竹醋液的殺菌抗病毒及衛(wèi)生害蟲消殺活性

丁利超，陳明，陳妃，王品維

(1.縉云縣林業(yè)局，浙江 麗水 321400；2.杭州銀帆環(huán)境科技有限公司，浙江 杭州 310000)

竹子是一種速生材料，竹碳匯具有重要的作用。竹醋液是在竹材燒炭過程中產(chǎn)生的一種含有80%以上水分以及有機(jī)酸、酚、醛、酮、醇、酯、雜環(huán)等多種有機(jī)物的黃褐色混合性液體[1]。竹醋液傳統(tǒng)上用作殺菌劑、除臭劑、肥料、抗菌劑和促生長(zhǎng)劑[2]。研究表明，竹醋液可用做煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus,PRRSV）以及口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）等的抗病毒劑[3]。近年來，對(duì)竹醋液應(yīng)用方面的文獻(xiàn)很少，幾乎沒有證據(jù)可以表明竹醋液比其它活性化合物更具有顯著的成效。更早的一些研究可能夸大了竹醋液的應(yīng)用范圍，導(dǎo)致失去了市場(chǎng)關(guān)注。因此，進(jìn)一步進(jìn)行市場(chǎng)適應(yīng)化產(chǎn)品的開發(fā)研究，將成為未來開拓竹醋液新用途的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為有效發(fā)揮竹資源的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，2021 年國(guó)家林業(yè)和草原局、國(guó)家發(fā)展改革委、科技部、工業(yè)和信息化部、財(cái)政部、自然資源部等10 部門聯(lián)合印發(fā)《關(guān)于加快推進(jìn)竹產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展的意見》指出，要大力保護(hù)和培育優(yōu)質(zhì)竹林資源，構(gòu)建完備的現(xiàn)代竹產(chǎn)業(yè)體系，到2025 年，全國(guó)竹產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值突破7 000 億元；到2035 年，全國(guó)竹產(chǎn)業(yè)總產(chǎn)值超過1萬億元。可以預(yù)見，我國(guó)未來竹炭產(chǎn)業(yè)將不斷地發(fā)展壯大[4-6]，其副產(chǎn)物竹醋液由于焦油氣味、有機(jī)酸含量不足以及應(yīng)用范圍狹小等原因而沒有大量使用，造成嚴(yán)重過剩[7]。

為了擴(kuò)展竹醋液的應(yīng)用范圍和利用價(jià)值，本文將竹醋液開發(fā)為新型的生活垃圾處理劑，提升竹子的有效應(yīng)用和竹炭副產(chǎn)物的附加值。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑和藥液配制

供試藥劑：試驗(yàn)所用竹醋液由浙江寧波奉化竹炭廠提供，均為機(jī)械式炭化爐燒制竹炭時(shí)分離的副產(chǎn)物。

藥液配制：將供試竹醋液與水分別按1∶0、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16 質(zhì)量比例進(jìn)行配制。

1.1.2 供試病原菌、病毒和衛(wèi)生害蟲 5 種病原菌分別為大腸桿菌Escherichia coli、豬沙門氏菌Salmonella choleraesuis、志賀氏菌Shigella castellani、枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis、霍亂弧菌Vibrio cholerae；4 種病毒分別為肝炎病毒Hepatitis viruses、胃腸炎病毒Gastroenteritis virus、脊髓灰質(zhì)炎病毒Poliomyelitis virus、柯薩奇病毒Coxsachie virus；4 種衛(wèi)生害蟲分別為家蠅Musca domestica和3 種寄生蟲（結(jié)腸小袋纖毛蟲Balantidium coli malmsten、短膜殼絳蟲Hymenolepiasis nana、蟯蟲Enterobius vermicularis），以上供試病原圖菌、病毒和害蟲均由浙江省疾病控制中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試竹醋液的成分分析 取500 g 竹醋液原液進(jìn)行減壓蒸餾，回收蒸餾竹醋液488.5 g、蒸餾殘留物竹焦油10.5 g，回收率為99.8%。蒸餾竹醋液中的有機(jī)酸（以乙酸計(jì)）含量采用氫氧化鈉滴定法測(cè)定。將10.5 g 竹焦油溶解于500 mL 無水乙醇，并經(jīng)過孔徑0.22 μm 真空裝置抽濾后，密閉冷藏于4 °C 冰箱，化學(xué)成分及其相對(duì)含量使用氣質(zhì)聯(lián)用儀器分析法測(cè)定。

