劉芳 王布 張長(zhǎng)洪 鄒芳 郭志青 宋宇烜 劉建華

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科;2.RICU,河北 張家口 075000)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是臨床醫(yī)生面臨的一個(gè)重大挑戰(zhàn)[1]，它是一種急性進(jìn)行性肺功能不全或呼吸衰竭，由肺部各種內(nèi)外因素引起，死亡率高達(dá)40%[2]。此外，由于肺泡屏障通透性增加，以肺泡上皮和毛細(xì)血管內(nèi)皮為特征的快速肺泡損傷導(dǎo)致空氣水腫和炎癥[3-4]，也是ALI發(fā)展的重要因素。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的肺損傷模型已廣泛應(yīng)用于肺損傷的研究。ALI沒(méi)有特定的治療方案，目前，輔助通氣和藥物治療是主要的臨床應(yīng)用方法[5]。因此，開發(fā)新的有效策略對(duì)于臨床治療ALI具有重要意義。C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白3(CTRP3)是一種新型的脂肪因子，屬于脂聯(lián)素分支蛋白中高度保守的CTRP超家族[6]。它主要在脂肪組織中表達(dá)，也在心臟和肝臟中發(fā)現(xiàn)[7]。以往研究表明，CTRP3是LPS的內(nèi)源性拮抗劑[8]，CTRP3的異常表達(dá)與多種類型的人類疾病有關(guān)，如關(guān)節(jié)炎[9]和心肌功能障礙[6]等。盡管如此，CTRP3在ALI中的生物學(xué)作用和潛在的分子機(jī)制仍不清楚。本研究旨在確定CTRP3對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠中的作用，并闡明潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 慢病毒CTRP3(LV-CTRP3)和(LV-NC)載體購(gòu)自上海吉瑪公司；ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)過(guò)氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)購(gòu)自南京建成生物公司；抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只雄性C57BL/6小鼠(6～8周齡，20～24 g)購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(冀)2018-004。所有小鼠飼養(yǎng)在(22±2)℃和50%濕度的塑料籠中，在12 h的光/暗循環(huán)中自由獲取食物和水。本研究通過(guò)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.3 動(dòng)物模型及分組 氣管內(nèi)滴注LPS建立ALI小鼠模型[4]，隨機(jī)分為對(duì)照組、LPS組、LPS+LV-NC(2 mg/kg)組、LPS+LV-CTRP3(2 mg/kg)4組，每組各10只。LPS組小鼠氣管內(nèi)滴注3 mg/kg LPS建立ALI模型。同時(shí)，對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)滴注等量生理鹽。LPS+LV-CTRP3組小鼠靜脈注射LV-CTRP3慢病毒(2×107轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/mL)，LPS+LV-NC組小鼠靜脈注射等量LV-NC慢病毒。LPS處理前，LPS+LV-NC組和LPS+LV-CTRP3組每天注射一次，連續(xù)3 d。LPS誘導(dǎo)48 h后人道處死小鼠。打開胸腔，右肺用0.9%生理鹽水灌洗。收集支氣管肺泡灌洗液(BALF)，并使用冷卻離心機(jī)(4000 rpm)在4℃下離心15 min。BALF上清液儲(chǔ)存在-80℃下，直至進(jìn)一步分析。稱量一小塊左肺，用冰冷的生理鹽水沖洗，然后在10%中性福爾馬林液中固定，并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

1.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn) 使用TRIzol試劑(大連寶生物公司)從肺組織中提取總RNA，并根據(jù)照制造商的說(shuō)明，將其反向轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。使用SYBRP remix Ex TaqTM試劑盒(日本Takara公司)進(jìn)行對(duì)其qRT-PCR 檢測(cè)。使用2-△△Ct方法分析其mRNA表達(dá)量。CTRP3正向引物 5′-ATGGAGGTG AGCAGAAGAGC-3′，CTRP3反向引物5′-CACAGT CCCCGTTTTAGCAT-3′；β-actin正向引物 5′-GATC ATTGCTCCTCCTGAG-3′，β-actin反向引物5′-ACT CCTGCTTGCTGATCCAC-3′。

1.5 蘇木精-伊紅(H&E)染色 新鮮肺標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，然后進(jìn)行5 μm切片。按照標(biāo)準(zhǔn)程序[10]對(duì)肺組織的石蠟切片進(jìn)行H&E染色以進(jìn)行組織學(xué)檢查。在光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)拍攝圖像，并由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)家雙盲評(píng)估。

