BMP8B對人牙周膜干細胞分化增殖的影響

吳帥楠， 李召寶， 王建琪， 郭香君， 曹素敏， 林秀雅， 褚亞輝

(河北省滄州市中心醫(yī)院口腔門診， 河北 滄州 061000)

牙周炎是一種高度流行的慢性感染性疾病，可造成牙槽骨、牙周膜和牙骨質的損壞，引起牙周附著喪失，牙齦萎縮，最終導致牙齒松動和脫落[1]。牙周炎的治療不僅包括局部炎癥的控制，還包括牙周組織的再生及重建其功能。干細胞療法是通過移植具有特異性修復組織潛能的細胞使有缺陷組織再生的一種方法[2]。人牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)是牙周組織中的一組間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，可分化為牙骨質形成細胞和成骨細胞等，是牙周組織再生的關鍵細胞。因此，研究PDLSCs成骨分化的機制有助于牙周組織再生的治療和研究。骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)是一種生長因子，包括BMP2、BMP3、BMP4、BMP7、BMP8 和 BMP9等多種BMP，在骨誘導和骨維持中有重要作用，其有助于間充質細胞向軟骨細胞和成骨細胞的增殖和分化[3]。BMP8B是其中重要一種，是骨代謝中重要的信號分子，能夠調節(jié)機體的產(chǎn)熱和能量平衡[4]，本研究通過體外分離并培養(yǎng)PDLSCs細胞，并轉染BMP8B，探討B(tài)MP8B沉默或過表達對PDLSCs細胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑：α-MEM培養(yǎng)基(32561037)，美國Gibco公司；總RNA提取試劑盒(AM1830)，美國Thermo Fisher Scientific；L-抗壞血酸(A4403)、β-甘油酸鈉(G9422)、地塞米松(D4902)、逆轉錄試劑盒(5091284001)、十二烷基硫酸鈉(SDS，71725)、茜素紅染色試劑盒(A5533)，美國Sigma-Aldrich；實時熒光定量PCR試劑盒(216213)，德國QIAGEN；兔源一抗BMP8B(P34280)，蘇州百遠生物；Osterix(ab229258)、骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)(ab13420)、Runt相關轉錄因子2(Runt - related transcription factor 2，Runx2)(ab76956)、單抗細胞周期蛋白D1(CyclinD1，ab40754)、周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinases 2，CDK2)(ab32147)、GAPDH(ab181602)、山羊抗兔IgG H&L(ab150079)，英國abcam；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒(C0038)、細胞蛋白提取試劑盒(P0033)、BCA蛋白定量試劑盒(P0012)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒(P0321S)；4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)(C0060)，北京索萊寶；BMP8B、Osx、OCN、Runx2 mRNA、BMP8B-shRNA、BMP8B-shRNA陰性對照、GAPDH，上海吉瑪制藥技術有限公司。熒光倒置顯微鏡，日本Olympus；5424臺式高速離心機，德國Eppendorf；多功能酶標儀、Applied Biosystems PCR儀、蛋白凝膠成像儀，美國Thermo Fisher Scientific。

1.2方 法

1.2.1PDLSCs分離與培養(yǎng)：2019年3月至2019年11月，收集河北省滄州市中心醫(yī)院口腔科的10例需正畸治療患者的第一、第二前磨牙，患者年齡為18～25歲，且無已知的牙周疾病，無吸煙史，無系統(tǒng)性疾病，近6個月無特殊服藥史。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。從牙根中部1/3處分離牙周膜組織，加入I型膠原酶和分散酶II，37℃下消化1h，過濾細胞并獲得PDLSCs單細胞懸液，將細胞加至含有10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換一次培養(yǎng)基，直到細胞從組織塊中長出。當接近90%融合時，進行傳代培養(yǎng)，第三代細胞用于后續(xù)一系列實驗。

1.2.2集落形成試驗：將1000個PDLSCs接種到直徑為10cm的含10%胎牛血清的培養(yǎng)皿中。10d后，用4%多聚甲醛固定細胞，0.1%結晶紫染色，檢測細胞克隆情況，若50個或更多細胞的聚集體被認為是細胞克隆。