1.2.2 GC-MS 分析 采用7890A 氣質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫科技有限公司）。氣質(zhì)聯(lián)用儀條件如下：

色譜柱：RTX-WAX 石英毛細(xì)柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；色譜柱箱升溫程序：50 ℃保持3 min，以3 ℃·min-1升至100 ℃，以6 ℃·min-1升至200℃，再以10 ℃·min-1升至230℃保持15 min；載氣為氦氣（99.999%），流速1.50 mL·min-1，壓力88.3 k Pa，進(jìn)樣溫度250 ℃；進(jìn)樣0.2 μL；分流比100∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（EI）離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度230 ℃；四極桿質(zhì)量分離器；離子源溫度200 ℃；檢測(cè)電壓0.85 kV；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～ 500；溶劑截流：0.5 min；記錄1.0～ 55.0 min 信號(hào)。

1.2.3 竹醋液室內(nèi)殺菌活性測(cè)定方法

1.2.3.1 抑制細(xì)菌活性測(cè)定試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用抑菌圈法[8-10]，將竹醋液對(duì)5 種供試細(xì)菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。首先根據(jù)供試細(xì)菌菌種制備相應(yīng)培養(yǎng)基進(jìn)行菌種培養(yǎng)，然后用打孔器將實(shí)驗(yàn)室用的濾紙打成直徑0.5 cm 的圓片，裝在試管中密封滅菌（121 ℃，20 min）。挑選菌種制成菌懸液，分別取1 mL 菌懸液至已滅菌的培養(yǎng)皿（直徑為90 mm）中，倒入溫度45 ℃的4 mL 融化的PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g、去離子水1 L），使培養(yǎng)基與供試菌液充分混勻，靜置凝成平板。用無菌鑷子分別將一片濾紙放入已配制好的不同濃度竹醋液水劑中浸透，夾出時(shí)在容器邊緣?？科蹋瑸V掉多余的藥液，把濾紙片放在平板中已凝好的培養(yǎng)基的中央，每個(gè)培養(yǎng)皿放一片，用鑷子稍用力按壓，使濾紙片與培養(yǎng)基充分緊貼。本試驗(yàn)設(shè)6 組劑量，按照上述方法，將每個(gè)處理劑量分別做3 個(gè)重復(fù)，以滅菌水浸濕的濾紙片作為空白對(duì)照。最后將所有培養(yǎng)皿均置于人工培養(yǎng)箱（溫度為27～ 28 ℃）中進(jìn)行培養(yǎng)48 h，觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑（mm）大小。按照孫廣宇等[11]提供的方法計(jì)算菌落生長(zhǎng)抑制率，即：

1.2.3.2 抗病毒活性測(cè)定試驗(yàn) 本試驗(yàn)采用懸液法[12-13]測(cè)定竹醋液對(duì)病毒的滅活效果。首先制備供試病毒懸液，根據(jù)供試病毒種類制備相應(yīng)培養(yǎng)基。分別取出低溫保存的肝炎病毒、胃腸炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒及柯薩奇病毒4 種病毒毒種，經(jīng)融化后分別接種于敏感細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃）中培養(yǎng)24 h，獲得含有病毒的懸液，反復(fù)凍融3 次，分別取一定量加入到離心管中離心10 min，提取上清液分裝于無菌微量管中；然后將不同濃度的竹醋液分別滴加到病毒懸液中并立即混勻，再分別接種于敏感細(xì)胞，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃）中連續(xù)培養(yǎng)3 d，同時(shí)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照，每天觀察并記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。本試驗(yàn)設(shè)6 組劑量，按照上述實(shí)驗(yàn)方法，將每個(gè)處理劑量均重復(fù)3 次。按Reed-Muench 方法計(jì)算各病毒半數(shù)組織感染量（TCID50），最后計(jì)算竹醋液對(duì)病毒的殺滅率，即：

TCID50計(jì)算方法如下：

1.2.3.3 抑制衛(wèi)生害蟲活性測(cè)定試驗(yàn)

