反式和順式二苯乙烯苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較研究*

柴士偉，高建，厙立鶴，于俏，龐旭，韓立峰

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193；2．國(guó)家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300193；3．天津市中藥化學(xué)與分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

何首烏為蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb．）的干燥塊根，味苦，歸肝、心和腎經(jīng)[1]?，F(xiàn)代研究表明，2，3，5，4'-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（二苯乙烯苷，TSG）是何首烏的主要活性成分[2]，中國(guó)藥典在2000年將其作為何首烏的定量指標(biāo)，一直沿用至今[3]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)：該化合物具有抗炎[4-5]、抗衰老[6]、抗氧化[7]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[8]、保肝[9-10]和抗腫瘤[11]等多種生物活性。由結(jié)構(gòu)可知，TSG具有反式和順式兩種構(gòu)型[12]，反式二苯乙烯苷（trans-TSG）可以在光異構(gòu)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖蕉揭蚁┸眨╟is-TSG）。有文獻(xiàn)報(bào)道cis-TSG可能是何首烏造成肝損傷的潛在毒性成分[13]，而trans-TSG目前為止未見(jiàn)任何肝毒性報(bào)道。由于trans-/cis-TSG的結(jié)構(gòu)可以相互轉(zhuǎn)變，而體內(nèi)安全性差異顯著，因此它們是否會(huì)表現(xiàn)出不同的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為，值得進(jìn)一步研究。前期已有文獻(xiàn)報(bào)道trans-/cis-TSG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，但主要是以中藥制劑和提取物為主[14-15]，而這些制劑中的其他成分可能會(huì)對(duì)trans-/cis-TSG的體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)行為產(chǎn)生影響。因此，本實(shí)驗(yàn)以trans-/cis-TSG單體化合物為研究對(duì)象，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）分析方法，考察了單次給藥后，trans-/cis-TSG在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，為后續(xù)何首烏致肝損傷物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只雄性SD大鼠（200±20）g，購(gòu)自北京維通利華生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011，實(shí)驗(yàn)已通過(guò)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批編號(hào)為T(mén)CM-LAEC2021151。

1.2 藥品與試劑 trans-TSG（純度，HPLC面積歸一化法：99．13%），cis-TSG（純度，HPLC 面積歸一化法：100%）為實(shí)驗(yàn)室自制，虎杖苷（上海源葉生物科技有限公司，ZM0530LA14，HPLC≥98%）。色譜乙腈、色譜甲醇（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)），色譜甲酸（Anaqua Chemicals Supply，美國(guó)）。

1.3 儀器 Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)和Xevo TQ-S質(zhì)譜系統(tǒng)聯(lián)用儀（Waters，美國(guó)）；KQ-1000DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XW-80A型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠）；微量移液器（Eppendorf，德國(guó)）；Centrifuge冷凍臺(tái)式高速離心機(jī)（Eppendorf，德國(guó)）；BP121S型天平（Sartorius，德國(guó)）；Millipore純水器（Millipore，美國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18Column（2．1 mm×50 mm，1．7 μm，Waters，美國(guó)）。乙腈（A）和 0．1%甲酸水（B）作為流動(dòng)相，梯度洗脫，0～8 min，5%～45%B。柱溫設(shè)置為30℃，進(jìn)樣體積為3 μL，流速為 0．3 mL/min。

2.2 質(zhì)譜條件 負(fù)離子模式下，儀器方法的毛細(xì)管電壓、錐孔電壓和去溶劑化溫度分別設(shè)置為2．5 kV，30 V和650℃；氮?dú)庾鳛槿ト軇怏w，流速設(shè)置為800 L/h；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式和其他關(guān)鍵參數(shù)設(shè)置如表1所示，基于Masslynx 4．1和TargetLynx軟件，同時(shí)采集和分析大鼠血漿中trans-TSG和cis-TSG的定量信息。

表1 目標(biāo)化合物的MRM參數(shù)Tab.1 MRM parameters of the target compounds

2.3 動(dòng)物分組和給藥 12只大鼠隨機(jī)分為兩組，trans-TSG組和cis-TSG組，每組6只。嚴(yán)格按照天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心管理規(guī)范飼養(yǎng)，在室溫（20±5）℃，相對(duì)濕度55%～65%，通風(fēng)良好，環(huán)境安靜，定期消毒的環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，期間自由飲水和飲食。分別單次給藥60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG[16]，在給藥后按照時(shí)間點(diǎn)：0，0．033，0．083，0．17，0．25，0．33，0．5，1，2，4，8，10，24 h，眼眶內(nèi)眥取血，取至預(yù)先加入 10 μL肝素鈉（100單位）的 1．5 mL離心管中，4 ℃離心 10 min（6 600×g），取上層血漿于-80℃冰箱冷凍保存。

