不同益生菌對豬流行性腹瀉病毒-德爾塔冠狀病毒二聯(lián)滅活疫苗小鼠免疫及腸道微生物的影響

燕 陽，張 宇，吳 琪，韓如意，劉林萍，高淑黠，葉以哲，葉 昱，2，黃冬艷，2，丁 珍，2，唐玉新，2，宋德平，2*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西省動(dòng)物疫病防控制劑工程研究中心，江西 南昌 330045）

【研究意義】豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）和豬德爾塔冠狀病毒（Porcine deltacoronavirus，PDCoV）是當(dāng)前主要的豬病毒性腹瀉病原[1]。然而，現(xiàn)有市售PEDV疫苗免疫后因抗體水平低且持續(xù)時(shí)間短而難以對豬群，特別是新生仔豬提供充足的保護(hù)。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可以改善宿主腸道菌群和免疫水平，從而達(dá)到促進(jìn)疫苗抗體水平的效果[2-3]。發(fā)掘有效促進(jìn)PEDV 和PDCoV 疫苗免疫效果的益生菌將有利于該疫苗的臨床推廣應(yīng)用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PEDV 和PDCoV 均屬于套式病毒目（Nidovirales）、冠狀病毒科（Coronaviridae），其中PEDV 為α 冠狀病毒屬（alpha coronavirus）成員，PDCoV 為δ 冠狀病毒屬（delta coronavirus）成員。2010年，高毒力的PEDV 變異株引發(fā)的腹瀉疫情迅速在全國各省市豬群暴發(fā)，甚至經(jīng)典毒株疫苗免疫過的豬群也不能幸免，PED疫情至今仍持續(xù)暴發(fā)[4]。2012年，中國香港學(xué)者首次從豬糞便樣品中檢測到PDCoV[5]。2014年，美國在爆發(fā)PED 豬群樣品中檢測并分離出PDCoV，并通過動(dòng)物試驗(yàn)證實(shí)該病毒可導(dǎo)致豬只腹瀉和死亡[6]。隨后，在中國大陸、加拿大、墨西哥、泰國、韓國及歐洲多國相繼報(bào)道PEDV 和PDCoV 引起的腹瀉疫情[7-9]。在臨床上，PEDV 和PDCoV 均可造成各年齡階段的豬只感染和腹瀉，以新生仔豬的感染和發(fā)病最為嚴(yán)重，是新生仔豬發(fā)病和死亡的主要原因。流行病學(xué)調(diào)查顯示，變異株P(guān)EDV在腹瀉樣品中的檢出率超過60%，PDCoV的檢出率也接近30%，遠(yuǎn)超過其他腹瀉相關(guān)病毒的檢出率[10-11]。盡管已有PEDV 疫苗上市使用，但以PEDV 為主要病原引起的腹瀉疫情依然持續(xù)存在，主要原因可能與疫苗激發(fā)的抗體水平較低，持續(xù)時(shí)間短有關(guān)[12]。因此，如何提高疫苗抗體水平是豬群，特別是新生仔豬抵抗PEDV 和PDCoV 感染的關(guān)鍵。益生菌（Probiotics）是指對機(jī)體有一種或多種有益作用的一類微生物，可天然存在或經(jīng)人工添加后定植于自然界、動(dòng)物和人體腸道、呼吸道、生殖道或皮膚[13]。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的作用非常廣泛，可促進(jìn)或調(diào)節(jié)環(huán)境或機(jī)體的菌群平衡，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收；抵抗外來微生物入侵，降低機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，提高免疫力等作用[14]。益生菌可通過自身產(chǎn)生分泌物、分解代謝營養(yǎng)物質(zhì)（如短鏈脂肪酸、丁酸、丙酸等）及作為抗原等發(fā)揮保護(hù)及治療機(jī)體，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，尤其是腸道免疫[15]。益生菌調(diào)節(jié)免疫主要是促進(jìn)腸道淋巴細(xì)胞生成，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和效應(yīng)B 細(xì)胞的活力，從而釋放相關(guān)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）、IL-10、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）；益生菌可促進(jìn)機(jī)體免疫球蛋白的生成，如免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）和免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）[16]。