（1）抑制家蠅活性測(cè)定。將家蠅置于昆蟲室（溫度為25℃，相對(duì)濕度為60%～ 70%）內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)繁殖1～2 代。選取羽化4 d 后的健壯雌蠅，采用室內(nèi)點(diǎn)滴法測(cè)定[14]，室溫控制在（26±2）℃，相對(duì)濕度為60%±10%，用微量點(diǎn)滴器盛裝已配制好的竹醋液，點(diǎn)滴時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)定量點(diǎn)滴器將藥液滴于雌蠅胸部背板處，每頭雌蠅僅滴一滴。本試驗(yàn)設(shè)6 組劑量，每個(gè)處理劑量均重復(fù)3 次，設(shè)空白對(duì)照點(diǎn)滴蒸餾水，然后添加適量人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)并觀察。記錄雌蠅的中毒狀態(tài)和死亡情況，根據(jù)死亡和成活數(shù)量計(jì)算雌蠅的死亡率。

（2）抑制結(jié)腸小袋纖毛蟲活性測(cè)定。本試驗(yàn)采用涂片鏡檢法進(jìn)行測(cè)定[14]。首先制備RSS 培養(yǎng)基（主要組分Ringer 液、滅能小牛血清、消毒米粉、青霉素、鏈霉素），將供試結(jié)腸小袋纖毛蟲接種于RSS 培養(yǎng)基中，充分混勻后蓋上棉塞，將其放置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃）中培養(yǎng)24～ 36 h，將已經(jīng)配制好的竹醋液分別加入到已轉(zhuǎn)種的新培養(yǎng)管中，每管加等量的不同濃度竹醋液，對(duì)照組加入同等量蒸餾水，每隔一段時(shí)間吸取適量培養(yǎng)液涂片，經(jīng)鏡檢觀察并記錄結(jié)腸小袋蟲滋養(yǎng)體的生長(zhǎng)情況和數(shù)量變化。試驗(yàn)設(shè)6 組劑量，每個(gè)處理劑量均重復(fù)3 次，根據(jù)所記錄數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)腸小袋纖毛蟲的死亡率。

（3）抑制短膜殼絳蟲活性測(cè)定。試驗(yàn)方法與培養(yǎng)基制備參考文獻(xiàn)[15]進(jìn)行配制和測(cè)定。將制備好的短膜殼絳蟲培養(yǎng)液平均分為7 瓶，其中6 瓶為處理組培養(yǎng)基，添加等量已配制好的竹醋液，對(duì)照組不添加藥劑，將供試蟲體分別放入6 瓶含藥劑的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基和無藥劑的對(duì)照組培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基均置于恒溫培養(yǎng)箱（37 ℃±1 ℃）中連續(xù)培養(yǎng)3 d，期間每隔1 d（24 h）換一次培養(yǎng)液，對(duì)蟲體的活動(dòng)狀態(tài)及形態(tài)變化進(jìn)行觀察并記錄。培養(yǎng)72 h 后，分別將各培養(yǎng)液中的蟲體取出，經(jīng)Bounis 液固定并HE 染色，置于光鏡下觀察并記錄蟲體組織變化。按照以上操作方法，分別對(duì)6 組劑量做3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)所記錄數(shù)據(jù)計(jì)算短膜殼絳蟲的死亡率。

（4）抑制蟯蟲活性測(cè)定。根據(jù)何競(jìng)智等[16]實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定。蟯蟲卵采自感染蟯蟲的小白鼠Mus musculus體內(nèi)，將蟯蟲卵均分為7 組，用竹醋對(duì)6 組蟯蟲卵進(jìn)行浸泡殺滅觀察，空白對(duì)照用蒸餾水浸泡觀察。鑒別蟯蟲卵死活采用人工胃液孵化法進(jìn)行鑒別，將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組蟯蟲卵于37 ℃培養(yǎng)72 h 后分別將蟯蟲卵置于光鏡下觀察蟯蟲卵死亡情況。以上操作3 次重復(fù)，根據(jù)所記錄數(shù)據(jù)計(jì)算蟯蟲卵死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹醋液的化學(xué)成分

經(jīng)蒸餾后稱量得到竹醋液原液中竹焦油含量為2.1%，用氫氧化鈉滴定法測(cè)得竹醋液中有機(jī)酸（以乙酸計(jì)）含量為7.2%。其中，從竹焦油中共檢測(cè)到7 種化合物，分別為乙酸、2-甲氧基四氫呋喃、苯酚、4-乙基苯酚、愈創(chuàng)木酚、γ-羥基丁酸鄰苯二甲酸二丁酯（見圖1)，其相對(duì)含量用面積歸一法計(jì)算出從大到的順序?yàn)椋河鷦?chuàng)木酚（37.83%）>苯酚（35.36%）>γ-羥基丁酸（12.41%）>4-乙基苯酚（6.16% ）>鄰苯二甲酸二丁酯（5.42%）>乙酸（1.78%）>2-甲氧基四氫呋喃（1.04%）。