2.4 血漿樣本的處理 取出-80℃冰箱冷凍保存的大鼠血漿樣品各100 μL，于4℃環(huán)境下解凍，分別加入600 μL冰甲醇和10 μL的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋震蕩5 min，4 ℃下離心 20 min（13 200×g），取出上清，氮吹干。加入100 μL 50%的甲醇水溶液復(fù)溶，渦旋震蕩 5 min，4 ℃下離心 20 min（13 200×g），取出上清，待測(cè)。

2.5 對(duì)照品溶液的配制 精確稱(chēng)量trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷（內(nèi)標(biāo)）各1 mg分別溶解于1 mL的甲醇溶液中得1 mg/mL的溶液，然后用甲醇分別進(jìn)行稀釋得10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG和虎杖苷儲(chǔ)備液。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 trans-TSG、cis-TSG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用DAS藥代動(dòng)力學(xué)軟件（版本1．0，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)，中國(guó)）進(jìn)行計(jì)算。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入graphpad prism 8．0進(jìn)行分析，計(jì)算結(jié)果使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用線(xiàn)性相關(guān)與回歸分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專(zhuān)屬性 按照“1．2．4血漿樣本的處理”項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)空白血漿（A）、空白血漿加入對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液（B）和血漿樣品加入內(nèi)標(biāo)溶液（C）進(jìn)行分析。分別得到空白血漿色譜圖、血漿對(duì)照品色譜圖和血漿樣品色譜圖。

2.7.2 線(xiàn)性關(guān)系 精密吸取適量濃度為10 μg/mL的trans-TSG、cis-TSG儲(chǔ)備液，加入適量甲醇，cis-TSG 分別稀釋為 3．90，7．81，15．62，31．25，62．5，125，250，500，1 000和2 000 ng/mL一系列對(duì)照品溶液；trans-TSG 稀釋濃度為 1．95，3．90，7．81，15．62，31．25，62．5，125，250，500 和 1 000 ng/mL 一系列對(duì)照品溶液。分別吸取上述對(duì)照品溶液100 μL，氮?dú)獯蹈扇軇尤?100 μL 空白血漿，按“1．2．4 血漿樣本的處理”項(xiàng)下操作，然后進(jìn)樣分析?？v坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰峰面積比值，橫坐標(biāo)表示標(biāo)準(zhǔn)品濃度，繪制回歸曲線(xiàn)，計(jì)算得線(xiàn)性回歸方程。

2.7.3 日內(nèi)和日間精密度 各取空白血漿100 μL按照“1．2．4 血漿樣本的處理”項(xiàng)下的制備方法，配制“表3”中低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品。日內(nèi)精密度即測(cè)定低、中、高3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品，水平重復(fù)6次。日間精密度即連續(xù)3 d測(cè)定“日內(nèi)精密度的樣品”，根據(jù)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定濃度。計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），并用測(cè)定濃度和已知濃度的百分比來(lái)評(píng)價(jià)準(zhǔn)確度。

2.7.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 配制低、中、高質(zhì)量濃度的 trans-TSG（10、100和 1600 ng/mL）和 cis-TSG（5、50 和 800 ng/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取 100 μL，平行6份，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液和100 μL空白血漿，樣品預(yù)處理后測(cè)定，所得峰面積結(jié)果記為A；另取同樣份數(shù)的空白血漿，加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，經(jīng)樣品前處理后測(cè)定，所得峰面積結(jié)果記為B；準(zhǔn)備高、中、低3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液各100 μL，平行6份，分別加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液，氮吹干后，用100 μL 50%甲醇復(fù)溶，所得峰面積結(jié)果記為C。A/B×100%為提取回收率，A/C×100%為基質(zhì)效應(yīng)。

2.7.5 穩(wěn)定性 按照“1.2.4血漿樣本的處理”項(xiàng)下制備方法，制備的低、中、高3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品血漿樣品，分別考察其穩(wěn)定性。穩(wěn)定性評(píng)價(jià)包括樣品盤(pán)內(nèi)24 h穩(wěn)定性、3次凍融循環(huán)穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1.1 專(zhuān)屬性 空白血漿色譜圖（A），血漿對(duì)照品色譜圖（B），血漿樣品色譜圖（C），如圖1所示，結(jié)果表明樣品色譜峰不受溶劑和內(nèi)標(biāo)的干擾，專(zhuān)屬性良好。

圖1 MRM模式下大鼠血漿中目標(biāo)化合物的專(zhuān)屬性色譜圖Fig.1 Specificity chromatogram of the target compounds in rat plasma with the MRM mode

3.1.2 線(xiàn)性關(guān)系 目標(biāo)分析化合物的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍如表2所示。結(jié)果表明，大鼠血漿中trans-TSG在3.90～2 000 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，cis-TSG在1.95～1 000 ng/mL的范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

表2 目標(biāo)化合物的線(xiàn)性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient and linear range of the target compounds

3.1.3 精密度和準(zhǔn)確度 trans-TSG和cis-TSG的低、中、高3個(gè)濃度的日內(nèi)精密度和日間精密度結(jié)果如表3所示，RSD值均小于12%，準(zhǔn)確度在87.3～101.2，表明所建方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3 目標(biāo)化合物的精密度和準(zhǔn)確度Tab.3 Precision and accuracy of the target compounds