【本研究切入點(diǎn)】研究表明，益生菌或其代謝產(chǎn)物對一些病毒疫苗具有免疫刺激和提高抗體水平及保護(hù)效果的作用[17-18]。Inatomi 等[19]發(fā)現(xiàn)飼喂芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）組成的復(fù)合益生菌可顯著提高免疫PEDV 弱毒疫苗懷孕母豬的IgA 和IgG水平，同時(shí)也可提高所產(chǎn)仔豬的出生重和成活率。Jin等[20]給斷奶仔豬飼喂乳酸桿菌（Lactobacillus）后接種傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）疫苗，發(fā)現(xiàn)可顯著提高血清中抗TGEV IgG 水平。Isolauri 等[21]發(fā)現(xiàn)在輪狀病毒疫苗中加入干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）可顯著提高特異性IgM 的細(xì)胞比例及轉(zhuǎn)變率。胡興義等[22]使用復(fù)合益生菌飼喂斷奶仔豬，發(fā)現(xiàn)可明顯提高斷奶仔豬血清中IL-6和TNF-α 水平。以上研究表明益生菌可提高疫苗的抗體水平及宿主的免疫功能。針對當(dāng)前PEDV等腹瀉病毒疫苗抗體水平低、保護(hù)力弱的問題，或許益生菌是一種值得嘗試的增效手段。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以SPF 級(jí)雌性昆明鼠為試驗(yàn)材料，擬比較單一和復(fù)合益生菌對PEDV 和PDCoV 疫苗抗體、宿主免疫因子及腸道形態(tài)、腸道菌群豐度的影響或變化，以此評(píng)估益生菌對疫苗和動(dòng)物健康的作用，為篩選對PEDV和PDCoV二聯(lián)滅活疫苗提質(zhì)增效的益生菌提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)雌性昆明鼠32 只，6～8 周齡，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（湘）2021-0002）。

1.1.2 試驗(yàn)益生菌與疫苗 復(fù)合益生菌：有效微生物（effective microorganism，EM）（2.0×109cfu/mL）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備和提供，包括乳酸菌（Lactobacillus，84.02%）、擬桿菌（Bacteroides，1.89%）等5個(gè)科28個(gè)屬的多種細(xì)菌[23]?？莶菅挎邨U菌（6.0×109cfu/mL）和乳酸桿菌（2.0×109cfu/mL）由山東寶來利來生物工程股份有限公司提供。試驗(yàn)用豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬δ 冠狀病毒（PDCoV）二聯(lián)滅活疫苗（JX01株+JGS01株）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備（滅活前PEDV、PDCoV 含量均不低于107.5TCID50/mL）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

隨機(jī)將32 只昆明鼠分成4 組，每組8 只。在試驗(yàn)第1 天和第14 天每只小鼠皮下接種PEDV-PDCoV二聯(lián)滅活疫苗（JX01株+JGS01株）0.2 mL。3組小鼠分別在試驗(yàn)第1天開始灌胃EM益生菌0.3 mL/只（EM組）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）0.3 mL/只（Bac組）和乳酸桿菌（Lactobacillus）0.3 mL/只（Lac組），第四組為飼喂基礎(chǔ)日糧的對照組（NC組）。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 組織樣品采樣和組織切片檢查 試驗(yàn)小鼠安樂死，剖檢觀察小鼠各個(gè)器官與腸道病變。每組3只小鼠采集空腸、回腸各2～3 cm，放入生理鹽水中輕輕洗去腸內(nèi)容物后，置于4%多聚甲醛固定48 h。參照夏瑩瑩等[24]的方法進(jìn)行切片制備、HE染色，參考陳燕君等[25]的方法檢測分析絨毛長度（villus height，VH）、隱窩深度（crypt depth，CD）、絨毛長度/隱窩深度值（VH/CD）。

