅迫的響應(yīng)過程。過表達(dá)RAP2.2(RELATED TO AP2 2)、RAP2.3和RAP2.12(RAPs)可以增強(qiáng)擬南芥對脫落酸(ABA)的敏感性和缺氧、氧化以及滲透脅迫的耐受性[7]。過表達(dá)EIN3(ETHYLENEINSENSITIVE3)和ESE1促進(jìn)鹽反應(yīng)基因表達(dá),提高植物對鹽脅迫抗性[8]。過表達(dá)TSRF1通過調(diào)節(jié)脅迫響應(yīng)基因的表達(dá),提高水稻的滲透和耐旱性[9]。DREB 亞家族轉(zhuǎn)錄因子受干旱、低溫和鹽等脅迫因子誘導(dǎo)表達(dá),參與植物對非生物脅迫響應(yīng)過程。如過表達(dá)AtDREB1A和OsDREB1A可增強(qiáng)擬南芥對冷凍和脫水耐受性[10-11]。在油菜中,過表達(dá)BNCBF/DREB1可增加淀粉和蔗糖生物合成酶含量,提高植株對冷脅迫的抗性[12]。

    在擬南芥中,AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子家族主要集中于對干旱、高鹽等脅迫的研究,對鹽堿脅迫研究尚未見報道。AP2/ERF 轉(zhuǎn)錄因子可參與水楊酸、茉莉酸和脫落酸等多種激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其中AtERF49 可能是逆境信號交叉途徑中的關(guān)鍵連接因子(未發(fā)表)。AtERF49(AT1G75490)屬于DREB亞家族中A-2 亞組[13]。AtERF49只有1 個外顯子,編碼206 個氨基酸,其蛋白含有一個保守AP2 結(jié)構(gòu)和一個CMIV-1 結(jié)構(gòu)域。

    本研究以擬南芥為材料,對其進(jìn)行混合鹽堿脅迫處理,利用熒光定量PCR 技術(shù)對AtERF49基因的基本特性、鹽堿脅迫及光合響應(yīng)基因表達(dá)模式等進(jìn)行分析,并進(jìn)行葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定,研究AtERF49在植物對鹽堿脅迫應(yīng)答過程中的功能,以期為深入解析AtERF49參與植物抗鹽堿脅迫分子機(jī)理提供基礎(chǔ)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗所用到的擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)材料為生態(tài)型Col-0、過表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因材料(AtERF49OX-11、AtERF49OX-39)和CRISPR/Cas9突變體CR-erf49材料(erf49-6、erf49-4)。種植條件為22℃,光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗。

    1.2 方法

    1.2.1 轉(zhuǎn)基因AtERF49擬南芥鹽堿脅迫處理 將在1/2 MS 培養(yǎng)基上生長1 周齡的Col-0、過表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因材料、CR-erf49突變體,移栽到8 cm×8 cm 方盒(土∶蛭石=3∶1)中,待長到7-8 片葉子時,進(jìn)行鹽堿脅迫處理。處理組用150 mmol/L 混合鹽堿(摩爾比NaHCO3∶Na2CO3=9∶1)溶液進(jìn)行處理,用水作為對照組,每3 d 澆灌一次。

    1.2.2 抗逆基因、光合相關(guān)基因的RT-qPCR 檢測 將生長16 d 的擬南芥材料經(jīng)鹽堿脅迫處理0、1和6 h 取樣,采用聚合美試劑盒(MF045-05)進(jìn)行RNA 提取,參照HiScript? Reverse Transcriptase 說明書(Vazyme 公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR,按照諾唯贊Q111 說明書,以AtUBC30為內(nèi)參,用RT-qPCR方法檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥中RAB18和RD29A以及光合相關(guān)基因rbcl和psaA的表達(dá)量。RT-qPCR 的引物見表1。

    表1 熒光定量PCR AtERF49 所用引物Table 1 Primers used for fluorescence quantitative PCR

    1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 擬南芥生長16 d 時進(jìn)行鹽堿脅迫處理,處理11 d 后,暗處理20 min,利用葉綠素?zé)晒?成像-氣體交換同步測量系統(tǒng)(GFS-DUAL)測定暗適應(yīng)后植株葉片光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(qN)、光系統(tǒng)II 實際量子產(chǎn)能Y(II)和能量耗散的量子產(chǎn)能(NO)。每個處理重復(fù)4 次,每次測定7 株。

