苗藥五藤膏外敷對膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨SMAD1及血清Jagged1、Jagged2表達(dá)的影響

韓珊 周靜 馬武開 姚血明 申海艷 陳琳 王顏君

(1貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550002；2貴州省骨科醫(yī)院；3貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)又稱膝退行性骨關(guān)節(jié)病，好發(fā)于中老年人群，尤以女性常見，以關(guān)節(jié)軟骨(變性、退化)、關(guān)節(jié)囊增厚、軟骨下骨發(fā)生病理改變(骨質(zhì)增生、滑膜增生等)及關(guān)節(jié)周圍肌肉損傷等為主要特征，臨床主要表現(xiàn)為不同程度的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、畸形及活動受限等〔1〕。目前臨床治療KOA的方式有藥物治療、物理治療、手術(shù)治療等，主要以緩解癥狀為主。苗藥五藤膏作為KOA的外治經(jīng)驗(yàn)方，具有祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛等作用。經(jīng)前期臨床研究顯示，苗藥五藤膏貼敷療效確切，能夠有效緩解KOA患者關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等臨床癥狀〔2～5〕。KOA發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，有研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、Notch信號通路在調(diào)控KOA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖、分化，維持軟骨細(xì)胞表型及軟骨基質(zhì)代謝平衡等方面發(fā)揮著重要作用，其中，SMAD1作為BMP信號通路中BMP2受體的直接下游分子，在BMP2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起中心作用；而Jagged1、Jagged2作為激活Notch信號的關(guān)鍵配體，可以加速早期軟骨細(xì)胞分化，在調(diào)控軟骨方面起著重要作用〔6～9〕。因此，我們在前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證苗藥五藤膏治療KOA是否與其通過調(diào)節(jié)BMP、Notch信號通路中相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)水平，從而減慢KOA關(guān)節(jié)軟骨退變。為驗(yàn)證該假設(shè)，本研究通過建立兔KOA模型，從細(xì)胞及分子水平探討不同劑量苗藥五藤膏于相應(yīng)時(shí)間內(nèi)外敷干預(yù)對KOA模型兔關(guān)節(jié)軟骨SMAD1及血清Jagged1、 Jagged2表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 2019年3～6月選取同一批4～5月齡健康新西蘭大白兔72只，體重(2±0.5)kg，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證號：SCXK(黔)2018-00012。分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行1 w的適應(yīng)期喂養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)過程中遵照實(shí)驗(yàn)動物倫理要求。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 氟比洛芬巴布膏，進(jìn)口藥品注冊證號：H20140693；生產(chǎn)批號：602243-01；生產(chǎn)廠家：日本三笠制藥株式社會；規(guī)格：40 mg/貼。苗藥五藤膏(黑骨藤30 g、大血藤30 g、小花青風(fēng)藤30 g、香血藤30 g和絡(luò)石藤30 g打成細(xì)粉與凡士林按1∶1的比例混合制成)，由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科提供(黔藥制字Z20120072)，使用前將調(diào)制好的苗藥五藤膏均勻涂于紗布上做成貼膏。

1.3主要儀器和試劑 微量移液器(Eppendorf)、磁力攪拌器(T8-1，江蘇省金壇市中大儀器廠)、離心機(jī)(HI650，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)、酶標(biāo)儀(mμlISKANMK3，Thermo)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(ICV-450，日本ASONE)、FlexStation 3多功能酶標(biāo)儀(Flexstation3，Molecular Devices)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，貨號：P0010)、兔多抗SMAD1(52 kD,avivasysbio，貨號：ARP38692-T100)、Jagged1蛋白測定試劑盒(優(yōu)爾生，貨號：SEB807Hu)、Jagged2蛋白測定試劑盒(優(yōu)爾生，貨號：SEL636Hu)、磷酸酶抑制劑(碧云天，貨號：S1873)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BA1054)、Trise-Base(Biofroxx，貨號：1115GR500)、蛋白marker(10～250 kD,海利克思，貨號：P12103-2)。

1.4方法

1.4.1實(shí)驗(yàn)分組與KOA兔模型的制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將72只家兔分為空白組、模型組、巴布膏組、苗藥五藤膏高劑量組、苗藥五藤膏中劑量組、苗藥五藤膏低劑量組各12只。除空白組外，其余五組采用經(jīng)典的木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射方法建立KOA兔模型〔10〕：將4%的木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.3 ml分別于第1、4、7 天注入兔右膝關(guān)節(jié)，第7天注射完畢后，不再進(jìn)行任何干預(yù)。正常飼養(yǎng)4 w后，通過X線片、組織切片觀察兔右膝關(guān)節(jié)，建立穩(wěn)定的KOA兔模型。