1.3.2 抗體水平檢測 在試驗(yàn)第1，7，14，21，28 天采集所有小鼠的血液。參照彭棋等[26]方法測定小鼠血清中PEDV 和PDCoV 中和抗體，簡要方法為：將長滿單層的Vero81 細(xì)胞用胰酶消化吹后用DMEM 吹勻，按每孔3×104～5×104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長滿時(shí)用0.01 mol/L PBS（pH 值7.2）洗滌2 次。待檢血清56 ℃水浴滅活30 min，備用；在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，用含10 μg/mL 胰酶的無血清的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液將待檢血清做連續(xù)倍比稀釋。從1∶4 至1∶128，每個(gè)稀釋度做4 個(gè)重復(fù)，每孔50 μL；用含10 μg/mL 胰酶的無血清DMEM 培養(yǎng)液將病毒稀釋為200 TCID50/0.1 mL，然后加入到血清稀釋孔中，每孔50 μL，置5% CO237 ℃孵育1 h后加入已洗滌的96孔細(xì)胞板內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種4孔，每孔0.1 mL；37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱吸附1 h，吸棄接種液，同時(shí)設(shè)有血清毒性對照、病毒對照和正常細(xì)胞對照；每日觀察并記錄細(xì)胞病變（CPE）情況，96～120 h 后按Reed-Muench 法計(jì)算被檢血清中和抗體效價(jià)。PDCoV 中和抗體效價(jià)測定方法同PEDV，但測定用細(xì)胞為LLC-PK1 細(xì)胞。

1.3.3 血清免疫因子水平測定 采用液相懸浮芯片技術(shù)Luminex LabEx 多因子檢測系統(tǒng)LX-MultiDTM-10（Bio-Rad 公司）檢測EM 和NC 組小鼠血清中TNF-α、γ 干擾素（interferon γ，IFN-γ）、白介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12p70、趨化因子配體1（C-X-C motif chemokine ligand 1，CXCL1）水平，由上海樂備實(shí)優(yōu)寧維生物技術(shù)有限公司完成[27]。

1.3.4 腸道菌群組成高通量測序（1）樣品采集。分別在試驗(yàn)第1，14，28 天采集各組小鼠糞便樣品，每只小鼠采集3～4 粒糞便，置于1.5 mL EP管中，-20 ℃保存[23]。

（2）高通量測序。采集小鼠試驗(yàn)28 d糞便樣品，利用QIAamp Stool DNA Extraction Kit（Cat#51504，QIAGEN）提取DNA，由杭州谷禾信息技術(shù)有限公司采用Illumina MiSeq系統(tǒng)進(jìn)行微生物16S rRNA V4區(qū)測序。

（3）生物信息學(xué)分析。由Illumina Miseq測序得到原始數(shù)據(jù)先經(jīng)過質(zhì)量過濾再用于下游分析：Cutadapt軟件用于去除reads 中的adapter 序列并修剪reads 末端質(zhì)量小于Q20 的堿基。使用FLASH 連接Miseq Pair-end兩端Reads，并根據(jù)barcode信息進(jìn)行分樣，同時(shí)切除兩端引物和barcode，舍棄不含barcode和兩端引物的序列[28]。得到的有效序列采用QIIME 2.0分析流程進(jìn)行分析，具體流程參照宋德平等[29]方法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，小鼠血清IgG 抗體、腸絨毛長度和隱窩深度數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)對腸道菌群α 多樣性指數(shù)及腸道菌群豐度差異顯著性進(jìn)行分析。采用Graphpad 5.0 軟件進(jìn)行抗體水平數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同益生菌對豬病毒性腹瀉疫苗抗體水平的影響

在試驗(yàn)28 d 內(nèi)，無論是對照組（NC 組）還是飼喂益生菌組（Lac、EM 和Bac）小鼠血清中PEDV 和PDCoV 中和抗體水平均呈上升趨勢，第二次免疫（14 d）后出現(xiàn)了抗體水平上升的拐點(diǎn)（圖1 和圖2）。與對照組（NC）相比，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)飼喂益生菌小鼠血清中PEDV和PDCoV中和抗體水平有不同程度提高，其中EM組小鼠血清中PEDV和PDCoV中和抗體水平要明顯高于其他組。

圖1 不同益生菌對小鼠PEDV抗體水平的影響Fig.1 Effect of different probiotics on antibody titers against PEDV in mice

圖2 不同益生菌對小鼠PDCoV抗體水平的影響Fig.2 Effect of different probiotics on antibody titers against PDCoV in mice