1.2.3流式細胞術分析：將第三代PDLSCs培養(yǎng)在含有2%胎牛血清和磷酸鹽的FACS緩沖液中。然后加入以下抗體：MSC陽性混合物(抗CD90-FITC、抗CD105-PerCP-Cy5.5、抗CD73-APC、抗CD44-PE)和PE陰性混合物(抗CD34-PE、抗CD45-PE、抗CD19-PE、抗CD11b-PE、抗HLA-DR-PE)。在此步驟之后，用流式細胞儀檢測標記細胞的信號，并用對數(shù)據(jù)進行分析。

1.2.4PDLSCs細胞的成骨潛能和成脂誘導的檢測：成骨潛能檢測：將密度為2×105個/孔的PDLSCs接種于6孔板中，用成骨誘導培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、50μg/mL維生素C、10 nmoL/L地塞米松、10mmoL/lβ-甘油磷酸酯)進行成骨誘導培養(yǎng)。培養(yǎng)基每3天更換一次。培養(yǎng)28d后，用4%多聚甲醛固定30min，然后用2%茜素紅染色。成脂誘導檢測：在成脂誘導培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、0.2mM消炎痛、2μM地塞米松、0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.01mg/mL胰島素的α-MEM培養(yǎng)基)中培養(yǎng)2×105個PDLSCs/孔。28d后，細胞用油紅O染色并在顯微鏡下觀察。

1.2.5細胞分組及處理：轉染前24h，收集上述1.2.1中對數(shù)期PDLSCs細胞，以1×105個/孔細胞濃度接種至含血清培養(yǎng)基的24孔板中。每孔細胞濃度為2×105個/孔時，更換為不含血清的新鮮培養(yǎng)基，之后進行慢病毒感染，將細胞分為對照組(僅添加新鮮培養(yǎng)基)、陰性轉染組(感染si-NC)、BMP8B沉默組(轉染BMP8B shRNA)和BMP8B過表達組(轉染BMP8B siRNA)，繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.6CCK-8法檢測細胞增殖情況：收集1.2.2中各組細胞，以6×105個/mL的密度接種于96孔板中，用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)3h，用酶標儀測定450nm處的吸光度。

1.2.7ALP活性的檢測：收集1.2.2中各組細胞，以6×105個/mL的密度接種于96孔板中，然后用含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h。然后用PBS洗滌，并用100μL裂解緩沖液(0.2% TritonX100)在冰上孵育2h。收集30μL裂解液進行ALP活性檢測。將30μL裂解液與20μL buffer和50μL底物在96孔板中37℃孵育10min。然后，加入100μL終止液，用酶標儀測定405nm處的吸光度。

1.2.8茜素紅染色法檢測成骨細胞礦化結節(jié)：將各組PDLSCs細胞濃度調整為1×105個/mL接種于6孔板中，細胞融合度達80%時，更換為含10%胎牛血清、抗壞血酸(50μg/mL)、β-甘油酸鈉(10mM)、地塞米松(10nM)誘導培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)21 d，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，95%酒精固定，1%茜素紅染料室溫孵育30min，PBS洗滌，隨機選取6個視野，顯微鏡下觀察細胞，礦化結節(jié)呈亮紅色。400μL 10%的十六烷基吡啶氯化銨加入至10mM磷酸鈉溶液中萃取PSLSCs中的茜素紅染料，使茜素紅染料從細胞質基質中釋放，10min后，560nm處分光光度計測量PSLSCs細胞釋放的茜素紅，并進行定量分析。

