不同月齡獺兔皮膚組織切片的觀察與研究

趙俊皓，武志鋒，黃衛(wèi)國，王新強(qiáng)，段 偉，李奮軍，王志龍，王全亮

(酒泉市畜牧獸醫(yī)總站，甘肅 酒泉 735000)

皮膚在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和預(yù)防外來物入侵中發(fā)揮著不可替代的作用。就皮毛兩用動物來說，皮毛有著極其重要的經(jīng)濟(jì)價值，為了提高其利用價值，科技工作者對部分常見的皮毛動物的皮膚及毛囊的發(fā)育過程和特點(diǎn)，都進(jìn)行了大量的鉆研，前期諸多研究多集中在山羊、綿羊及模式動物小鼠上，獺兔是典型的皮肉兼用型經(jīng)濟(jì)動物，現(xiàn)階段對于不同發(fā)育時期的獺兔，它的毛囊以及皮膚的形態(tài)變化研究資料極為稀少。

獺兔皮毛屬于輕薄類、外觀自然美觀，近年來兔皮在國內(nèi)及國際市場上都占有很大份額，價格長期高位運(yùn)行。為獲得高品質(zhì)兔皮，除了優(yōu)代品種和精細(xì)化管理外，特別應(yīng)該注意采皮的適宜月齡和季節(jié)選取，配合安排優(yōu)化繁殖從而提高兔皮質(zhì)量等級，使得養(yǎng)殖效益得到明顯提升。但在實(shí)際養(yǎng)殖過程中，因?yàn)槭艿郊膊?、營養(yǎng)、、應(yīng)急等其他原因，獺兔的皮膚發(fā)育很容易受到影響，從而影響兔皮的高質(zhì)量。本試驗(yàn)通過對不同月齡獺兔皮膚組織切片的制作及觀察，為提高兔皮質(zhì)量提供科學(xué)有效的采皮參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

2、4、5月齡獺兔各1只、切片石蠟(60～62℃)，準(zhǔn)備好生理鹽水，10%甲醛溶液，1%鹽酸酒精溶液，HE染色劑，乙醇，二甲苯，蒸餾水，中性樹膠，Motic 數(shù)碼顯微鏡(BA210),Bluepard 電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9140A)，Leica連續(xù)切片機(jī)(RM2235)，Kedee 生物組織攤片機(jī)(KD-P)，Kedee 生物組織烘片機(jī)(KD-H), Motic 數(shù)碼顯微鏡(SFC-28)。

1.2 方法

1.2.1 取樣 選擇不同月齡健康獺兔3只，以月齡作為分組依據(jù)。處死后，在每只獺兔十字背部、臀部各選取一塊2 cm大小皮膚塊，用生理鹽水進(jìn)行沖洗后，分別放入盛有10%甲醛溶液的已編號廣口瓶中24 h。

圖1 采皮(十字交叉處取樣)

1.2.2 逐級脫水 第一步75%酒精進(jìn)行2 h，第二步85%酒精1 h，第三步95%酒精1 h，第四步100%酒精90 min。

1.2.3 透明和浸蠟 組織樣本先進(jìn)行脫水，準(zhǔn)備好后第一步浸入二甲苯I(二甲苯:酒精=1:1)30 min，第二部浸入二甲苯II(純二甲苯)5 min，第三步浸入二甲苯III(二甲苯:石蠟=1:1)5 min，第四步浸入熔化的切片石蠟(60～62℃)2.5 h，按順序依次進(jìn)行。

1.2.4 包埋 為保證石蠟不發(fā)生外溢現(xiàn)象可以涂抹凡士林。將之前包埋好的石蠟，連同浸蠟組織塊一并放入在有石棉網(wǎng)的電爐，持續(xù)加熱。后倒入很少量的石蠟，迅速移至框架內(nèi)，二次倒?jié)M石蠟，等待凝固下一步使用。

