靖宇平貝母浸出物通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群失調(diào)緩解DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎

張 彤，李 玥，楊 霞，白 冰，李一權(quán)，房金波，韓繼成，李 霄，金寧一，朱羿龍，朱光澤

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省院士工作站，長(zhǎng)春 130117）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性腸炎炎癥性疾病，其病因尚不明確?，F(xiàn)已知炎癥損傷和腸道菌群失調(diào)對(duì)UC的發(fā)生發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用[1-2]。在UC的發(fā)展過(guò)程中，異?；罨难装Y信號(hào)通路會(huì)分泌大量的促炎因子，這些促炎因子能夠聚集于受損的腸組織[3-4]，并持續(xù)性損傷腸黏膜導(dǎo)致腸黏膜屏障減弱[5]，進(jìn)而使得相關(guān)腸道微生物侵入腸黏膜[6]。在絕大多數(shù)UC患者受損的結(jié)腸粘膜樣本中都發(fā)現(xiàn)了腸道微生物[7]，這些微生物代謝產(chǎn)物中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠激活toll樣受體以調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而激活相應(yīng)的促炎反應(yīng)以加劇炎癥損傷[8-9]。因此，腸道菌群失調(diào)會(huì)促進(jìn)炎癥損傷加劇UC患者的病程，甚至可能會(huì)誘發(fā)癌變[10-11]。總之，腸道菌群失調(diào)對(duì)UC患者的病程進(jìn)展與康復(fù)速度有著重要的影響。

平貝母是百合科貝母屬多年生草本植物，其干燥鱗莖具有止咳化痰、潤(rùn)肺散結(jié)的功效，主產(chǎn)于遼寧、吉林和黑龍江。平貝母中含有多種活性成分，包括生物堿類、生物堿苷、腺苷類和多糖類等，其中異甾體生物堿是其主要的生物活性成分[12]，具有止咳[13]、祛痰[14]、抗腫瘤[15]、抗炎[16]、抗菌和抗?jié)僛13]等功效。貝母屬異甾體生物堿具備的抗炎、抗菌和抗?jié)兓钚钥赡苁蛊涑蔀轭A(yù)防或治療潰瘍性結(jié)腸炎的潛在藥物。平貝母作為吉林省道地藥材，以靖宇平貝母的質(zhì)量最佳。因此，本研究以靖宇平貝母浸出物作為研究目標(biāo)，通過(guò)探討其對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠癥狀及腸道菌群的影響，明確靖宇平貝母浸出物抗?jié)冃越Y(jié)腸炎效果，并分析其引起的腸道菌群變化在抗?jié)冃越Y(jié)腸炎上所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量22～24 g，由斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)碼：SCXK（京）2019-0010。

1.2 試劑

靖宇平貝母浸出物由吉林省鼎信檢測(cè)有限公司提供，浸出物由DMSO溶解，并用玉米油稀釋。葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）（36，000-50，000 M.Wt.）購(gòu)自MP Biomedicals公司；玉米油購(gòu)自MedChemExpress公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、造模與給藥

將雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分成4組，即DSS組、DSS+浸出物組（8 mg·kg-1灌胃）、浸出物組（8 mg·kg-1灌胃）和對(duì)照組，每組8只。每天記錄小鼠疾病活躍指數(shù)（disease activity index，DAI）。15 d后，取各組的腸組織拍照并測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，分離結(jié)腸內(nèi)容物，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。具體實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

1.4 疾病活躍指數(shù)評(píng)分

每天記錄小鼠的疾病活躍指數(shù)，DAI評(píng)分總分=體質(zhì)量下降百分比+糞便黏稠度+糞便潛血，評(píng)分細(xì)則詳見(jiàn)文獻(xiàn)[17]。

1.5 腸組織HE染色

取實(shí)驗(yàn)小鼠腸組織，分離結(jié)腸和盲腸，分別置于4%多聚甲醛組織固定液中，HE染色與腸組織病理學(xué)評(píng)分由武漢賽維爾生物科技有限公司完成。組織病理學(xué)評(píng)分=上皮組織損傷評(píng)分+炎性浸潤(rùn)評(píng)分[18]。

1.6 16S rRNA分析

所有結(jié)腸內(nèi)容物樣品的16S rRNA分析由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，并且以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較均采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靖宇平貝母浸出物抑制模型小鼠體質(zhì)量變化