1.4.2給藥方法 從造模后第5周開始給藥，具體方法：空白組、模型組正常飼養(yǎng)4 w，每日用無菌紗布包扎固定右膝關(guān)節(jié)4 h，不做任何藥物干預(yù)；巴布膏組給予氟比洛芬巴布膏外敷，將巴布膏(約2 g)剪至4 cm×3 cm大小直接貼敷于兔右膝關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)固定4 h，每日給藥1次，干預(yù)時(shí)間為4 w；苗藥五藤膏低、中、高劑量組分別給予低(約1 g)、中(約2 g)、高(約4 g)劑量的苗藥五藤膏外敷，將苗藥五藤膏(貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院制劑室研制)均勻涂抹于紗布上制成貼膏直接貼敷于兔右膝關(guān)節(jié)前方，關(guān)節(jié)固定4 h，每日給藥1次，干預(yù)時(shí)間為4 w，其中，高劑量組貼膏面積大小為8 cm×3 cm、中劑量組膏貼面積大小為4 cm×3 cm、低劑量組膏貼面積大小為2 cm×3 cm，各治療組家兔藥物使用劑量均為人體等效劑量〔11〕。為了防止藥物掙脫，各治療組均用繃帶包扎固定。給藥4 w后采用空氣栓塞法將其全部處死，剝除右側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚，取右側(cè)股骨內(nèi)髁頂點(diǎn)鈣化層以上軟骨進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.4.3Western印跡檢測蛋白表達(dá) 按照說明書要求，首先完成蛋白樣品的制備，即：在EP管中加入剪碎的軟骨組織、鋼珠及裂解液〔含2 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)、2 μl磷酸酶抑制劑〕進(jìn)行勻漿、裂解、離心，將蛋白樣品〔經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋20倍〕、標(biāo)準(zhǔn)品〔經(jīng)牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋〕及BCA試劑盒中的混合液(A液和B液按50∶1比例混合)依次加入96孔板內(nèi)，37℃避光孵育后，用酶標(biāo)儀(DG-3022A)測定OD值(OD568)，根據(jù)OD值和標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度計(jì)算直線回歸方程及蛋白樣品濃度，最后用BandScan分析膠片灰度值。

1.4.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測 根據(jù)說明書要求，首先完成血清樣本的加樣處理，即：設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔，依次向各孔中加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品(均100 μl)，37℃酶標(biāo)板覆膜孵育1 h，用酶標(biāo)儀測量各孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程及樣品濃度。

1.4.5關(guān)節(jié)軟骨病理學(xué)觀察 取各組兔右側(cè)股骨內(nèi)髁頂點(diǎn)鈣化層以上軟骨制作標(biāo)本，經(jīng)中性甲醛固定，硝酸脫鈣，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察各組病理標(biāo)本形態(tài)變化。軟骨病理改變情況參考Mankin評分〔12〕進(jìn)行評分。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行LSD-t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1病理結(jié)果

2.1.1關(guān)節(jié)軟骨病理圖片觀察 光鏡下可見空白組關(guān)節(jié)面光滑，未見明顯腫脹、增生及滑膜充血，軟骨無退行性改變，軟骨細(xì)胞未變性、萎縮，分布均勻；模型組關(guān)節(jié)面粗糙不平整，明顯腫脹、增生及滑膜充血，軟骨重度退行性改變，軟骨細(xì)胞重度變性、萎縮，分布紊亂；巴布膏組關(guān)節(jié)面不平整，伴有關(guān)節(jié)腫脹和滑膜充血，軟骨輕度退行性改變，軟骨細(xì)胞輕度變性、萎縮，分布輕度紊亂；苗藥五藤膏低、中、高劑量組關(guān)節(jié)表面較光滑，輕度關(guān)節(jié)腫脹和滑膜充血，軟骨退變程度與劑量呈反比，即劑量越低越接近模型組，劑量越高越接近空白組，見圖1。

圖1 各組病理結(jié)果(HE染色，×200)

2.1.2Mankin評分結(jié)果 與空白組相比，模型組及各治療組Mankin評分明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，各治療組Mankin評分均明顯降低(P<0.05)；治療組組內(nèi)比較，Mankin評分從高到低依次分別為苗藥五藤膏低、中劑量組、巴布膏組及苗藥五藤膏高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2各組SMAD1蛋白表達(dá)水平的比較 與空白組相比，模型組及各治療組SMAD1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，苗藥五藤膏中、高劑量組及巴布膏組SMAD1蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)；巴布膏組SMAD1蛋白表達(dá)水平均明顯高于苗藥五藤膏低、中劑量組(P<0.05)，見表1、圖2。