圖1 竹焦油中總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of bamboo tar

2.2 竹醋液殺菌、抗病毒活性和防治害蟲測(cè)定結(jié)果

2.2.1 殺菌效果的測(cè)定結(jié)果 不同濃度竹醋液制劑殺菌效果見表1。

表1 不同濃度竹醋液對(duì)細(xì)菌的殺菌效果Tab.1 Effect of bamboo pyroligneous liquor with different concentration on different bacteria

由表1 可知，有機(jī)酸濃度為7.2%竹醋液對(duì)大腸桿菌、豬沙門氏菌、志賀氏菌、枯草芽孢桿菌和霍亂弧菌的殺菌效果分別為83.2%、86.7%、81.5%、87.3%和84.6%，殺菌效果極佳；有機(jī)酸濃度為3.6%（稀釋1 倍）和2.4%（稀釋2 倍）竹醋液對(duì)5 種細(xì)菌的殺菌效果為60%～ 75%，殺菌效果較好；有機(jī)酸濃度為1.44%（稀釋4倍）竹醋液對(duì)細(xì)菌的殺菌效果為50%左右，相較于有機(jī)酸濃度為3.6%和2.4%竹醋液對(duì)5 種細(xì)菌的殺菌效果均有顯著差異（P<0.05）；而有機(jī)酸濃度為0.8%（稀釋8 倍）和0.42%（稀釋16 倍）竹醋液對(duì)5 種細(xì)菌的殺菌效果最差，與稀釋0～ 4 倍竹醋液對(duì)5 種細(xì)菌的殺菌效果均有顯著差異（P<0.05），且對(duì)細(xì)菌的殺菌效果均在50%以下。可見有機(jī)酸濃度為1.44%～ 7.2%竹醋液對(duì)5 種細(xì)菌的殺菌效果均可達(dá)到50%以上，即竹醋液最佳稀釋倍數(shù)為0～ 4 倍。

2.2.2 防治病毒的效果 不同濃度竹醋液制劑對(duì)病毒的殺滅率見表2。由表2 可知，有機(jī)酸濃度7.2%竹醋液對(duì)肝炎病毒、胃腸炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒的殺滅率分別為65.3%、53.6%和57.1%，并且有機(jī)酸濃度為3.6%和7.2% 時(shí)，2 個(gè)濃度的竹醋液對(duì)這3 種病毒殺滅率沒有顯著差異，防治效果較好，但對(duì)于柯薩奇病毒的殺滅率，2 個(gè)濃度有顯著差異（P<0.05），有機(jī)酸濃度7.2%竹醋液比有機(jī)酸濃度3.6%竹醋液效果更佳，殺滅率分別為66.3%和54.2%。有機(jī)酸濃度2.4%～ 3.6%竹醋液對(duì)4 種病毒的殺滅率為50%～ 60%，防治效果較好；有機(jī)酸濃度為1.44%竹醋液對(duì)病毒的殺滅率為40%左右，相較有機(jī)酸濃度為3.6%和2.4%竹醋液對(duì)病毒的防治效果有顯著差異（P<0.05）；而有機(jī)酸濃度0.8%和0.42%竹醋液對(duì)4 種病毒的殺滅效果均在40%以下，與有機(jī)酸濃度2.4%～ 7.2%的處理組的防治效果有顯著差異（P<0.05）。由此可知，有機(jī)酸濃度為2.4%～ 7.2%竹醋液對(duì)4 種病毒的抗病毒效果均可達(dá)到50%以上，即最佳稀釋倍數(shù)為0～ 2 倍。

表2 不同濃度竹醋液對(duì)病毒的殺滅率Tab.2 Effect of bamboo pyroligneous liquor with different concentration on different virus