靖宇平貝母浸出物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量變化影響見(jiàn)圖1。結(jié)果表明在第12天，DSS組和浸出物+DSS組體質(zhì)量出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。從第13天到第15天，浸出物+DSS組體質(zhì)量下降率顯著性低于DSS組（P＜0.05）。從第0天到第15天，浸出物組與對(duì)照組體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這些結(jié)果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性抑制DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量減輕，但對(duì)正常小鼠的體質(zhì)量無(wú)顯著性影響。

2.2 靖宇平貝母浸出物降低模型小鼠DAI評(píng)分

靖宇平貝母浸出物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI評(píng)分變化影響見(jiàn)圖2。結(jié)果表明在第11天，DSS組和浸出物+DSS組DAI評(píng)分出現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)。從第14天到第15天，浸出物+DSS組DAI評(píng)分顯著性低于DSS組（P＜0.05）。從第0天到第15天，浸出物組與對(duì)照組小鼠DAI評(píng)分無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性改善DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠癥狀（如體質(zhì)量損失率、腹瀉、便血等），但對(duì)正常小鼠的DAI評(píng)分無(wú)顯著性影響（P＜0.05）。

圖2 靖宇平貝母浸出物對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠DAI評(píng)分的影響

2.3 靖宇平貝母浸出物抑制模型小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度

靖宇平貝母浸出物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度縮短的抑制效果見(jiàn)圖3，與浸出物+DSS組（5.77±0.64）cm 比 較，DSS組（5.05±0.39）cm結(jié)腸長(zhǎng)度顯著性縮短（P＜0.01），但是浸出物組（8.02±0.24）cm與對(duì)照組（8±0.23）cm結(jié)腸長(zhǎng)度比較無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性抑制DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短，但對(duì)正常小鼠的結(jié)腸長(zhǎng)度無(wú)顯著性影響（P＞0.05）。

圖3 靖宇平貝母浸出物對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度的影響

2.4 靖宇平貝母浸出物減輕模型小鼠腸組織損傷

通過(guò)實(shí)驗(yàn)小鼠結(jié)腸和盲腸HE染色病理分析，靖宇平貝母浸出物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸組織損傷的抑制效果見(jiàn)圖4。DSS組的結(jié)腸組織黏膜層可見(jiàn)大面積潰瘍，腸上皮被破壞，固有層腸腺消失，并伴有大量多量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；浸出物+DSS組的結(jié)腸組織黏膜層可見(jiàn)多處潰瘍，腸上皮被破壞，固有層腺體數(shù)量減少，并伴有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS組結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著性高于浸出物+DSS組（P＜0.001）。DSS組的盲腸組織可見(jiàn)多處潰瘍，腸上皮被破壞，固有層腸腺消失，并伴有部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；浸出物+DSS組的盲腸組織黏膜層可見(jiàn)基礎(chǔ)潰瘍，固有層腸腺數(shù)量減少，并伴有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS組盲腸組織病理學(xué)評(píng)分顯著性高于浸出物+DSS組（P＜0.001）。但浸出物組與對(duì)照組的結(jié)腸或盲腸組織都是皺襞結(jié)構(gòu)清晰，黏膜層腸上皮結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，固有層腸腺數(shù)量豐富等，未見(jiàn)明顯炎癥，且浸出物組結(jié)腸或盲腸組織病理學(xué)評(píng)分與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。這些結(jié)果表明靖宇平貝母浸出物可以顯著性減輕DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸組織損傷和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但對(duì)正常小鼠的腸組織無(wú)顯著性的病理?yè)p傷。

圖4 靖宇平貝母浸出物對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸組織損傷的影響（放大50×和100×）

2.5 靖宇平貝母浸出物改善模型小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)

靖宇平貝母浸出物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響見(jiàn)圖5。其中稀釋性曲線如圖5A所示，測(cè)序量到達(dá)一定數(shù)值后，OUT數(shù)量穩(wěn)定，樣本曲線趨于平穩(wěn)，表明本次實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣本的稀釋性曲線充分反映了樣本的多樣性。通過(guò)Alpha多樣性分析反映腸道菌群的豐富度和多樣性，其中ACE指數(shù)衡量物種豐富度，Shannon指數(shù)衡量物種多樣性。浸出物+DSS組的ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著性高于DSS組（P＜0.05），該結(jié)果表明靖宇平貝母浸出物能夠顯著性增加DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群豐富度和多樣性。