2.2 益生菌對血清細(xì)胞因子濃度的影響

對PEDV 和PDCoV 抗體水平促進(jìn)效果最明顯的EM 添加組與對照組小鼠試驗(yàn)第28 天時(shí)血清中免疫相關(guān)細(xì)胞因子水平分析發(fā)現(xiàn)，EM 組的TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-10、CXCL1 平均濃度分別為（19.58±0.99），（3.21±0.12），（1.93±0.11），（5.60±0.46），（0.12±0.03），（2.55±0.29），（37.87±1.93）pg/mL，均極顯著高于對照組相應(yīng)因子的濃度；而IL-4、IL-12p70的濃度分別為（0.15±0.03），（2.19±0.24）pg/mL，均極顯著低于對照組相應(yīng)因子的濃度；IL-2則在EM組和對照組均無差異（表1）。

表1 EM益生菌對小鼠血液中免疫分子的影響Tab.1 Effect of EM probiotics on serum immune cytokines in mice

2.3 不同益生菌對小鼠腸道形態(tài)的影響

對空腸和回腸組織切片觀察發(fā)現(xiàn)各組腸上皮細(xì)胞形態(tài)、絨毛長度和隱窩深度存在差異（圖3）。EM 組空腸絨毛長度顯著大于其他3 組，試驗(yàn)組回腸絨毛長度均顯著大于NC 組（P＜0.05）（表2）。隱窩深度方面，NC 組空腸隱窩深度顯著大于試驗(yàn)組，而NC 組回腸隱窩深度顯著小于Lac 和Bac 組（P＜0.05）。

圖3 不同處理組小鼠空腸和回腸形態(tài)Fig.3 Morphology of jejunum and ileum in mice under different treatments

表2 不同處理對小鼠腸絨毛、隱窩深度的影響Tab.2 Effect of different treatments on intestinal villus height（VH）and crypt depth（CD）in mice

2.4 不同益生菌對小鼠腸道菌群群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 16S rRNA 高通量測序數(shù)據(jù) 本試驗(yàn)的36 個(gè)臨床樣本共產(chǎn)生了3 576 606 條pair-end 的原始讀長（raw read）序列，用QIIME 2.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過濾及嵌合體去除后獲得了3 326 988條有效讀長（clean read），平均每個(gè)樣本92 416條。將所有有效讀長與Greengenes數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)序列97%相似性進(jìn)行OTU 劃分，共被劃分為3 743 個(gè)代表性O(shè)TUs（表3）。隨著試驗(yàn)時(shí)間增加，添加益生菌小鼠腸道菌群OTU 數(shù)量增加趨勢比NC 組小鼠腸道菌群OTU 數(shù)增加趨勢更為明顯，EM 組的OTU 數(shù)量平均最高。試驗(yàn)開始時(shí)（0 d）各組小鼠腸道菌群OTU數(shù)量及alpha指數(shù)無顯著差異；14 d時(shí)，EM菌組Observed species指數(shù)與NC組相比存在顯著差異（P＜0.05），表明給小鼠人工灌喂EM 菌能夠改變其腸道內(nèi)菌群種類數(shù)量。與EM 組相比Lac組、Bac組Observed species 指數(shù)存在顯著差異，表明給小鼠人工灌喂不同菌種其腸道內(nèi)菌群種類數(shù)量也不同。28 d時(shí)，EM 組Observed species 指數(shù)與NC 組相比存在顯著差異（P＜0.05），表明給小鼠人工灌喂EM菌能夠改變其腸道內(nèi)菌組成和豐度。

表3 16S rRNA高通量測序小鼠腸道菌群OTU及Alpha多樣性指數(shù)Tab.3 OTU numbers and alpha diversity indexes of mice intestinal microbiota sequenced by 16S rRNA highthroughput sequencing

2.4.2 門水平菌群分布與優(yōu)勢菌群分析 試驗(yàn)開始時(shí)（0 d）各組小鼠菌群組成無顯著差異，飼喂益生菌與對照組以及各益生菌組之間在試驗(yàn)第14 天時(shí)菌群分布和豐度存在差異。各組小鼠從試驗(yàn)開始至第28 天結(jié)束時(shí)腸道菌群也呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化過程，其中所有試驗(yàn)組小鼠腸道菌群中擬桿菌門細(xì)菌豐度逐漸增加而厚壁菌門細(xì)菌豐度逐漸下降的趨勢；添加益生菌組小鼠腸道放線菌門的豐度逐漸上升趨勢（圖4）。