    1.2.4 統(tǒng)計分析 使用GraphPad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行雙因素方差分析及差異顯著性檢驗(Two-way ANOVA)。

    2 結(jié)果

    2.1 鹽堿脅迫促進(jìn)AtERF49的表達(dá)

    在Col-0 生長至16 d 時,經(jīng)150 mmol/L 鹽堿溶液處理0、1、3 和6 h 后,檢測擬南芥葉片中AtERF49的表達(dá)情況(圖1)。以AtUBC30為內(nèi)參,鹽堿脅迫處理后,AtERF49的表達(dá)量上升,在3 h時達(dá)到最高(25 倍),6 h 后,表達(dá)量急劇降低,下降97.4%,表明鹽堿脅迫可快速誘導(dǎo)AtERF49表達(dá)。

    圖1 鹽堿脅迫下AtERF49 表達(dá)量分析Fig.1 Analysis of AtERF49 expression under Saline-alkali stress

    2.2 過表達(dá)AtERF49增加植物對鹽堿的抗性

    選取生長4 周齡的轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片,利用RT-qPCR 方法檢測AtERF49的表達(dá)水平。結(jié)果表明,過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株AtERF49-OX中AtEFR49的表達(dá)量均高于Col-0(2-4 倍),而erf49突變體中AtERF49的表達(dá)量低于Col-0(圖2-B)。在正常條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0 在葉片大小和顏色上無明顯的區(qū)別(圖2-A);鹽堿脅迫處理后,Col-0 和erf49突變體植株葉片出現(xiàn)萎蔫和黃化,嚴(yán)重者葉片死亡,而過表達(dá)AtERF49轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)少許黃化(圖2-A)。過表達(dá)AtERF49增強(qiáng)植株對鹽堿脅迫的抗性,而erf49突變體植株對鹽堿脅迫更加敏感,表明AtERF49正向調(diào)控植物對鹽堿脅迫的響應(yīng)

    圖2 過表達(dá)AtERF49 增強(qiáng)擬南芥對鹽堿脅迫的抗性Fig.2 Overexpression of AtERF49 gene increasing Arabidopsis resistance to Saline-alkali stress

    2.3 過表達(dá)AtERF49增加下游相應(yīng)基因的表達(dá)

    為了探究過表達(dá)AtERF49增強(qiáng)擬南芥抗鹽堿脅迫的機(jī)理,利用RT-qPCR 檢測抗逆響應(yīng)相關(guān)基因RD29A和RAB18的表達(dá)。結(jié)果表明,在鹽堿溶液處理前(0 h),Col-0、AtERF49- OX 以及erf49中RD29A和RAB18的表達(dá)量有明顯的差別,均高于Col-0。鹽堿處理1 h 后,過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株中RD29A和RAB18的表達(dá)水平提高,且極顯著高于Col-0,其中,RAB18的表達(dá)量為Col-0 的2-3 倍(圖3-A),RD29A的表達(dá)量上調(diào)6-10 倍(圖3-B),而erf49突變體中AtERF49的表達(dá)量較Col-0 顯著降低,其中,RAB18的表達(dá)量降低62%-66%(圖3-A),RD29A的表達(dá)量降低29%(圖3-B)。

    圖3 轉(zhuǎn)基因AtERF49 植株中RAB18(A)和RD29A(B)的表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of RAB18(A)and RD29A(B)in AtERF49 transgenic lines