1.2.9實時熒光定量聚合酶鏈反應(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測BMP8B、Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達水平：RNA提取試劑盒提取細胞RNA，并進行反轉錄，qRT-PCR擴增。反應條件為預變性 95℃ 60s；變性 95℃ 30s，退火60℃ 45s；延伸72℃ 30s共40個循環(huán)。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算BMP8B、Osterix、OCN、Runx2 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.10蛋白免疫印跡(western blot，WB)法檢測蛋白表達：提取1.2.5中誘導培養(yǎng)的各組細胞總蛋白并進行濃度檢測，蛋白樣品上樣到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳上，電泳結束后印跡到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉；分別加入一抗稀釋液(BMP8B、Osterix、OCN、Runx2、CyclinD1，均為1∶1000稀釋、CDK2為1∶5000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入山羊抗兔IgG H&L二抗稀釋液(1∶2000)，室溫孵育1h，TBST洗膜3次。GAPDH蛋白為內參，蛋白凝膠成像儀分析蛋白表達。

2 結 果

2.1PDLSCs細胞鑒定：顯微鏡下觀察PDLSCs細胞為單核、多邊形或梭形(圖1A)，茜素紅染色結果顯示顯微鏡下可見紅色染色的礦化結節(jié)，證明PDLSCs具有成骨潛能(圖1B)。油紅O染色結果顯示有紅色的脂滴形成，證明PDLSCs具有成脂潛能(圖1C)。此外，克隆形成實驗表明，獲得的細胞具有形成克隆的能力(圖1D，E)。流式細胞儀分析顯示，PDLSCs的MSC標記(CD90、CD44、CD105、CD73)呈陽性表達，而造血標記(CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR)呈陰性表達(圖2)。

圖1 PDLSCs細胞鑒定注：A：PDLSCs的形態(tài)學特征；B：茜素紅染色；C：油紅O染色；D：結晶紫染色；E：PDLSCs的單個克隆的代表性圖像

圖2 PDLSCs的流式結果圖

2.2轉染后各組PDLSCs中BMP8B mRNA的表達：與對照組和陰性轉染組相比，BMP8B沉默組細胞BMP8B mRNA的表達顯著降低(P<0.05)，BMP8B過表達組細胞BMP8B mRNA的表達顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 轉染后各組PDLSCs中BMP8B mRNA的表達(n=9)

2.3BMP8B對PDLSCs細胞增殖的影響：與對照組和陰性轉染組相比，BMP8B沉默組細胞增殖情況顯著降低(P<0.05)，BMP8B過表達組細胞增殖情況顯著升高(P<0.05)。見表3。

表3 BMP8B表達對細胞PDLSCs細胞增殖的影響(n=9)

2.4BMP8B對PDLSCs細胞ALP活性的影響：與對照組和陰性轉染組相比，BMP8B沉默組細胞ALP活性顯著降低(P<0.05)，BMP8B過表達組細胞ALP活性顯著升高(P<0.05)。見表4。

表4 BMP8B對PDLSCs細胞ALP活性的影響(n=9)

2.5BMP8B對PDLSCs細胞鈣化結節(jié)的影響：與對照組和陰性轉染組相比，BMP8B沉默組細胞茜素紅染色程度顯著降低(P<0.05)，BMP8B過表達組細胞茜素紅染色程度顯著升高(P<0.05)。見表5、圖3。

圖3 BMP8B對PDLSCs細胞鈣化結節(jié)的影響注：A：對照組；B：陰性轉染組；C：BMP8B沉默組；D：BMP8B過表達組

表5 BMP8B對PDLSCs細胞鈣化結節(jié)的影響(n=9)

2.6BMP8B對PDLSCs細胞中成骨標記蛋白Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達的影響：與對照組比較和陰性轉染組相比，BMP8B沉默組細胞Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達顯著降低(P<0.05)，BMP8B過表達組細胞Osterix、OCN、Runx2 mRNA表達顯著升高(P<0.05),見表6。

表6 BMP8B對PDLSCs細胞中成骨標記Osterix OCN Runx2 mRNA表達的影響(n=9)

2.7BMP8B對PDLSCs增殖、成骨蛋白表達的影響：與對照組比較和陰性轉染組相比，BMP8B沉默組細胞細胞CyclinD1、CDK2、Osterix、OCN、Runx2蛋白表達顯著降低(P<0.05)，BMP8B過表達組細胞CyclinD1、CDK2、Osterix、OCN、Runx2蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖4、5。