3.1.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，trans-TSG低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率分別為91.7%、94.1%和92.2%；cis-TSG的低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率分別為97.1%、90.1%和95.3%。兩者的各個(gè)濃度的平均提取回收率均大于91%，且RSD均小于4.7%，表明trans-TSG和cis-TSG的回收率較高。

表4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)Tab.4 Recovery and matrix effect

3.1.5 穩(wěn)定性 trans-TSG和cis-TSG在樣品盤(pán)放置24 h后以及3次凍融循環(huán)之后進(jìn)行處理的狀態(tài)下，低、中、高3個(gè)濃度的測(cè)定結(jié)果如圖表5所示，顯示出良好的穩(wěn)定性。

表5 穩(wěn)定性考察Tab.5 Study on the stability of the target compounds

3.2 血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn) 如圖2所示，大鼠單次灌胃60 mg/kg的trans-TSG和cis-TSG后，cis-TSG的血藥濃度高于trans-TSG。

圖2 trans-TSG和cis-TSG的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)Fig.2 Plasma concentration time curves of trans-TSG and cis-TSG

3.3 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) trans-TSG和cis-TSG藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)使用DAS藥代動(dòng)力學(xué)軟件進(jìn)行計(jì)算，符合一室模型，分析所得的藥-時(shí)曲線(xiàn)如圖2所示，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表6所示，單次給藥trans-TSG和cis-TSG 后，cis-TSG 在大鼠體內(nèi)的 AUC0-t、AUC0-∞和Tmax均大于trans-TSG，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。cis-TSG在大鼠體內(nèi)的半衰期（T1/2）顯著大于trans-TSG（P＜0．05）。而 trans-TSG 在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度（Cmax）和清除率（CLz/F）則顯著高于 cis-TSG（P＜0．05）。

表6 大鼠單次灌胃trans-TSG和cis-TSG的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（n=6）Tab.6 Pharmacokinetic parameters of trans-TSG and cis-TSG(n=6)

4 討論

具有順?lè)唇Y(jié)構(gòu)的化合物，在一定條件下可以實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)化。順?lè)串悩?gòu)化過(guò)程及其機(jī)制，通常包括光異構(gòu)化[17]、熱致異構(gòu)化[18]和催化異構(gòu)化[19]。而何首烏中trans-TSG向cis-TSG的轉(zhuǎn)化屬于光致異構(gòu)化。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于熱力學(xué)穩(wěn)定的二苯乙烯類(lèi)的反式結(jié)構(gòu)，通過(guò)加熱條件是難以實(shí)現(xiàn)構(gòu)型轉(zhuǎn)換，但在光照射下，反式異構(gòu)體易轉(zhuǎn)變?yōu)轫樖疆悩?gòu)體[20]。同時(shí)，二苯乙烯苷是多酚類(lèi)化合物，意味著很容易發(fā)生氧化反應(yīng)，因此二苯乙烯苷的降解除了可以通過(guò)光和熱的條件而引發(fā)之外，氧氣和堿性pH條件也應(yīng)該格外注意[21]。因此，本研究在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中全程避光，所配制的溶液也存放在低溫避光環(huán)境，避免了trans-TSG和cis-TSG的相互轉(zhuǎn)化。同時(shí)，由于trans-TSG和cis-TSG的質(zhì)譜碎裂方式相同，因此，在提取離子流色譜圖時(shí)，如果發(fā)生體內(nèi)轉(zhuǎn)化，將會(huì)同時(shí)出現(xiàn)trans-/cis-TSG的色譜峰，但在本研究中，未發(fā)現(xiàn)有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（圖1C）。

單次灌胃給藥相同劑量的trans-TSG和cis-TSG后，cis-TSG在大鼠的AUC0-t大于trans-TSG，但未發(fā)現(xiàn)顯著性差異（P＞0．05）。trans-TSG 在大鼠體內(nèi)的 Cmax和 CLz/F 均顯著高于 cis-TSG（P＜0．05），同時(shí)cis-TSG在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰時(shí)間（Tmax）和半衰期（T1/2）均大于trans-TSG，其中T1/2約為trans-TSG的4．4 倍，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。以上結(jié)果表明，cis-TSG在大鼠體內(nèi)的暴露量高于trans-TSG，并且具有更低的清除率和較長(zhǎng)的半衰期（P＜0．05），這表明cis-TSG在大鼠體內(nèi)更容易出現(xiàn)蓄積，而有研究發(fā)現(xiàn)cis-TSG可能是何首烏中潛在的肝損傷風(fēng)險(xiǎn)成分[22]，這是否與cis-TSG在體內(nèi)的蓄積有關(guān)，值得進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究建立了UPLC-MS/MS分析方法，研究比較了何首烏中trans-TSG和cis-TSG在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)行為，為后續(xù)trans-/cis-TSG的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。