2.3各組血清中Jagged1、Jagged2表達(dá)水平比較 與空白組相比，模型組及苗藥五藤膏各劑量組Jagged1、Jagged2表達(dá)水平均明顯升高(均P<0.05)；與模型組相比，苗藥五藤膏各劑量組、巴布膏組Jagged1、Jagged2表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；與巴布膏組相比，苗藥五藤膏各劑量組Jagged1、Jagged2表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與苗藥五藤膏低劑量組比較，苗藥五藤膏中、高劑量組Jagged1、Jagged2表達(dá)水平明顯降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組Mankin評分、兔軟骨SMAD1蛋白及血清Jagged1、Jagged2表達(dá)水平比較

1～6：空白組、模型組、苗藥五藤膏低劑量組、苗藥五藤膏中劑量組、苗藥五藤膏高劑量組、巴布膏組圖2 干預(yù)4 w后各組關(guān)節(jié)軟骨組織中SMAD1蛋白表達(dá)

3 討 論

膝關(guān)節(jié)軟骨降解、骨贅形成及軟骨損傷等是形成KOA的主要原因，其中軟骨降解主要是由于蛋白裂解酶(基質(zhì)金屬蛋白酶、蛋白聚糖酶等)活性的提高，從而導(dǎo)致Ⅱ型膠原蛋白被降解〔13〕；骨贅則是由肥大的軟骨細(xì)胞引起軟骨局部鈣化所導(dǎo)致〔14〕。BMP、Notch信號通路與KOA的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系〔15,16〕。BMP作為轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β超家族中的一員，是一種多功能生長因子，參與了軟骨細(xì)胞的形成、增殖，正常穩(wěn)態(tài)的維持，骨化階段的終末分化、凋亡及退行性改變等，在軟骨細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，BMP在軟骨損傷后可通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和Ⅱ型膠原表達(dá)來促進(jìn)軟骨修復(fù)與軟骨細(xì)胞表型穩(wěn)態(tài)的維持〔17～19〕。SMAD1在BMP信號通路中起著轉(zhuǎn)導(dǎo)中心的作用〔20〕，即當(dāng)BMP配體與BMPⅠ型受體集合后，BMPⅡ型受體也集合上去，使BMPⅠ型受體磷酸化，進(jìn)而磷酸化下游與BMP特異作用的受體性蛋白SMAD1，從而激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化等〔21〕。研究表明，上調(diào)SMAD1蛋白表達(dá)，可促進(jìn)軟骨下骨再生修復(fù)；下調(diào)SMAD1蛋白表達(dá)，則會加速軟骨細(xì)胞的降解、肥大，從而導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生〔22〕。

Notch信號通路是一條高度保守的信號通路，廣泛存在于無脊椎動物和哺乳動物中，由Notch受體(Notch1、2、 3、4)、配體(Delta-like1、3、4和Jagged1、2)及CSL蛋白等組成；可參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化及凋亡進(jìn)程，在調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖與分化、維持軟骨細(xì)胞的表型及平衡軟骨的基質(zhì)代謝方面發(fā)揮著重要的作用〔23,24〕。Notch信號通路對關(guān)節(jié)炎具有保護(hù)和破壞雙重作用，即持續(xù)激活Notch信號通路會引起早期關(guān)節(jié)炎進(jìn)一步發(fā)展，短暫的激活則能促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成及抑制軟骨的退變〔25〕；然而對于Notch信號通路的激活，研究表明只有當(dāng)Notch受體與配體相結(jié)合時(shí)，Notch信號才能在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡中發(fā)揮調(diào)控作用〔26〕。Jagged1、Jagged2作為激活Notch信號通路的關(guān)鍵配體，在啟動Notch信號通路中扮演著不可或缺的角色，同時(shí)，有研究表明在骨關(guān)節(jié)炎軟骨中Jagged1、Jagged2呈高表達(dá)狀態(tài)〔27〕。

本研究說明，SMAD1蛋白的表達(dá)水平與KOA有很大的相關(guān)性。苗藥五藤膏可通過促進(jìn)軟骨組織中SMAD1蛋白的表達(dá)來抑制KOA的病程進(jìn)展，從而治療KOA；同時(shí)，本研究結(jié)果也進(jìn)一步說明Notch信號通路的下游基因Jagged1、Jagged2的表達(dá)水平與KOA的發(fā)生發(fā)展也有著密切的聯(lián)系。苗藥五藤膏可通過抑制軟骨組織中Jagged1、Jagged2的表達(dá)來抑制KOA的病程進(jìn)展，從而治療KOA且其表達(dá)水平與KOA病程進(jìn)展及軟骨退變程度呈正相關(guān)。