1.6 肺濕/干比測(cè)量 分離小鼠右肺并稱重作為濕重，然后在80℃下干燥48 h并測(cè)量其干重。濕/干比作為肺水腫的指標(biāo)。

1.7 ELISA試驗(yàn) 根據(jù)制造商的方案,使用ELISA試劑盒評(píng)估TNF -α, IL-6 和 IL-1β在BALF樣本中表達(dá)。

1.8 SOD,CAT,GSH-Px和MDA測(cè)定 切除小鼠肺組織并制備勻漿液。按照制造商說(shuō)明，使用診斷試劑盒測(cè)定上清液中SOD、CAT、GSH-PX和MDA的含量。

1.9 免疫組織化學(xué)(IHC)肺組織的石蠟切片在脫石蠟和再水化之后，用檸檬酸修復(fù)抗原，3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。然后，孵育特異性一抗(抗SIRT1和抗p-NF-κB p65)4℃過(guò)夜。PBS洗滌3次后，將切片與二抗結(jié)合在37℃下孵育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)對(duì)載玻片進(jìn)行染色。IHC陽(yáng)性結(jié)果以棕色表示，使用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度(AOD)。

1.10 Western Blot用RIPA裂解 緩沖液在4℃下提取肺肌組織總蛋白，使用BCA試劑盒(北京碧云天公司)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE) 對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯 (PVDF) 膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h后，用稀釋的一抗SIRT1、磷酸化p65、p65和乙?；痯53于 4 ℃環(huán)境中孵育過(guò)夜。用TBST洗滌3次后，與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗在室溫下孵育1 h，并用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯示信號(hào)。β-actin用作內(nèi)參對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 CTRP3在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺中下調(diào) 本研究構(gòu)建了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型，48 h后收集小鼠肺組織進(jìn)行HE染色。與對(duì)照組相比，LPS組肺泡外膜增厚、出血和肺水腫。此外，與對(duì)照組相比，ALI小鼠肺組織中CTRP3的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。見圖1。

圖1 CTRP3在ALI小鼠中下調(diào)

2.2 CTRP3過(guò)表達(dá) 減弱LPS誘導(dǎo)的肺損傷為了證實(shí)提高體內(nèi)CTRP3的表達(dá)是否可以緩解小鼠ALI過(guò)程，本研究通過(guò)尾靜脈注射攜帶CTRP3基因的慢病毒載體(LV-CTRP3)。與LPS組相比，CTRP3的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05)。此外，與LPS組相比，ALI小鼠肺泡外膜增厚、出血和肺水腫顯著減輕。與對(duì)照組相比，LPS組肺損傷評(píng)分和肺含水量明顯增加 (P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著降低肺損傷評(píng)分和肺濕干比(P<0.05)。見圖2。

圖2 CTRP3過(guò)表達(dá)對(duì)肺組織損傷的影響

2.3 CTRP3過(guò)表達(dá) 緩解LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與對(duì)照組相比，LPS顯著增加BALF中的總炎癥細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(P<0.05)，顯著提高肺組織MPO活性(P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著抑制LPS誘導(dǎo)的總炎癥細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的增加(P<0.05)，顯著抑制LPS誘導(dǎo)的MPO活性(P<0.05)。與對(duì)照組相比，ALI小鼠BALF中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著升高 (P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著降低ALI小鼠BALF中的IL-6、IL-1β和TNF-α水平 (P<0.05)，表明CTRP3過(guò)表達(dá)緩解了ALI小鼠中的炎癥反應(yīng)。見圖3。

圖3 CTRP3過(guò)表達(dá)對(duì)ALI小鼠炎癥反應(yīng)的影響

2.4 CTRP3過(guò)表達(dá) 減少LPS誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與對(duì)照組相比，LPS組的MDA含量顯著增加，SOD、CAT 和 GSH-Px的活性顯著降低(P<0.05)。與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著逆轉(zhuǎn)了氧化參數(shù)的變化(P<0.05)，表明CTRP3過(guò)表達(dá)可減少ALI小鼠中的氧化應(yīng)激。見圖4。

圖4 CTRP3過(guò)表達(dá)對(duì)ALI小鼠氧化應(yīng)激的影響

2.5 CTRP3通過(guò)SIRT1在體內(nèi)調(diào)節(jié)p53/NF-κB信號(hào)通路 與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著增加SIRT1陽(yáng)性細(xì)胞，減少p-p65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。Western blot分析用于評(píng)估CTRP3對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺中SIRT1表達(dá)、NF-κB p65磷酸化和p53乙?；挠绊?。與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)消除了LPS對(duì)ALI小鼠肺組織中SIRT1蛋白表達(dá)的抑制作用(P<0.05)。此外，CTRP3過(guò)表達(dá)還逆轉(zhuǎn)了LPS對(duì)ALI小鼠肺NF-κB p65磷酸化和p53乙酰化的促進(jìn)作用(P<0.05)，結(jié)果表明CTRP3可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)SIRT1介導(dǎo)的NF-κB和p53信號(hào)通路。見圖5。