圖5 靖宇平貝母浸出物對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

2.6 靖宇平貝母浸出物影響模型小鼠腸道菌群組成

靖宇平貝母浸出物對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群組成的影響見(jiàn)圖6。在門(mén)類水平上（圖6A）與DSS組比較，DSS+浸出物組Firmcutes相對(duì)豐度顯著性升高（P＜0.000 1），Proteobacteria相對(duì)豐度顯著性降低（P＜0.000 1）。在屬類水平上（圖6B）與DSS組比較，DSS+浸出物組Escherichia和Bacteroides相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05），Parasutterella、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Ruminococcaceae_UCG-014和Faecalibaculum相對(duì)豐度顯著性升高（P＜0.01）。在種類水平上（圖6C）與DSS組比較，DSS+浸出物組Escherichia_coli和Bacteroides_vulgatus相對(duì)豐度顯著性降低（P＜0.0001），F(xiàn)aecali-baculum_rodentium相對(duì)豐度顯著性升高（P＜0.0001）。這些結(jié)果表明靖宇平貝母浸出物能夠改善DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的腸道菌群失調(diào)，具體表現(xiàn)在增加潛在有益菌豐度，降低潛在有害菌豐度。

圖6 靖宇平貝母浸出物對(duì)DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群組成影響

3 討論

越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群組成的變化能夠顯著性影響腸道免疫和UC進(jìn)程[19-20]。腸道黏膜固有層含有大量炎性效應(yīng)細(xì)胞和抑制炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)細(xì)胞，二者都處于高度動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)[21]。然而，腸道菌群組成和多樣性的失調(diào)會(huì)嚴(yán)重影響腸黏膜的炎癥反應(yīng)并打破這種平衡[22]，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜相關(guān)炎癥因子過(guò)度激活造成炎性損傷[23]。因此，腸道菌群失調(diào)引起的長(zhǎng)期或慢性炎癥與UC發(fā)展密切相關(guān)[24]。

正常情況下，UC患者腸黏膜內(nèi)的微生物組成和細(xì)菌總數(shù)會(huì)發(fā)生顯著性變化，且細(xì)菌多樣性明顯減少[25]。與健康個(gè)體相比，UC患者體內(nèi)促炎細(xì)菌顯著性增加，抗炎細(xì)菌顯著性減少[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在UC的發(fā)展過(guò)程Proteobacteria（大多數(shù)為已知致病菌）豐度顯著性升高[27]，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes（可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸調(diào)節(jié)脂代謝、保護(hù)腸黏膜損傷和抑制致病菌生長(zhǎng)）豐度顯著性下降[28-29]。在UC患者的糞便菌群中，一些潛在有害細(xì)菌（如Escherichia-Shigella、Helicobacter、Campylobacter和Fusobacterium）豐度顯著性升高，這些潛在有害菌能夠顯著性影響腸道炎癥和腸上皮細(xì)胞通透性[30]；此外，潛在有益菌Firmicutes成員的數(shù)量顯著性下降，特別是 Ruminococcus bromii、Eubacterium rectale、Roseburia和Akkermansia，這些潛在有益菌可以產(chǎn)生大量具有抗炎作用的丁酸和丙酸鹽[31]。

在本研究中，與DSS組相比，浸出物+DSS組潛在有益菌Parasutterella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Faecalibaculum（Faecalibaculum_rodentium）與潛在有害菌Escherichia（Escherichia_coli）和Bacteroides（Bacteroides_vulgatus）均發(fā)生了顯著性變化。其中Parasutterella能夠產(chǎn)生琥珀酸，細(xì)菌來(lái)源的琥珀酸鹽通過(guò)促進(jìn)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌的定殖，對(duì)宿主產(chǎn)生有益作用[32]。Ruminococcaceae_UCG-014[33]、Lachnospiraceae_NK4A136_group[34]和Faecalibaculum（Faecalibaculum_rodentium）[35]可以通過(guò)產(chǎn)生丁酸鹽來(lái)改善UC；Escherichia（Escherichia_coli）為機(jī)會(huì)致病菌能夠產(chǎn)生LPS來(lái)激活促炎反應(yīng)并增加炎性損傷。Bacteroides（Bacteroides_vulgatus） 被認(rèn)為是致病菌能夠產(chǎn)生Bacteroides_vulgatus蛋白酶來(lái)加劇腸道損傷[36]。靖宇平貝母浸出物可以通過(guò)改善腸道菌群失調(diào)，增加潛在有益菌（Parasutterella、Ruminococcaceae_UCG-014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Faecalibaculum）豐度，降低潛在有害菌（Escherichia和Bacteroides）豐度，來(lái)緩解DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎癥狀，具體表現(xiàn)為體質(zhì)量變化減輕、DAI評(píng)分降低、結(jié)腸縮短長(zhǎng)度。