1.2.5 切片、貼片 6℃環(huán)境中置入包埋片，過夜。在預(yù)制好的包埋塊底端酒精燈持續(xù)加熱，待融化后與木塊焊接。可使用酒精燈加熱鑷子，焊接牢靠。對包埋塊進(jìn)行修整，確保樣品暴露在外且兩側(cè)處于平行。片機(jī)刀刃與蠟塊表面角度成5°傾斜，正夾角下刀切割。此操作務(wù)必使用鋒利的刀片，不可使蠟帶產(chǎn)生波紋。將切割好的蠟帶放入40℃蒸餾水進(jìn)行展片，用手指輕輕涂勻明膠粘片劑，后用載玻片黏出切片，使蠟帶處于玻片的中央處。將組裝好的切片置于溫箱中進(jìn)行烘干，溫度低于60℃、0.5h，溫度不可過高否則會造成切片脫片或產(chǎn)生氣泡或，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 染色 使用普通HE染色法進(jìn)行染色，開始前先用二甲苯I、Ⅱ脫蠟各15 min，根據(jù)季節(jié)調(diào)整時間，冬季脫蠟要略長，夏季可稍短，時間寧長勿短，如脫蠟不凈會影響染色。脫蠟酒精浸潤用水沖洗干凈，置酸化液中酸化5 min。蘇木精深染，一般建議為5 min。再用1%鹽酸酒精不間斷分化5s進(jìn)行染色，藍(lán)化變化是否明晰，最后一步使用水洗去除分化液脫下的染料，分化效果在此步驟停止。返藍(lán)則選取自來水、持續(xù)沖洗15 min，后可在顯微鏡下觀察核是否清楚，如不清則適當(dāng)延長沖洗時間，后經(jīng)伊紅染1～2 min，伊紅染胞漿，進(jìn)行充分水洗至少30s，最終使用85%→90%→95%I→95%Ⅱ→100%I→100%Ⅱ酒精→二甲苯I→二甲苯Ⅱ梯度脫水、透明、封固、貼標(biāo)簽過程。

1.2.7 觀察 在鏡下仔細(xì)觀察所制成的皮膚組織切片，并拍照進(jìn)行對比，尤其對對不同月齡的皮膚組織異同做詳細(xì)記錄。

1.2.8 成片 所取樣品經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、HE染色等流程，最終制成實(shí)驗(yàn)所需的不同月齡獺兔皮膚組織切片。

3 分析討論

3.1 獺兔毛囊發(fā)育特點(diǎn)

據(jù)調(diào)查獺兔毛囊發(fā)育在胚胎第19 天時, 頭部、背部、臀部和體側(cè)的某些部位都開始出現(xiàn)初級毛囊原基形態(tài)。初級毛囊原基形態(tài)呈現(xiàn)出一圓形細(xì)胞集結(jié)。第20天時, 各部位初級毛囊原基數(shù)目逐步開始增多, 到第24 天時, 初級毛囊開始向真皮生長，逐步形成一管狀鞘囊樣, 同一時刻次級毛囊原基出現(xiàn)。第26 天時,明顯分化已在毛囊與毛根處出現(xiàn), 有毛球和毛乳頭雛形, 并且毛根處均成功長出皮膚形成毛干。

試驗(yàn)可知獺兔皮膚組織初級毛囊在2月齡至5月齡生長期間已完全的停止生長，次級毛囊數(shù)目卻逐步增多, 向真皮方向一直持續(xù)生長,初級毛囊的直徑細(xì)小。皮膚橫切面明顯看到毛囊成群簇傘面狀態(tài)分布，周圍環(huán)繞若干較細(xì)軟密的次級毛囊( 圖2、3 、4 )。

圖2 2月齡背部皮膚縱切的組織40× 圖3 5月齡背部皮膚橫切的組織40×

圖4 5月齡背部皮膚橫切的組織100× 圖5 5月齡背部皮膚縱切的組織40×

3.2 皮膚表皮層的組織結(jié)構(gòu)

表皮層:皮板的最頂層存在模式。在制裘過程中,確保表皮的完整無損,可大大增加毛與表皮之間的結(jié)合力,因其對酸、堿、鹽和有侵蝕性有害氣體有較強(qiáng)的抵抗力,可保護(hù)動物軀體不受外界傷害。鏡下觀察,明顯觀察到表皮共4層，分別為角質(zhì)層、透明層、粒層、生發(fā)層。