    2.4 鹽堿脅迫下,AtERF49對擬南芥葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

    過表達(dá)AtERF49增強(qiáng)擬南芥抗鹽堿脅迫的能力,葉片黃化表型較輕(圖2-A),推測其可能影響葉片光合作用能力和光合電子傳遞速率。對轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0 的葉綠素?zé)晒鈪?shù)qP、qN、Y(II)和NO 進(jìn)行檢測。結(jié)果表明,鹽堿脅迫處理前,轉(zhuǎn)基因擬南芥和Col-0 植株的qP、qN、Y(II)和NO 均無差異。鹽堿溶液處理后,erf49突變體植株的Y(II)和qP 均低于Col-0,NO 和qN 均高于Col-0(圖4-B和圖4-C);而AtERF49-OX植株在處理之后,Y(II)和qP 均顯著高于Col-0,NO 和qN 均顯著低于Col-0(圖4-A 和圖4-D)。表明鹽堿脅迫下,erf49突變體植株光損傷程度較嚴(yán)重,PSII 反應(yīng)中心的開放程度降低,ERF49 可能影響光系統(tǒng)II 反應(yīng)中心光化學(xué)反應(yīng)、開放狀態(tài)以及光損傷程度。

    圖4 鹽堿脅迫對轉(zhuǎn)基因AtERF49 擬南芥葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.4 Effects of Saline-alkali stress on the chlorophyll fluorescence parameters of leaves of AtERF49 transgenic Arabidopsis

    2.5 AtERF49調(diào)控光合響應(yīng)基因表達(dá)

    在鹽堿脅迫處理前后,對轉(zhuǎn)基因AtERF49擬南芥蓮座葉光合響應(yīng)基因psaA和rbcL的表達(dá)進(jìn)行分析,結(jié)果(圖5)表明,在正常條件下,psaA、rbcl在AtERF49-OX、erf49和Col-0 中表達(dá)量無明顯差異。在鹽堿脅迫處理下,與Col-0 相比,AtERF49-OX植株中rbcL表達(dá)量顯著增加(4-5 倍),psaA表達(dá)量顯著降低(47%-64%);而psaA、rbcl在erf49突變體植株表達(dá)與AtERF49-OX植株相反。psaA能夠編碼光系統(tǒng)I(PSI)跨膜復(fù)合物的中心蛋白A,其作為原初反應(yīng)中心在光系統(tǒng)I 中起著重要作用,可參與葉綠素分子間的相互作用;rbcL編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)大亞基,調(diào)節(jié)rubisco 的合成和活性,rubisco 的活性與葉片的羧化效率及光合作用呈正相關(guān)。psaA、rbcl在AtERF49-OX、erf49中表達(dá)存在差異,說明ERF49可能通過調(diào)控psaA和rbcL表達(dá)影響植物光合作用電子傳遞和碳同化能力,進(jìn)而影響植物對鹽堿脅迫的抗性。

    圖5 AtERF49 轉(zhuǎn)基因株系中rbcL 和psaA 的表達(dá)Fig.5 Relative expressions of rbcL and psaA in AtERF49 transgenic lines

    3 討論

    AP2/ERF 家族轉(zhuǎn)錄因子作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子參與植物對多種非生物脅迫應(yīng)答過程[14]。植物對鹽堿脅迫應(yīng)答的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),分為ABA 依賴和非依賴兩大調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[15],相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子會隨之調(diào)控不同下游基因的表達(dá)[16],如植物逆境相關(guān)基因RD29A和RAB18。本研究中,在鹽堿脅迫處理1 h 時,AtERF49-OX植株RD29A和RAB18的表達(dá)量顯著上升,而erf49突變體中其表達(dá)量降低。結(jié)合鹽堿處理下植株表型,推測在鹽堿脅迫條件下,AtERF49-OX擬南芥的抗鹽堿脅迫能力提高,可能與ABA 依賴基因RD29A和RAB18的表達(dá)增強(qiáng)密切相關(guān)。

    鹽堿脅迫對植物的影響是多方面的,在影響光合電子傳遞速率的同時也會引發(fā)光合機(jī)構(gòu)的紊亂[17]。Y(II)是光系統(tǒng)II 實際量子產(chǎn)能。本研究中,在鹽堿處理之前,各株系的Y(II)無明顯差異;在鹽堿脅迫處理條件下,erf49突變體Y(II)顯著下降,而AtERF49-OX植株的Y(II)增加,說明鹽堿脅迫下erf49突變體光系統(tǒng)II 反應(yīng)中心失活程度較嚴(yán)重,過表達(dá)株系則表現(xiàn)出強(qiáng)的耐受能力。