3 討論

ALI是呼吸系統(tǒng)的一種嚴(yán)重疾病。炎癥反應(yīng)失衡、肺泡通透性增加以及上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞引起的凝血通路異常激活是ALI發(fā)病機(jī)制的主要特征[11]。ALI的病因多樣，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，因此深入了解ALI的發(fā)生、發(fā)展和調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要。由于體內(nèi)研究肺部病理變化的局限性，動(dòng)物模型是研究ALI的最佳選擇[12]。因此，本研究采用LPS誘導(dǎo)ALI。注射LPS后，小鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷，表明ALI模型已誘導(dǎo)成功。

圖5 CTRP3對(duì)小鼠肺中p53/NF-κB通路的影響

LPS誘導(dǎo)的ALI可導(dǎo)致肺水腫，肺組織體積和重量增加，這是急性肺損傷的主要特征之一。計(jì)算肺組織的W/D值，客觀評(píng)價(jià)肺水腫的程度，W/D值越高，肺水腫越嚴(yán)重。促炎細(xì)胞因子，如TNF-α和IL-1β，增加肺上皮的通透性，進(jìn)而誘導(dǎo)肺組織損傷和中性粒細(xì)胞的聚集，導(dǎo)致肺水腫[1]。IL-6在患者的BALF中增加，并且更高水平會(huì)增加死亡率。此外，在LPS誘導(dǎo)的ALI中，大量的中性粒細(xì)胞向肺組織內(nèi)轉(zhuǎn)移并參與炎癥反應(yīng)。MPO活性是ALI的一個(gè)敏感和特異的標(biāo)記物，用于評(píng)估組織中中性粒細(xì)胞積聚的量化[13]。本研究中，與LPS組相比，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著減少BALF中的中性粒細(xì)胞數(shù)和肺組織中的MPO活性，抑制BALF中TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌。這些結(jié)果表明，CTRP3過(guò)表達(dá)可以抑制中性粒細(xì)胞向肺組織的遷移，從而減輕肺組織的炎癥損傷。

活性氧(ROS)可以作為信號(hào)分子參與細(xì)胞分裂、凋亡和免疫應(yīng)答等過(guò)程[14]。通過(guò)相關(guān)酶去除多余的ROS，維持機(jī)體相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)。發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)時(shí)，抗氧化劑(SOD、CAT和GSH-Px)會(huì)大量消耗[15]，以清除體內(nèi)的ROS。SOD是體內(nèi)唯一能清除O2-的酶[16]，在CAT和GSH-Px的作用下繼續(xù)生成H2O，并從體內(nèi)排出，從而消除ROS，保護(hù)身體免受氧化攻擊。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物[17]，通常用來(lái)反映氧化應(yīng)激水平。本研究中，CTRP3在LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI模型中具有良好的抗氧化活性，CTRP3過(guò)表達(dá)顯著抑制小鼠肺組織MDA的生成，提高SOD、CAT和GSH-Px的含量。

SIRT1是多種細(xì)胞和機(jī)體過(guò)程的調(diào)節(jié)劑，包括新陳代謝，免疫應(yīng)答和衰老[18]。SIRT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路發(fā)揮其功能[19]。研究發(fā)現(xiàn)CTRP3可以通過(guò)激活SIRT1來(lái)減輕器官損傷[20]。本研究中，與正常對(duì)照組小鼠相比，LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺組織中SIRT1表達(dá)顯著下調(diào)。為了更好地闡明CTRP3/SIRT1軸保護(hù)作用的分子機(jī)制，我們?cè)u(píng)估NF-κB通路和p53通路。NF-κB途徑的激活與炎癥過(guò)程密切相關(guān)[21]。p53乙?；徽J(rèn)為有助于組織和器官損傷的發(fā)生[22]。在本研究中，與正常對(duì)照組小鼠相比，LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠的肺中p65磷酸化水平和p53乙?；斤@著增加。CTRP3過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1介導(dǎo)的NF-κB途徑和p53途徑減輕ALI小鼠的肺損傷。這些結(jié)果表明，CTRP3通過(guò)SIRT1/NFκB/p53軸對(duì)小鼠ALI發(fā)揮保護(hù)作用。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究揭示了CTRP3對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI的保護(hù)作用。此外，CTRP3可通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1介導(dǎo)的p53/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)作用。這為理解ALI發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的見解，表明CTRP3/SIRT1/NF-κB/p53軸可能是ALI患者的一個(gè)有希望的治療靶點(diǎn)。