19 d胎齡時, 獺兔頭部及其體表側(cè)方表皮為單層立方上皮,背部和臀部表皮為雙層立方上皮兩者區(qū)別明顯(圖 5)。在2 d胎齡時, 全身所有表皮全部為復(fù)層扁平上皮 。24 d胎齡時,表皮初次出現(xiàn)粒層,此時同步出現(xiàn)出角化。26 d胎齡時, 表皮肉眼可見變厚,明顯出現(xiàn)分化，共四層分別為基層、粒層、棘層及角化層。28 d胎齡時, 鏡下可觀察到表皮的粒層細(xì)胞內(nèi)，嗜堿性顆粒明顯增多粗大狀, 角化層增厚。通過實(shí)驗(yàn)證明：2月齡、4月齡及5月齡時, 各部表皮全部出現(xiàn)不同程度的厚度增加, 但結(jié)構(gòu)特征未出現(xiàn)無明顯的變化。

圖6 5月齡背部皮膚縱切的毛囊100×

3.3 皮膚真皮層的組織結(jié)構(gòu)

真皮層位于表皮和皮下組織之間一層,排列最緊密并且厚實(shí)。這一層實(shí)質(zhì)為非常致密的結(jié)締組織,是制裘的物質(zhì)基礎(chǔ)。真皮層含有兩層即網(wǎng)狀層和乳頭層，觀察得知真皮乳頭層是由平行排列的膠原纖維束組成的，屬于極其發(fā)達(dá)的皮層。資料顯示，19天胎齡,真皮是原始間充質(zhì)細(xì)胞,眼觀為星狀且相互間隙大 。2天胎齡時,部分梭形細(xì)胞由之前的星狀間充質(zhì)細(xì)胞演變而生，細(xì)胞間零星出現(xiàn)纖細(xì)膠原纖維。24天胎齡時,纖細(xì)膠原纖維不斷持續(xù)變多,此時梭形細(xì)胞排列分散。26天胎齡, 真皮分化進(jìn)度迅速可看到深層網(wǎng)狀層和淺層乳頭層 。28天胎齡,乳頭層分化尤為突出,此刻膠原纖維大量出現(xiàn),而真皮結(jié)締組織中細(xì)胞成分較前者對比數(shù)量逐步下降 。通過實(shí)驗(yàn)顯示，出生后的2月至5月齡(圖 6),真皮網(wǎng)狀層可達(dá)到最大厚度,膠原纖維束的排列顯得更加密集厚實(shí),且呈現(xiàn)出典型不規(guī)則致密結(jié)締組織樣。

4 結(jié)論

長久以來在部分地區(qū)，人們在飼養(yǎng)皮用兔或者是肉兔時，通常容易忽視應(yīng)充分結(jié)合兔的最佳采皮月齡，來出售商品兔從而提高兔的綜合價值。特別是對于肉兔若在3～4月齡進(jìn)行屠宰，兔皮張還未成熟，皮板較薄且張幅小，導(dǎo)致等級不高，加工利用率極低，從而造成經(jīng)濟(jì)價值大打折扣。通常獺兔自出生開始，第6周首先進(jìn)行第1次換毛，時間可持續(xù)70 d左右。約在4月齡時開始進(jìn)行第2次換毛，此階段掉毛現(xiàn)象尤為嚴(yán)重，獺兔整個身體呈現(xiàn)被毛稀疏狀，表面參差不齊，在臀部和軀體側(cè)面特別明顯，此過程持續(xù)約60 d。在5月齡左右時，此時兔毛正式進(jìn)入成熟期發(fā)育，毛根最大特點(diǎn)是粗壯不容易脫落。此時皮板基本已成熟，柔韌性和彈性都處在最佳，皮板面積均達(dá)到等級標(biāo)準(zhǔn)，此階段可作為采皮最佳月齡期。

因此，結(jié)合獺兔在不同生長時期的生理換毛規(guī)律，同時綜合考慮兔皮板的成熟度因素后，獺兔的最佳采皮月齡應(yīng)在5～8月齡，此階段所采的兔皮商品價值最高，可有效提高養(yǎng)兔業(yè)者的經(jīng)濟(jì)效益。