    光化學(xué)淬滅(qP)反映PSII 吸收的光能在光化學(xué)反應(yīng)電子傳遞鏈中的份數(shù),在一定程度上反映PSII 反應(yīng)中心的開放程度,要想保持高的光化學(xué)淬滅就要使PSII 反應(yīng)中心處于“開放狀態(tài)”。非光化學(xué)淬滅(qN)反映植物耗散過剩光能為熱的能力[18-19]。本實驗研究結(jié)果表明,在鹽堿脅迫處理前,轉(zhuǎn)基因株系和Col-0 的qP 和qN 值無明顯差異。在脅迫處理后,AtERF49-OX植株的qP 值在上升,qN 值下降;而erf49突變體則與之相反。這就說明erf49突變體遭受鹽堿脅迫之后,天線色素吸收的光能用于光化學(xué)反應(yīng)的份額在減少,主要轉(zhuǎn)化成熱量散失。能量耗散的量子產(chǎn)能(NO)是光損傷的重要指標(biāo),若NO 值越高,則表示受到的光損傷越嚴(yán)重。本研究結(jié)果表明,在鹽堿處理條件下,erf49突變體NO 值上升并顯著高于Col-0,而AtERF49-OX植株NO 值下降,erf49突變體在逆境脅迫下更容易受到光損傷。進(jìn)一步說明過表達(dá)AtERF49基因能有效的減少光損傷,在鹽堿脅迫發(fā)生時還能保持較高的光能利用率。

    psaA和rbcL是葉綠體中重要生物學(xué)功能的基因,psaA能夠編碼光系統(tǒng)I 跨膜復(fù)合物的中心蛋白A,又稱P700 脫輔基蛋白A,其作為原初反應(yīng)中心在光系統(tǒng)I 中起著重要作用,可能參與結(jié)合中間電子傳遞體Fx,也可能參與了與葉綠素分子的相互作用[20];rbcL基因編碼核酮糖1,5 二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1,5-bishosphate carboxylase/oxygenase,rubisco)大亞基,調(diào)節(jié)rubisco 的合成和活性,rubisco 在光合作用的暗反應(yīng)中起重要作用,負(fù)責(zé)碳同化又引發(fā)光呼吸,其活性與葉片的羧化效率及光合作用呈正相關(guān)[21-22]。鹽堿處理前,轉(zhuǎn)基因株系和Col-0 中psaA和rbcL的表達(dá)量無明顯差異。在鹽堿處理后二者基因表達(dá)量發(fā)生變化,AtERF49-OX植株的rbcL表達(dá)量上升并顯著高于Col-0,psaA表達(dá)量顯著下降,erf49突變體株系與之相反。erf49突變體psaA表達(dá)量在鹽堿脅迫處理后上升,而AtERF49-OX植株psaA表達(dá)量下降,這可能是因為在鹽堿脅迫條件下,光系統(tǒng)I 跨膜復(fù)合物中心蛋白A 穩(wěn)定性有關(guān)[23]。有研究表明蟲黃藻psbA和psaA轉(zhuǎn)錄水平的主動降低對抵抗熱應(yīng)激具有積極作用[24],可能與鹽堿脅迫中機(jī)制是不同的,還需進(jìn)一步研究。非生物脅迫可導(dǎo)致植物的rubisco 酶活性降低[25],本研究中,erf49突變體的rbcL表達(dá)量在鹽堿脅迫處理之后下降,可能是鹽堿脅迫導(dǎo)致rubisco 合成的轉(zhuǎn)錄過程和轉(zhuǎn)錄后翻譯表達(dá)受到抑制,使rubisco 合成受阻,從而影響暗反應(yīng)中的碳同化和葉片的羧化效率,造成葉片黃化。

    4 結(jié)論

    鹽堿脅迫下,AtERF49 通過調(diào)控逆境脅迫相關(guān)基因RAB18和RD29A的表達(dá)以及對植物葉片光合作用相關(guān)基因(psaA和rbcL)及電子傳遞等影響,參與植物對鹽堿脅迫的響應(yīng)過程。

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