圖4 蛋白相對表達水平的比較注：與對照組比較，*P<0.05；與陰性轉染組比較，#P<0.05

圖5 BMP8B對PDLSCs增殖、成骨相關蛋白表達的影響注：A：對照組；B：陰性轉染組；C：BMP8B沉默組；D：BMP8B過表達組

3 討 論

牙周炎是成人最常見的口腔疾病之一，也是牙齒損壞和掉落的主要原因之一，牙周炎會增加患者患心血管疾病等的風險[5]。其發(fā)病機理主要是由于細菌或其產(chǎn)物聚集在牙根或牙周組織表面，侵入牙周組織導致慢性炎癥，最終引起牙齒脫落。牙周炎治療最終目標是恢復牙周組織的結構和再生功能，應用有利的種子細胞再生受損組織可能是牙周炎治療的有效方法[6]。PDLSCs具有分化為多種細胞類型并進行穩(wěn)健的克隆的自我更新的潛力，在成骨相關激素、細胞因子或其他誘導劑作用下，PDLSCs可分化為骨原細胞、成骨細胞、成骨細胞前體細胞等，被認為是牙周組織再生治療中的潛在干細胞群體。研究與PDLSCs增殖和分化有關的分子機制可能為PDLSCs細胞的成骨分化機制研究提供理論基礎。本研究對PDLSCs細胞進行分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細胞術分析及成骨潛能和成脂誘導的檢測后表明，所分離細胞是PDLSC，具有干細胞特性。

BMP是轉化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)家族成員，最初被鑒定為骨提取物中的骨誘導成分，BMP信號傳導是MSCs細胞成骨分化和骨形成調節(jié)的重要途徑之一[7]，研究發(fā)現(xiàn)TGF-β家族成員BMP2具有促進PDLSCs等細胞成骨分化的作用[8]。增殖是細胞分化的基礎，本研究結果顯示BMP8B過表達能夠促進PDLSCs的增殖，沉默則抑制細胞增殖。ALP在細胞外基質礦化過程中有重要的作用，是成骨細胞成熟的標志物之一[9]。根據(jù)實驗結果進一步顯示，BMP8B沉默或過表達均會影響細胞ALP活性和鈣化程度，表明BMP8B可能與細胞的PDLSCs增殖和成骨分化有關，具體機制有待進一步研究。Runx2、Osterix通常被認為是早期成骨分化的標志，Runx2是MSCs向成骨細胞分化過程中的關鍵轉錄因子，屬于runt結構域基因家族的轉錄因子，參與不同階段成骨細胞分化成熟過程[10]。Runx2通過參與調控成骨細胞分裂周期和ALP、OCN、I型膠原等成骨細胞分化成熟表型標志物的表達并啟動礦化[11]。Osterix是Runx2的下游信號傳導基因，也是是成骨分化過程必不可少的轉錄因子。已有研究發(fā)現(xiàn)，BMP2/Runx2/Osterix信號通路通過參與成骨分化早期階段，促進MSC的成骨分化[12]。OCN是由成骨細胞產(chǎn)生的骨骼中最豐富的蛋白質之一，主要在礦化過程中產(chǎn)生，被認為是成骨細胞成熟的標志[13]。本研究qRT-PCR及WB實驗結果表明沉默BMP8B會降低Osterix、OCN、Runx2表達，BMP8B過表達則促進Osterix、OCN、Runx2水平，提示BMP8B可能通過影響成骨分化過程中相關轉錄因子進而參與成骨細胞分化的過程，具體機制還需進一步的研究。

綜上所述，BMP8B能夠影響PDLSCs細胞增殖和分化，BMP8B可能是成骨分化過程中的必要生物因子之一，是牙周炎治療的潛在研究方向。本研究僅探討了BMP8B沉默或過表達對體外細胞的影響，下一步需結合體內實驗，進一步探討B(tài)MP8B在成骨分化中的可能作用和相關機制。