圖4 不同益生菌對小鼠腸道門水平菌群豐度的影響Fig.4 Comparison of microbiota abundances at phylum level during the experiment

從試驗(yàn)不同階段組間腸道菌群分析發(fā)現(xiàn)，第14 天小鼠腸道菌群豐度＞1%的菌群主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線桿菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），其中80%以上菌群分布于厚壁桿菌門和擬桿菌門（表4）。Bac組與EM組、對照組，EM組與Lac組之間厚壁菌門豐度具有顯著差異（P＜0.05）；Bac 組與其他3 組，Lac 與對照組在擬桿菌門豐度具有顯著差異（P＜0.05）。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組主要菌群為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門。EM 組放線桿菌門相對豐度顯著上升，擬桿菌門相對豐度顯著下降（表5）。對照組與Bac組和EM組，EM組與Lac組在放線菌門豐度具有顯著差異，EM 組與對照組在擬桿菌門豐度具有顯著差異，Bac 組與EM 組在變形菌門豐度具有顯著差異；對照組與3個(gè)試驗(yàn)組在疣微菌門（Verrucomicrobia）豐度具有顯著差異（P＜0.05）。

表4 不同益生菌對小鼠腸道門水平下的優(yōu)勢菌群豐度的影響Tab.4 Distribution of dominant microflora at phylum level at 14 d

表5 不同益生菌對28 d小鼠腸道菌群門水平下的優(yōu)勢菌群豐度的影響Tab.5 Distribution of dominant microflora at phylum level at 28 d

2.4.3 屬水平菌群分布與優(yōu)勢菌群分析 在屬水平上，添加了益生菌組小鼠腸道的擬桿菌屬（Bacteroides）和疣微菌（Verrucomicrobia）豐度顯著低于NC 組。EM 組小鼠腸道的放線菌屬（Actinobacteria）和變形菌屬（Proteobacteria）豐度高于其他組，飼喂益生菌組的厚壁菌屬（Firmicuteria）豐度均高于對照組（表6）。

試驗(yàn)28 d時(shí)，EM 組小鼠腸道內(nèi)乳酸菌屬（Lactobacillus）和普雷沃氏菌屬（Prevotella）細(xì)菌的豐度顯著高于其他3組，EM組和Lac組的Akkermansia屬菌豐度顯著高于其他兩組（P＜0.05）（表7）。NC組的Bacteroides屬均豐度顯著高于EM 組和Lac 組，NC 組的Corynebacterium屬菌豐度顯著低于Bac 組和EM 組，Bac組和Lac組的Staphylococcus屬菌顯著高于EM組和NC組。

表7 不同益生菌對28 d小鼠腸道屬水平下的優(yōu)勢菌群豐度的影響Tab.7 Distribution of dominant microflora at genus level at 28 d

3 結(jié)論與討論

PEDV 和PDCoV 是當(dāng)前導(dǎo)致新生仔豬腹瀉和死亡的主要病原，目前用于預(yù)防PEDV 的主要手段為疫苗，但臨床上發(fā)現(xiàn)疫苗常常因抗體水平不高而導(dǎo)致保護(hù)力不足。益生菌是一種新型綠色環(huán)保添加劑，可通過定植于腸道而調(diào)節(jié)腸道微生物平衡，乃至調(diào)節(jié)動(dòng)物免疫、循環(huán)和其他組織系統(tǒng)的作用，是重要的動(dòng)物飼料添加劑，也可以作為動(dòng)物疾病防治產(chǎn)品而被廣泛使用[22]。為探索益生菌對PEDV和PDCoV疫苗的作用，本試驗(yàn)比對了復(fù)合益生菌（EM）和單種益生菌（枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌）對PEDV和PDCoV二聯(lián)滅活疫苗的抗體水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加益生菌可提升血清中兩種病毒的抗體水平，復(fù)合益生菌對抗體水平的提升效果優(yōu)于單種益生菌。有研究表明，益生菌主要影響先天免疫反應(yīng)，通過這種方式調(diào)節(jié)感染早期抗病毒炎癥反應(yīng)以及隨后的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)[30]。由此推測，本試驗(yàn)中添加益生菌可能促進(jìn)了宿主的先天性免疫和細(xì)胞、體液免疫，從而使得宿主產(chǎn)生更強(qiáng)的抗PEDV和PDCoV反應(yīng)，從而促進(jìn)了疫苗抗體的生成。