2.2.3 防治衛(wèi)生害蟲的測(cè)定結(jié)果 不同濃度竹醋液制劑對(duì)家蠅和3 種寄生蟲的殺滅率見表3。由表3 可知，有機(jī)酸濃度7.2%竹醋液對(duì)家蠅、結(jié)腸小袋纖毛蟲、短膜殼絳蟲和蟯蟲的殺滅率分別為93.0%、92.5%、91.2%和91.4%，防治效果最佳，與有機(jī)酸濃度為0.42%～ 3.6%竹醋液處理組均有顯著性差異（P<0.05）；有機(jī)酸濃度2.4%～ 3.6%竹醋液對(duì)家蠅和3 種寄生蟲的殺滅率為70%～ 80%，防治效果較好，與有機(jī)酸濃度0.42%～ 1.44%竹醋液處理組有顯著性差異（P<0.05）；有機(jī)酸濃度1.44%竹醋液對(duì)家蠅和3 種寄生蟲的殺滅率為60%左右，防治效果一般，但顯著好于0.4%～ 0.8%竹醋液處理組，后者對(duì)家蠅和3 種寄生蟲的防治效果較差，殺滅率均在40%以下。因此，有機(jī)酸濃度1.44%～ 7.2%竹醋液對(duì)家蠅和3 種寄生蟲的殺滅率均達(dá)到50%以上，即最佳稀釋濃度為0～ 4 倍。

表3 不同濃度竹醋液對(duì)4 種衛(wèi)生害蟲的殺滅率Tab.3 Effect of bamboo pyroligneous liquor with different concentration on different parasite

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本試驗(yàn)所用竹醋液的有機(jī)酸含量比較高，對(duì)其殺菌、抗病毒和抑制衛(wèi)生害蟲作用初步研究表明，竹醋液對(duì)生活垃圾中常見的細(xì)菌、病毒及衛(wèi)生害蟲等均具有較強(qiáng)的殺滅作用。竹醋液對(duì)病菌的殺滅活性與其有機(jī)酸濃度成正比，即有機(jī)酸濃度越高，殺菌抗病毒效果越強(qiáng)。竹醋液對(duì)垃圾中病菌的殺滅作用的有效活性成分為有機(jī)酸，有機(jī)酸濃度2.4%～ 7.2%竹醋液對(duì)垃圾中細(xì)菌、病毒和衛(wèi)生害蟲的殺滅率達(dá)50%以上，可以作為生活垃圾處理劑。

3.2 討論

竹醋液對(duì)細(xì)菌、病毒的抑殺活性顯著，具有廣闊的開發(fā)利用前景[17-18]。然而，我國(guó)對(duì)竹醋液的研究開發(fā)思路還停留在效果第一的初級(jí)階段，現(xiàn)今的研究應(yīng)該著眼未來，以安全和舒服為第一、效果為第二的研究思路為指導(dǎo)，竹醋液為天然物品，符合人們追求自然的天性，但需要解決因竹醋液中存在1%～ 5%的水溶性竹焦油（主要為苯酚類物質(zhì)）存在的舒服性與安全性問題。竹材的種類、質(zhì)量、生產(chǎn)設(shè)備和工藝技術(shù)、收集方法、包裝、儲(chǔ)存方法與條件等不同都會(huì)造成竹醋液各組分含量和理化性質(zhì)的差異。要想充分發(fā)揮竹醋液的優(yōu)良特性，擴(kuò)大其應(yīng)用前景，首先生產(chǎn)設(shè)備和工藝技術(shù)等因素的綜合研究有待加強(qiáng)，以確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定與標(biāo)準(zhǔn)化。其次還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)竹醋液作用機(jī)理的研究，探明竹醋液各組分含量和存在形式與組分的關(guān)系，并研究其各種成分的有效性以及存在的副作用，為竹醋液開拓新的應(yīng)用領(lǐng)域打下基礎(chǔ)。

生活垃圾的處理一直是困擾人們的一個(gè)難題，尤其是大中城市，每天收集的垃圾量已超過負(fù)荷，而其中大部分采用集中填埋的方式進(jìn)行處理[17-19]。生活垃圾中的細(xì)菌、病毒等微生物以及家蠅、蚊蟲之類生物對(duì)人類產(chǎn)生很大危害。由于大量的城市生活垃圾產(chǎn)生于居民稠密區(qū)，垃圾收集點(diǎn)、中轉(zhuǎn)站亦就近建在居民稠密區(qū)，因而垃圾收集點(diǎn)、中轉(zhuǎn)站產(chǎn)生的垃圾臭氣對(duì)周圍環(huán)境造成了極為嚴(yán)重的影響，亦會(huì)對(duì)周邊居民身體健康產(chǎn)生危害[19]。因此，本研究不僅實(shí)現(xiàn)了竹醋液的大量應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)廢物高值化利用的目的，而且解決了生活垃圾的臨時(shí)處理的惡臭和有害生物傳播難題。