已發(fā)現(xiàn)多種特異性益生菌菌株可增強(qiáng)先天性免疫反應(yīng)，特別是吞噬活性和NK細(xì)胞殺傷活性，其中，雙歧桿菌能夠增強(qiáng)IgA 的分泌，促使小腸粘膜上的淋巴細(xì)胞的分化及增殖[30]，并激活自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，生成IL-1、IL-6、IL-12、TNF-ɑ 及IFN 等細(xì)胞因子，激活腸粘膜免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫應(yīng)答，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫力[31-32]。本試驗(yàn)中，添加了EM 益生菌的小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-5、IL-6、IL-10、KC 濃度均極顯著高于未添加組。感染性腹瀉病原體主要侵襲腸上皮細(xì)胞，可引起腸液分泌增多和吸收障礙或者炎癥[33]。益生菌可直接黏附于上皮細(xì)胞，從而在腸道黏膜表面定植，形成一道屏障，阻擋腸內(nèi)有害病原的侵入[31]。IL-6、TNF-α、內(nèi)毒素等屬于炎癥反應(yīng)類指標(biāo)，其上升提示機(jī)體處于免疫應(yīng)答狀態(tài)，研究表明，人體中大部分免疫細(xì)胞和分泌的炎癥介質(zhì)都集中在腸道中，益生菌定植于腸道內(nèi)，因此益生菌與人體免疫系統(tǒng)之間有最直接的關(guān)系[34]?；诒驹囼?yàn)結(jié)果推測益生菌的使用可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，上調(diào)了免疫相關(guān)分子，從而促進(jìn)抗體水平的提升，但其具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。大量研究表明，益生菌增強(qiáng)機(jī)體免疫的途徑主要是促進(jìn)腸道淋巴細(xì)胞生成，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞和效應(yīng)B 細(xì)胞的活力，從而促進(jìn)機(jī)體免疫球蛋白的生成，如IgM 和IgA[20,31]。部分益生菌活菌制劑已被證明具有強(qiáng)大的抗體應(yīng)答作用。Kaila 等[35]比較乳酸桿菌的活菌制劑和滅活制劑對患輪狀病毒腹瀉的作用，結(jié)果表明活菌制劑能夠提升輪狀病毒的特異性IgA抗體應(yīng)答，而滅活菌制劑不能。本研究發(fā)現(xiàn)添加益生菌14 d后單一或復(fù)合益生菌均可不同程度地提升PEDV 和PDCoV 二聯(lián)疫苗的抗體水平，與Inatomi[19]和Jin 等[20]在PEDV、TGEV 疫苗上的研究結(jié)果相似。因此，添加益生菌不僅可促進(jìn)腸道內(nèi)益生菌的定植，同時(shí)也可增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)疫苗抗體水平。

試驗(yàn)通過觀察測量各組小鼠的空腸和回腸的腸絨毛長度、隱窩深度、絨毛長度/隱窩深度值發(fā)現(xiàn)，EM組空腸絨毛長度顯著長于其他3 組；NC 組空腸絨毛長度和隱窩深度與其他3 組均有顯著差異；Bac 組回腸絨毛長度顯著長于其他3組；NC組回腸絨毛長度與其他3組均有顯著差異；NC組和EM 組隱窩深度與Lac 組與Bac 組均有顯著差異。結(jié)果表明，飼用益生菌可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的健康，這可能與益生菌可以促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，緩解腸道細(xì)胞凋亡，維持腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)完整的特性有關(guān)[15]。

病毒性腹瀉常常會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，腸道內(nèi)環(huán)境紊亂，進(jìn)而降低腸道黏膜屏障功能，容易造成繼發(fā)感染和免疫力降低。本團(tuán)隊(duì)曾比較分析感染PEDV 母豬和仔豬腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)感染PEDV 后，腸道內(nèi)菌群種類減少，益生類菌群（如乳酸桿菌、雙歧桿菌等）豐度大大降低，而致病性菌群豐度顯著上升，如產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）等[36]。本試驗(yàn)中，復(fù)合益生菌制劑組與自然恢復(fù)相比復(fù)合益生菌制劑組香濃指數(shù)值明顯上升，辛普森指數(shù)明顯下降；與正常組相比益生菌組Chao1 指數(shù)及辛普森指數(shù)無明顯差異，表明益生菌復(fù)合物制劑可明顯促進(jìn)腸道菌群失衡模型小鼠腸道菌群多樣性恢復(fù)。黃蕊蕊等[37]分析了復(fù)合益生菌粉對抗生素清除菌群小鼠腸道菌群恢復(fù)動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)益生菌組與正常組相比Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)及辛普森指數(shù)無明顯差異，添加益生菌組腸道菌群的辛普森指數(shù)與自然恢復(fù)組相比明顯上升，表明益生菌制劑可在一定程度上促進(jìn)腸道菌群失衡模型小鼠腸道菌群多樣性恢復(fù)。試驗(yàn)添加益生菌小鼠腸道菌群OTU 數(shù)量比NC 組呈增加的趨勢，EM 組的OTU 數(shù)量平均最高。試驗(yàn)前所有小鼠腸道80%以上的菌群分布于厚壁桿菌門和擬桿菌門，從第14天開始飼喂益生菌組小鼠腸道菌群組成和豐度均存在改變。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，EM 組小鼠腸道內(nèi)乳酸菌和普雷沃氏菌屬豐度顯著高于其他3 組，EM組和Lac組的Akkermansia菌屬顯著高于其他兩組。乳酸菌是一類利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸的革蘭氏陽性菌，大多數(shù)為厭氧菌。作為人類和動(dòng)物腸道的正常菌群，乳酸菌可以增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的屏障功能，誘導(dǎo)粘液蛋白和IgA的分泌，從而達(dá)到增強(qiáng)宿主天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)[38]。普雷沃氏菌是一類非運(yùn)動(dòng)的革蘭氏陰性桿菌，包括50多個(gè)不同的物種，大多數(shù)定植于口腔和腸道；該類菌主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸和琥珀酸及少量異丁酸、異戊酸和乳酸[39]。此外，普雷沃氏菌也是腸道內(nèi)重要的維生素B1（Vitamin B1，VB1）合成菌，而VB1是三羧酸循環(huán)過程中酶的輔助因子，可為初始B細(xì)胞提供能量而促進(jìn)其激活，從而有利于B細(xì)胞分化產(chǎn)生漿細(xì)胞，促進(jìn)抗體產(chǎn)生[40]。Akkermansia菌屬是一類厭氧、無運(yùn)動(dòng)的屬于疣微菌門的革蘭氏陰性菌，腸道中低豐度的Akkermansia可能表明黏液層較薄，從而導(dǎo)致腸道屏障功能減弱。該菌目前被認(rèn)為是腸道最為關(guān)鍵的益生菌種之一，在改善代謝紊亂（如肥胖、糖尿病、脂肪肝）、腸道炎癥、免疫和神經(jīng)退行性疾病等方面具有巨大的應(yīng)用前景[41]?；诒驹囼?yàn)結(jié)果中飼喂益生菌后以上3種類型菌群豐度的顯著增加，推測這些菌群可能參與了宿主腸道屏障、免疫細(xì)胞激活及降低腸道炎癥等方面具有重要作用，增加的有益菌可通過調(diào)節(jié)免疫因子的產(chǎn)生間接上調(diào)了免疫系統(tǒng)從而增強(qiáng)了疫苗抗體水平的上升。

日糧添加EM 益生菌可促進(jìn)PEDV、PDCoV 二聯(lián)滅活疫苗抗體產(chǎn)生及上調(diào)相關(guān)免疫因子，保護(hù)腸道上皮細(xì)胞形態(tài)，調(diào)節(jié)宿主腸道菌群的組成與豐度，增加乳酸菌（Lactobacillus）和普雷沃氏菌（Prevotella）等有益菌的豐度。研究結(jié)果將為提高PEDV、PDCoV疫苗免疫效果和調(diào)節(jié)宿主腸道微生物提供試驗(yàn)依據(jù)。

致謝：國家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110410008）對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！